左振宇，葉 川

(武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430081)

可控酶解蠶蛹蛋白制備抗氧化活性多肽的研究

左振宇，葉 川

(武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430081)

以脫脂、脫色后的蠶蛹蛋白粉為原料，選取堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對超聲處理后的蠶蛹蛋白溶液進(jìn)行單酶以及復(fù)合酶水解實驗，以蛋白水解度、多肽得率和水解產(chǎn)物的抗氧化活性為指標(biāo)篩選出最適單酶和最適復(fù)合酶，采用響應(yīng)面法確定可控酶解蠶蛹蛋白制備抗氧化活性多肽的最佳工藝條件為：選用堿性蛋白酶+中性蛋白酶(堿性蛋白酶∶中性蛋白酶=1.3∶1)作為最適水解酶，超聲處理(10 min，工作3 s，間歇2 s)蠶蛹蛋白溶液，pH值 7.47、固液比1∶10(g∶mL)、加酶量2.1%、水解時間2.7 h、溫度59.2 ℃。在此工藝條件下，蛋白水解度為41.73%，多肽得率為33.29%，水解產(chǎn)物的羥基自由基清除率為59.48%、超氧陰離子自由基清除率為40.57%。

蠶蛹蛋白；活性多肽；可控酶解；抗氧化活性；水解度

蠶蛹蛋白是一種優(yōu)質(zhì)全價的蛋白資源[1]，占蠶蛹干重的45%～50%[2]。它含有18種氨基酸，其中包括占氨基酸總量40%以上的8種人體必需氨基酸[3]。蛋白質(zhì)水解可以產(chǎn)生具有生物活性功能的多肽，活性多肽是含有數(shù)個到數(shù)十個氨基酸組成的具有特殊生理功能的多肽片段[4]。不僅能滿足基本的氨基酸代謝需求和為人體生長提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時還有其它重要的生理功能，如抗氧化、抗衰老等生物活性[5-6]。和蛋白質(zhì)相比，活性多肽在保持生物學(xué)活性的同時更容易被人體吸收代謝。目前，活性多肽的研究已經(jīng)成為食品行業(yè)和營養(yǎng)等相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點課題。

蛋白質(zhì)的酶促降解過程會受到諸多因素(酶種類、pH值、固液比、加酶量、水解時間、溫度、酶比例等)影響，通過控制水解條件達(dá)到可控酶解制備活性多肽的效果。作者以脫脂、脫色的蠶蛹蛋白粉為原料，以蛋白水解度、多肽得率、水解產(chǎn)物抗氧化活性為指標(biāo)，研究可控酶解蠶蛹蛋白制備抗氧化活性多肽的工藝。

1 實驗

1.1 材料與儀器

蠶蛹由湖北省農(nóng)科院蠶業(yè)研究所提供；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶，Biosharp公司；木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，Sigma公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；FA2004N型電子天平，奧豪斯國際商貿(mào)有限公司；1-14型離心機(jī)，Sigma公司；PB-10型pH計，Sartorius公司；GL-1800型干式恒溫器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；752N型紫外可見分光光度計，上海精宏公司；SB-5200DTN型超聲破碎儀，寧波新芝公司。

1.2 方法

1.2.1 單酶及復(fù)合酶的篩選

(1)單酶篩選。固定水解反應(yīng)的固液比、加酶量、水解時間、pH值、溫度，對蠶蛹蛋白溶液超聲處理后使用5種不同來源的蛋白酶進(jìn)行水解實驗。測定蛋白水解度、多肽得率以及水解產(chǎn)物的抗氧化活性，選擇水解效果最好的酶作為最適單酶體系。

(2)復(fù)合酶篩選。固定水解反應(yīng)的固液比、加酶量、水解時間、酶比例、pH值、溫度，對蠶蛹蛋白溶液超聲處理后使用不同蛋白酶組合進(jìn)行水解實驗。測定蛋白水解度、多肽得率以及水解產(chǎn)物的抗氧化活性，選擇水解效果最好的組合酶作為最適復(fù)合酶體系。

1.2.2 可控酶解工藝的確定及優(yōu)化

(1)單因素實驗。使用最適復(fù)合酶體系可控酶解蠶蛹蛋白，研究不同單因素(pH值、固液比、加酶量、水解時間、溫度、酶比例)對酶解的影響，得到酶解工藝參數(shù)。

(2)響應(yīng)面優(yōu)化。采用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析及優(yōu)化，確定可控酶解蠶蛹蛋白制備抗氧化活性多肽的工藝并對優(yōu)化工藝進(jìn)行驗證。

1.2.3 檢測方法

(1)多肽抗氧化活性檢測。選用羥基自由基清除法[7-11]和超氧陰離子自由基清除法[12-14]，通過兩種方法的相互驗證最終確定蠶蛹蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性。

(2)水解度測定。水解度是蛋白水解的一個重要指標(biāo)，在水解過程中選用甲醛滴定法[15]對水解度進(jìn)行測定。

(3)多肽得率測定。采用TCA(三氯乙酸)沉淀蛋白法測定，離心取上清液加入雙縮脲試劑測定吸光值，并輔助卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測得[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單酶篩選

將蠶蛹蛋白溶液超聲處理(功率140 W，10 min，工作3 s，間歇2 s)后，選用5種蛋白酶進(jìn)行水解實驗。設(shè)置水解反應(yīng)固液比1∶20(g∶mL，下同)，水解時間3 h，加酶量3%，pH值和溫度在各酶的最適pH值和最適溫度下進(jìn)行。測定蠶蛹蛋白水解度、多肽得率以及水解產(chǎn)物的抗氧化活性，結(jié)果如表1所示。

表1 5種單酶水解蠶蛹蛋白的效果/%

Tab.1 The effect of 5 kinds of single enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein/%

由表1可知，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶對蠶蛹蛋白的水解效果較好，而木瓜蛋白酶、胃蛋白酶對蠶蛹蛋白的水解效果較差。同時堿性蛋白酶、中性蛋白酶水解蠶蛹蛋白多肽得率較高，水解產(chǎn)物也具有較強(qiáng)的抗氧化活性；而胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶水解蠶蛹蛋白多肽得率較堿性蛋白酶、中性蛋白酶的低，水解產(chǎn)物的抗氧化活性也較差。綜上，單酶水解蠶蛹蛋白效果最好的為堿性蛋白酶。

2.2 復(fù)合酶篩選

以堿性蛋白酶為基礎(chǔ)，將其它4種酶與堿性蛋白酶組合，對蠶蛹蛋白溶液超聲處理(功率140 W，10 min，工作3 s，間歇2 s)后，進(jìn)行復(fù)合酶水解實驗，設(shè)置水解反應(yīng)固液比1∶20，水解時間3 h，加酶量3%，復(fù)合酶比例1∶1，pH值和溫度在各復(fù)合酶的最適pH值平均值和最適溫度平均值下進(jìn)行。測定蠶蛹蛋白水解度、多肽得率和水解產(chǎn)物的抗氧化活性，結(jié)果如表2所示。

表2 4種復(fù)合酶水解蠶蛹蛋白的效果/%

Tab.2 The effect of 4 kinds of compound enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein/%

由表2可知,堿性蛋白酶分別和中性蛋白酶、胰蛋白酶復(fù)合水解蠶蛹蛋白的水解度較大，多肽得率和水解產(chǎn)物的抗氧化活性很高，而和木瓜蛋白酶、胃蛋白酶復(fù)合水解蠶蛹蛋白的水解度、多肽得率、水解產(chǎn)物的抗氧化活性都相對較低。綜合比較，選擇堿性蛋白酶+中性蛋白酶作為最適復(fù)合酶體系。

2.3 復(fù)合酶水解單因素實驗

初始反應(yīng)條件為:pH值 7.65、固液比1∶20、加酶量3%、水解時間3 h、溫度51 ℃、酶比例(堿性蛋白酶∶中性蛋白酶，下同)1∶1，每個單因素最佳值被確定后會固定到后續(xù)單因素實驗中，結(jié)果如圖1所示。

圖1 各因素對復(fù)合酶水解蠶蛹蛋白產(chǎn)物的抗氧化活性的影響Fig.1 The effect of various factors on the antioxidant activity of hydrolysis products of silkworm pupa protein by compound enzyme

由圖1a可知，水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨著pH值的增大而增強(qiáng)，在7.5左右達(dá)到最大值，超過7.5以后隨著pH值的增大而減弱；由圖1b可知，水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨著固液比的減小而減弱，綜合考慮，固液比1∶10較為適宜；由圖1c可知，水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨著加酶量的增大而增強(qiáng)，在2%左右達(dá)到最大值，超過2%以后隨著加酶量的增大而減弱；由圖1d可知，水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨著水解時間的延長而增強(qiáng)，在3 h左右達(dá)到最大值，超過3 h以后隨著水解時間的延長而減弱；由圖1e可知，水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨著溫度的升高而增強(qiáng)，在60 ℃左右達(dá)到最大值，超過60 ℃以后隨著溫度的升高而減弱；由圖1f可知，水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨著堿性蛋白酶比例的減小而增大，在酶比例為1∶1左右達(dá)到最大值，隨著堿性蛋白酶比例的繼續(xù)減小水解產(chǎn)物的抗氧化活性減弱。

由圖1結(jié)果初步確定最佳復(fù)合酶水解工藝參數(shù)分別為：pH值7.5，固液比1∶10，加酶量2%，水解時間3 h，溫度60 ℃，酶比例1∶1。

2.4 響應(yīng)面實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計原理，以自由基清除率為響應(yīng)值，選取pH值(A)、加酶量(B)、水解時間(C)、溫度(D)、酶比例(E)進(jìn)行5因素3水平的響應(yīng)面實驗，結(jié)果如表3所示。

表3 復(fù)合酶水解蠶蛹蛋白的響應(yīng)面實驗結(jié)果

Tab.3 The response surface experiment results of compound enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein

2.4.1 對羥基自由基清除率的分析

對羥基自由基清除率進(jìn)行了響應(yīng)面回歸模型的方差分析，見表4。

表4 羥基自由基清除率的響應(yīng)面回歸模型的方差分析

Tab.4 Variance analysis of the response surface regression model of scavenging rate of hydroxyl free radical

使用Design-Expert 8.0.6分析統(tǒng)計軟件進(jìn)行回歸擬合分析，得到pH值(A)、加酶量(B)、水解時間(C)、溫度(D)、酶比例(E)之間的響應(yīng)面回歸模型為：羥基自由基清除率(%)=60.12683+0.239312A+2.482313B+1.062C-0.39144D+0.306313E+0.0845AB+0.20025AC-0.20225AD-0.13125AE-0.19275BC-0.4765BD-0.3465BE+0.3215CD-0.1135CE-2.229DE-3.64263A2-7.77146B2-4.09671C2-3.31963D2-5.64029E2。

分析統(tǒng)計軟件獲得pH值、加酶量、水解時間、溫度、酶比例相互之間的響應(yīng)曲面，部分因素相互之間的響應(yīng)曲面三維圖形見圖2。

從表4和圖2 可以看出,B、C、DE、A2、B2、C2、D2、E2對羥基自由基清除率的影響極顯著(P<0.01)，其它各項對羥基自由基清除率的影響不顯著(P>0.05)，各因素對羥基自由基清除率的影響大小順序為：加酶量>水解時間>溫度>酶比例>pH值。該模型回歸性極顯著(P<0.0001)，失擬項P=0.3983，差異不顯著，說明該模型擬合精確、可信，可用于預(yù)測、分析復(fù)合酶水解蠶蛹蛋白的水解產(chǎn)物對羥基自由基清除率的影響。

圖2 各因素對羥基自由基清除率的響應(yīng)曲面Fig.2 The response surface between various factors on the scavenging rate of hydroxyl radical

2.4.2 對超氧陰離子自由基清除率的分析

對超氧陰離子自由基清除率進(jìn)行了響應(yīng)面回歸模型的方差分析，見表5。

表5 超氧陰離子自由基清除率的響應(yīng)面回歸模型的方差分析

Tab.5 Variance analysis of the response surface regression model of scavenging rate of superoxide anion free radical

使用Design-Expert 8.0.6分析統(tǒng)計軟件進(jìn)行回歸擬合分析，得到pH值(A)、加酶量(B)、水解時間(C)、溫度(D)、酶比例(E)之間的響應(yīng)面回歸模型為：超氧陰離子自由基清除率(%)=40.39733-1.51813A+0.884875B+1.079313C-1.4945D+0.708938E-0.707AB-0.04375AC+0.46525AD+0.772AE-0.1195BC+0.4815BD-1.076BE-0.39525CD+0.18025CE+0.215DE-3.75108A2-6.55242B2-4.25633C2-3.59108D2-2.88667E2。分析統(tǒng)計軟件獲得pH值、加酶量、水解時間、溫度、酶比例相互之間的響應(yīng)曲面，部分因素相互之間的響應(yīng)曲面三維圖形見圖3。

從表5和圖3可以看出，A、B、C、D、E、A2、B2、C2、D2、E2對超氧陰離子自由基清除率的影響極顯著(P<0.01)外，BE對超氧陰離子自由基清除率的影響顯著(P<0.05)，其它各項對超氧陰離子自由基清除率的影響不顯著(P>0.05)，各因素對超氧陰離子自由基清除率的影響大小順序為：pH值>溫度>水解時間>加酶量>酶比例。該模型回歸性極顯著(P<0.0001)，失擬項P=0.1651，差異不顯著，說明該模型擬合精確、可信，可用于預(yù)測、分析復(fù)合酶水解蠶蛹蛋白的水解產(chǎn)物對超氧陰離子自由基清除率的影響。

圖3 各因素對超氧陰離子自由基清除率的響應(yīng)曲面Fig.3 The response surface between various factors on the scavenging rate of superoxide anion free radical

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件及水解效果驗證

通過響應(yīng)面分析和預(yù)測，得到復(fù)合酶水解蠶蛹蛋白的優(yōu)化工藝條件為：采用堿性蛋白酶+中性蛋白酶復(fù)合酶，pH值 7.47，固液比1∶10，加酶量2.1%，水解時間2.7 h，溫度59.2 ℃，酶比例(堿性蛋白酶∶中性蛋白酶)1.3∶1，在該工藝條件下預(yù)測羥基自由基清除率為60.30%，超氧陰離子自由基清除率為40.78%。

為了驗證優(yōu)化工藝條件的可靠性，進(jìn)行了驗證實驗，結(jié)果為蛋白水解度41.73%，多肽得率33.29%，水解產(chǎn)物的羥基自由基清除率59.48%、超氧陰離子自由基清除率40.57%。結(jié)果顯示實測值和預(yù)測值相差不大，證明實驗?zāi)Ｐ陀行?、可信，可用于指?dǎo)蠶蛹蛋白可控酶解制備抗氧化活性多肽。

3 結(jié)論

對蠶蛹蛋白進(jìn)行了單酶和復(fù)合酶水解實驗，確定了可控酶解蠶蛹蛋白制備抗氧化活性多肽的最佳工藝條件為：采用堿性蛋白酶+中性蛋白酶復(fù)合酶，pH值 7.47，固液比1∶10，加酶量2.1%，水解時間2.7 h，溫度59.2 ℃，酶比例(堿性蛋白酶∶中性蛋白酶)1.3∶1。在此工藝條件下，蠶蛹蛋白水解度為41.73%，多肽得率為33.29%，水解產(chǎn)物的羥基自由基清除率為59.48%、超氧陰離子自由基清除率為40.57%。該抗氧化活性多肽生產(chǎn)工藝操作簡單，條件溫和，對蠶蛹蛋白水解情況好，抗氧化活性多肽得率較高，酶解程度可控。本研究可為蠶蛹蛋白的深加工和綜合利用提供有效借鑒。

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Optimization of Controllable Enzymatic Hydrolysis Conditions for Preparation of Antioxidant Active Polypeptide from Silkworm Pupa Protein

ZUO Zhen-yu，YE Chuan

(CollegeofChemistryandChemicalEngineering，WuhanUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430081，China)

Inthisstudy,usingdefattedanddecoloredsilkwormpupaproteinpowderasrawmaterials,theenzymatichydrolysisoftheproteinbydifferentsourcesofsingleenzyme(alkalineprotease,trypsin,neutralprotease,papain,pepsin)andcompoundenzymewasinvestigatedbyconsideringcomprehensiveindexofproteinhydrolysisdegree,polypeptideyield,andantioxidantactivityofhydrolysisproducttodeterminethemostsuitablesingleenzymeandcompoundenzyme.Theoptimalconditionsofpreparingantioxidantactivepolypeptidebycontrollableenzymatichydrolysisofsilkwormpupaproteinwereasfollowsbyaresponsesurfacemethodology:compoundenzymes(alkalineprotease∶neutralprotease=1.3∶1)weretheoptimalhydrolysisenzymes,silkwormpupaproteinpowderwastreatedbyultrasonic(10min,on3s,off2s),andhydrolyzedat59.2 ℃for2.7hwithpHvalue7.47,solid-liquidratio1∶10(g∶mL),enzymedosage2.1%.Undertheseconditions,theproteinhydrolysisdegreewas41.73%,thepolypeptideyieldwas33.29%,andthescavengingratesofhydroxylfreeradicalandsuperoxideanionfreeradicalofhydrolysisproductswere59.48%and40.57%,respectively.

silkwormpupaprotein;activepolypeptide;controllableenzymatichydrolysis;antioxidantactivity;hydrolysisdegree

湖北省自然科學(xué)基金資助項目(2014CFB802)

Q 556.9

A

1672-5425(2017)01-0032-07

左振宇，葉川.可控酶解蠶蛹蛋白制備抗氧化活性多肽的研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(1)：32-38,65.