孫 卉，苑榮爽，李 賀，張宇航，師繼超，陳建光，王春梅*

五味子、黃芪混合多糖的提取及對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用

孫 卉，苑榮爽，李 賀，張宇航，師繼超，陳建光，王春梅*

（北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013）

目的：優(yōu)化五味子、黃芪混合多糖的提取工藝，并探討其對(duì)急性酒精所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用。方法：采用正交試驗(yàn)優(yōu)化水提醇沉法提取五味子、黃芪混合多糖，將40只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（CON）和空白對(duì)照＋五味子黃芪多糖治療組（CON＋SAP）、肝損傷模型組（MOD）、肝損傷模型＋五味子黃芪多糖治療組（MOD＋SAP）。SAP組小鼠每日灌胃給予五味子黃芪混合多糖100 mg/kg，CON組和MOD組給予同體積蒸餾水，連續(xù)30 d。末次給藥后1 h，MOD組和MOD＋SAP組小鼠灌胃給予50%酒精12 mL/kg，CON組和CON＋SAP組灌胃給予同體積蒸餾水。16 h后取血與肝臟，計(jì)算各組小鼠的肝臟指數(shù)，測(cè)定小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）的水平，并測(cè)定肝組織中的甘油三酯（triglyceride，TG）、微量還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量，蘇木精-伊紅染色法觀(guān)察肝臟病理學(xué)變化。結(jié)果：五味子、黃芪混合多糖最佳提取工藝為料液比1∶45（g/mL）、提取時(shí)間3 h、提取溫度100℃；與酒精性肝損傷模型組比較，五味子、黃芪混合多糖可降低小鼠肝臟指數(shù)（P＜0.05），降低血清中ALT和AST水平（P＜0.05），升高肝組織GSH含量（P＜0.01），并顯著降低肝組織MDA和TG含量（P＜0.05），改善肝臟病理學(xué)變化。結(jié)論：五味子、黃芪混合多糖對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

五味子；黃芪；多糖；急性酒精性肝損傷

長(zhǎng)期飲酒容易引起酒精性肝病，嚴(yán)重危害身體健康[1]。常見(jiàn)的保肝藥有很多種類(lèi)，中草藥中的五味子作為傳統(tǒng)保肝藥，具有降酶、促進(jìn)肝再生、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、利膽、抗疲勞和增強(qiáng)免疫功能等作用[2-3]。目前的研究多集中在五味子木脂素類(lèi)成分，而多糖是從五味子干燥成熟果實(shí)中提取出來(lái)的含有五味子總多糖的混合物[4]，在五味子中高達(dá)20%[5]。研究表明，五味子多糖藥理活性強(qiáng)、毒性低，在護(hù)肝降酶、提高免疫、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤等方面具有顯著的作用和廣泛的應(yīng)用前景[6-10]。黃芪的藥用歷史悠久，應(yīng)用廣泛，多糖為其主要藥效成分，具有提高人體免疫功能、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性、雙向調(diào)節(jié)血糖等作用[11]。有藥理研究表明，黃芪多糖具有明顯的減輕酒精性肝損傷作用[12]。本研究在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，通過(guò)五味子的滋腎斂陰，黃芪的補(bǔ)氣健脾，研究?jī)伤幓旌隙嗵堑奶崛」に囈约皩?duì)急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用，為進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

五味子 吉林省集安五味子種植基地；中藥飲片黃芪（批號(hào)20140701-1） 河北祁新中藥顆粒飲片有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT，批號(hào)20150724）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，A S T，批號(hào)2 0 1 5 0 6 2 5）、微量還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH，批號(hào)20150723）及甘油三酯（triglyceride，TG，批號(hào)20150728）4 種測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào) 20150726） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

清潔級(jí)健康ICR小白鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，由長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)為SCXK-（吉）2012-0005，合格證號(hào)為0007195。實(shí)驗(yàn)室條件：室溫20～25℃，分籠飼養(yǎng)，飼料充足，飲水不限，適應(yīng)環(huán)境5 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；KDM調(diào)溫電熱套 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；Eppendorf AG小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)、721B 型分光光度計(jì)上海第三分析儀器廠(chǎng)；Inf nite M200酶標(biāo)儀 瑞士Tecan集團(tuán)公司。

1.3 方法

1.3.1 五味子、黃芪混合多糖提取工藝

取五味子、黃芪藥材→粉碎→水提取→抽濾→濃縮→醇沉→干燥→稱(chēng)質(zhì)量得粗多糖→溶解→稀釋→苯酚-濃硫酸法測(cè)定含量→計(jì)算多糖質(zhì)量濃度

1.3.2 單因素試驗(yàn)

多糖提取工藝中涉及3 個(gè)關(guān)鍵條件即料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL））、提取溫度（70、80、90、100℃）、提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h），因此本研究針對(duì)這3 個(gè)條件分別做單因素試驗(yàn)。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)資料，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table1 Factors and their levels used in orthogonal array design

1.3.4 多糖提取率及含量測(cè)定

五味子、黃芪樣品質(zhì)量的比例為1∶3，多糖提取率計(jì)算如式（1）所示：

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 mg無(wú)水葡萄糖稀釋到5 mL，再取0.5 mL稀釋到10 mL制成0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL補(bǔ)水至2 mL，加1.0 mL 5%苯酚溶液，混勻，加入5 mL濃硫酸，充分振搖2 min，80℃水浴15 min，冷卻，488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程：y=15.076x＋0.465（R2=0.998 8），以此曲線(xiàn)測(cè)定并計(jì)算所提粗多糖中的多糖含量。

1.3.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與處理

40只小鼠隨機(jī)分成4 組，分別為空白對(duì)照組（CON）、空白對(duì)照＋五味子黃芪多糖治療組（CON＋SAP）、酒精性肝損傷模型組（MOD）、肝損傷模型＋五味子黃芪多糖治療組（MOD＋SAP）。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。CON＋SAP組和MOD＋SAP組小鼠每日灌胃給予五味子黃芪混合多糖100 mg/kg，CON組和MOD組每天灌胃給予同體積蒸餾水，連續(xù)30 d。末次給藥1 h后，MOD組和MOD＋SAP組小鼠分別灌胃給予50%酒精12 mL/kg，CON組和CON＋SAP組給予同體積蒸餾水，禁食，不禁水。16 h后，各組小鼠分別摘眼球取血，分離血清，分裝入EP管，－80℃凍存。斷髓處死小鼠，迅速剖腹取出肝臟，于冷的生理鹽水中洗凈血液，濾紙吸干，稱(chēng)取肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)，如式（2）所示。剪下肝左葉置于10%甲醛溶液中固定，待做肝病理檢查。取肝組織加入9倍量的生理鹽水于冰水浴中制成組織勻漿，離心后取上清液，凍存。采用酶法測(cè)定血清中AST、ALT水平及肝組織中的GSH、TG、MDA含量，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)五味子、黃芪混合多糖提取率的影響

圖1 料液比對(duì)混合多糖提取率的影響Fig. 1 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of SAP

分別選取料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），提取溫度90℃，提取時(shí)間2 h進(jìn)行浸提，抽濾，75%醇沉，干燥，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算提取率，觀(guān)察料液比對(duì)浸提效果的影響。由圖1可知，五味子、黃芪混合多糖的提取率隨溶劑用量的增大而增加，當(dāng)料液比在1∶40之后時(shí)，提取率下降，因此選取料液比為1∶40較為合適。

圖2 提取時(shí)間對(duì)混合多糖提取率的影響Fig. 2 Effect of extraction time on the yield of SAP

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)五味子和黃芪混合多糖提取率的影響分別選取時(shí)間1、2、3、4、5 h，提取溫度為90 ℃，料液比1∶40（g/mL），進(jìn)行浸提，抽濾，75%醇沉，干燥，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算提取率，觀(guān)察提取時(shí)間對(duì)浸提效果的影響。如圖2所示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，混合多糖提取率增加，4 h后增加趨于平緩，因此選擇最佳提取時(shí)間為4 h。

2.1.3 提取溫度對(duì)五味子和黃芪混合多糖提取率的影響

圖3 提取溫度對(duì)混合多糖提取率的影響Fig. 3 Effect of temperature on the yield of SAP

分別選取溫度70、80、90、100 ℃，料液比1∶40（g/mL），時(shí)間4 h，觀(guān)察溫度對(duì)浸提效果的影響。如圖3所示，隨著溫度的升高，多糖提取率增加，因此確定最佳提取溫度為100 ℃。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度100 ℃、提取時(shí)間4 h與料液比1∶40（g/mL）3 個(gè)因素的較優(yōu)水平，按L9（33）設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

由表3可知，3 個(gè)因素對(duì)多糖含量的影響順序?yàn)樘崛囟龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間，方差分析結(jié)果表明，料液比與提取溫度對(duì)提取的多糖含量有一定的影響，提取時(shí)間的影響不顯著。綜合考慮，選取的最佳工藝條件為A3B1C2，即料液比1∶45、提取時(shí)間3 h、提取溫度100 ℃。

表2 五味子、黃芪混合多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 Orthogonal array design with experimental results

表3 方差分析Table3 Analysis of variance

2.3 五味子、黃芪混合多糖對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的影響

2.3.1 各組小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)

表4 各組小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)（x±s，n＝1100）Table4 Body weights and liver indexes of mice in different groups (x ± s,, n = 1100))

由表4可知，與CON組比較，MOD組小鼠體質(zhì)量未見(jiàn)明顯變化，而肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)均明顯增大，差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明灌胃給予50%酒精后對(duì)小鼠肝組織造成了損傷，引起肝組織水腫。與MOD組相比，MOD＋SAP組小鼠的體質(zhì)量無(wú)明顯差異，而肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)均有所下降。五味子黃芪多糖對(duì)正常小鼠體質(zhì)量及肝臟質(zhì)量均無(wú)明顯影響。

2.3.2 各組小鼠血清中ALT和AST水平

由表5可知，與CON組比較，模型組小鼠血清AST和 ALT水平均顯著增高（P＜0.05或P＜0.01），說(shuō)明小鼠一次性灌胃50%酒精可引起小鼠肝細(xì)胞損傷。與MOD組比較，MOD＋SAP組小鼠血清中ALT、AST水平均顯著下降（P＜0.05），提示其對(duì)酒精誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有一定的保護(hù)作用。而五味子黃芪多糖對(duì)正常小鼠血清中ALT和AST水平均無(wú)明顯影響。

表5 各組小鼠血清中ALT和AST水平（x±s，n＝1100）Table5 Activities of serum ALT and AST in different groups (x ± s,, n = 1100))

2.3.3 各組小鼠肝組織中GSH、MDA和TG的含量

表6 各組小鼠肝組織中GSH、MDA和TG的含量（x±s，n＝1100）Table6 Levels of GSH,TG and MDA in liver tissue in different groups (x ± s,, n = 1100))

由表6可知，與CON組比較，MOD組小鼠肝組織中GSH水平顯著降低（P＜0.05）、MDA和TG含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），表明酒精致肝損傷小鼠肝臟抗氧化能力降低，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，肝組織中脂質(zhì)含量增加。與MOD組比較，MOD＋SAP 組小鼠肝組織中GSH含量明顯升高（P＜0.01），MDA和TG含量均有顯著性降低（P＜0.05），提示小鼠肝臟的氧化應(yīng)激狀況得以改善，脂類(lèi)物質(zhì)含量下降。而五味子黃芪多糖對(duì)正常小鼠肝組織中GSH、MDA和TG含量水平均無(wú)明顯影響。

2.3.4 各組小鼠肝組織病理形態(tài)變化

圖4 各組小鼠肝組織病理形態(tài)（蘇木精-伊紅染色，×200）Fig. 4 Liver pathomorphology in different groups (HE staining, × 200)

由光學(xué)顯微鏡結(jié)果顯示，CON組小鼠的肝細(xì)胞排列整齊，大小正常，細(xì)胞核大而圓，核質(zhì)均勻分布，無(wú)水腫、變性、壞死、無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象（圖4A）。MOD組小鼠肝組織中肝索排列不規(guī)則，整個(gè)肝細(xì)胞胞漿疏松化，表明小鼠急性酒精性肝損傷模型建立成功（圖4C）。MOD＋SAP組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，整個(gè)肝細(xì)胞胞漿疏松化明顯減輕，表明五味子黃芪多糖對(duì)小鼠酒精性肝損傷預(yù)防治療有效（圖4D）。

3 討 論

五味子為木蘭科植物五味子的果實(shí)，傳統(tǒng)中醫(yī)理論研究表明五味子具有益氣生津、補(bǔ)腎養(yǎng)心、收斂固澀之功效，實(shí)驗(yàn)證明五味子能降酶護(hù)肝，可用于治療慢性肝炎[13]。黃芪具有補(bǔ)氣固表、利水消腫、脫毒生肌等功效，研究表明黃芪對(duì)中毒性肝損傷有保護(hù)作用，能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，有助于肝炎恢復(fù)[14]。兩藥合用無(wú)配伍禁忌，且可同時(shí)發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。

近年來(lái)，對(duì)植物多糖的研究越來(lái)越廣泛，其抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等多種生物活性日益受到重視[15]。多糖是五味子和黃芪的主要活性成分，然而關(guān)于兩藥的多糖成分并未得到很好的研究開(kāi)發(fā)和利用。本研究采用正交試驗(yàn)考察料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)五味子、黃芪混合多糖含量的影響并優(yōu)選出了提取工藝。經(jīng)直觀(guān)分析和方差分析確定了五味子、黃芪混合多糖最佳提取工藝為料液比1∶45、提取時(shí)間3 h、提取溫度100℃。

為了探討五味子、黃芪混合多糖對(duì)肝損傷有保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)采用50%酒精一次性灌胃建立小鼠急性酒精性肝損傷模型[16]，因AST和ALT是肝細(xì)胞內(nèi)的主要功能酶，是肝細(xì)胞損害的敏感性指標(biāo)，故小鼠血中AST和ALT水平的高低可判斷其肝細(xì)胞損傷的程度[17]。本研究MOD組小鼠血清中AST和ALT水平均高于CON組，加之病理結(jié)果顯示MOD組小鼠整個(gè)肝細(xì)胞胞漿明顯疏松化，表明小鼠急性酒精性肝損傷動(dòng)物模型制備成功，五味子、黃芪混合多糖可使肝損傷小鼠血清中AST和ALT水平明顯降低，肝細(xì)胞病理恢復(fù)正常，顯示出良好的肝損傷保護(hù)作用。

機(jī)體攝入大量酒精后，酒精經(jīng)過(guò)酶類(lèi)代謝時(shí)，產(chǎn)生大量的氧自由基，消耗很多還原性保護(hù)物質(zhì)如GSH，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致肝損傷[18-19]，因此GSH含量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素[20]，而脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物MDA[21]，可破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死[22]，MDA的含量可以反映過(guò)氧化損傷和細(xì)胞受損的程度[23-25]。本實(shí)驗(yàn)中MOD組小鼠肝組織中MDA水平升高、GSH水平降低，而五味子、黃芪混合多糖治療顯著降低了肝組織MDA水平，升高了GSH水平，對(duì)抗自由基脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，阻止肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，維持細(xì)胞質(zhì)膜的正常結(jié)構(gòu)，保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷。酒精還可以使三羧循環(huán)和脂肪酸氧化受阻從而影響脂肪代謝，致使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積，大量蓄積可能導(dǎo)致病變。本實(shí)驗(yàn)中MOD組小鼠肝組織中TG水平顯著升高，五味子、黃芪多糖治療使TG水平均顯著降低，改善了小鼠肝臟的脂肪代謝。

綜上所述，本研究通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選了五味子、黃芪混合多糖的提取工藝，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗自由基脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及改善肝臟脂質(zhì)代謝有關(guān)，這些結(jié)果為五味子、黃芪的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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Extraction of Polysaccharides from Mixed Fructus Schisandrae and Radix Astragali and Their Protective Effects on Acute Liver Injury Induced by Alcohol in Mice

SUN Hui, YUAN Rongshuang, LI He, ZHANG Yuhang, SHI Jichao, CHEN Jianguang, WANG Chunmei*
(School of Pharmacy, Beihua University, Jilin 132013, China)

Objective: This study aimed to optimize the extraction of polysaccharides from mixed Fructus Schisandrae and Radix Astragali (SAP) and to examine their protective effects on alcohol-induced acute liver injury in mice. Methods: An orthogonal array design was applied to optimize SAP extraction by water extraction and alcohol precipitation. A total of 40 mice were randomly divided equally into normal control (CON) group, CON + SAP group, liver injury model (MOD) group and MOD + SAP group. The mice in the SAP-treated groups were intragastrically administered with 100 mg/kg SAP, and those in the CON and MOD groups were administered with an equal volume of distilled water for 30 days in the same way. Fifty percent ethanol (12 mL/kg) was orally given to the mice in the MOD and MOD + SAP groups at 1 hour after the last administration, and those in the CON and CON+SAP group were given an equal volume of distilled water intragastrically. Sixteen hours later, blood and liver samples were collected for the calculation of liver indexes of the mice in each group and the detection of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) levels in serum as well as the contents of reduced glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA) and triglyceride (TG) in liver tissues. Hematoxylin-eosin staining (HE) was performed to observe pathological changes of liver tissues. Results: The optimum conditions for SAP extraction were determined as follows: solid-to-liquid ratio, 1:45; extraction time, 3 h; and temperature, 100 ℃. Compared with the alcohol-induced liver injury model, SAP significantly reduced the liver index in mice (P ＜ 0.05) and the levels of ALT and AST in serum (P ＜ 0.05), elevated the content of GSH (P ＜ 0.01), significantly reduced the contents of TG and MDA in livertissues (P ＜ 0.05), and improved the pathological changes of liver tissues. Conclusions: SAP could have a protective effect on alcohol-induced acute liver injury in mice.

Fructus Schisandrae; Radix Astragali; polysaccharide; alcohol-induced acute liver injury

10.7506/spkx1002-6630-201702043

R285.5

A

1002-6630（2017）02-0278-05

2016-03-24

吉林省科技廳醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)推進(jìn)計(jì)劃項(xiàng)目（20140311052YY）；吉林省科技廳產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟項(xiàng)目（20150309004YY）

孫卉（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閮?nèi)分泌藥理學(xué)及藥物研發(fā)。E-mail：511047902@qq.com

*通信作者：王春梅（1974—），女，教授，博士，研究方向?yàn)閮?nèi)分泌藥理學(xué)及藥物研發(fā)。E-mail：wangcm74@126.com

孫卉, 苑榮爽, 李賀, 等. 五味子、黃芪混合多糖的提取及對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 278-282. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702043. http://www.spkx.net.cn

SUN Hui, YUAN Rongshuang, LI He, et al. Extraction of polysaccharides from mixed Fructus Schisandrae and Radix Astragali and their protective effects on acute liver injury induced by alcohol in mice[J]. Food Science, 2017, 38(2): 278-282. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702043. http://www.spkx.net.cn