劉安康，盧美珍，陳慧，汪蘭，付曉燕*

(1.武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院，武漢 430205；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，武漢 430064)

雞骨泥酶解和發(fā)酵產(chǎn)物的成分分析及抗氧化活性比較

劉安康1，盧美珍1，陳慧1，汪蘭2，付曉燕1*

(1.武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院，武漢 430205；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，武漢 430064)

將雞骨泥采用蛋白酶酶解和混菌發(fā)酵處理，對(duì)原料、酶解產(chǎn)物和發(fā)酵產(chǎn)物中的活性成分進(jìn)行分析并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明：酶解和發(fā)酵處理可使雞骨泥的活性成分含量顯著提高，尤其是經(jīng)酶解-發(fā)酵聯(lián)用技術(shù)處理樣品后多肽、氨基酸態(tài)氮、總酸和呈味核苷酸二鈉的含量較酶解產(chǎn)物進(jìn)一步提高17.61%，38.93%，164.74%和32.95%?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)結(jié)果表明：相同試樣濃度下樣品對(duì)DPPH和羥基自由基的清除能力大小順序?yàn)榘l(fā)酵產(chǎn)物>酶解產(chǎn)物>原料，表明酶解-發(fā)酵技術(shù)不僅可以提高原料的利用率和風(fēng)味，還可增強(qiáng)其營(yíng)養(yǎng)保健功能。

雞骨；酶解；發(fā)酵；活性成分；抗氧化活性

我國(guó)是畜禽養(yǎng)殖及其產(chǎn)品的消費(fèi)大國(guó)，在肉類生產(chǎn)過(guò)程中，每年會(huì)產(chǎn)生近2000萬(wàn)噸的各類畜禽骨，但絕大多數(shù)骨都未得到充分利用，不僅造成巨大的浪費(fèi)，還可能導(dǎo)致環(huán)境污染[1]。研究表明：骨中所含營(yíng)養(yǎng)素非常豐富，如蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素、氨基酸、骨膠、粘多糖、生長(zhǎng)素等[2]，其營(yíng)養(yǎng)保健功能早已被人們所接受，利用畜禽骨開(kāi)發(fā)新型、天然、綠色的營(yíng)養(yǎng)食品及食品添加劑已成為新的研究熱點(diǎn)。

酶解和發(fā)酵是提高畜禽骨可利用價(jià)值的重要方法。目前常用的酶主要是蛋白酶，畜禽骨經(jīng)蛋白酶酶解后得到的產(chǎn)品具有比較高的骨膠原蛋白及鈣含量[3]。發(fā)酵過(guò)程不僅可以產(chǎn)酸，還可通過(guò)分解脂肪和蛋白質(zhì)產(chǎn)生多肽、酚及醇類風(fēng)味物質(zhì)等[4]。與單一的蛋白酶或菌株發(fā)酵水解骨蛋白相比，酶解-發(fā)酵聯(lián)用技術(shù)對(duì)骨原料的利用率更高，同時(shí)還可增強(qiáng)其營(yíng)養(yǎng)保健功能[5]。

一般來(lái)說(shuō)，雞骨中有機(jī)物占16%～33%，無(wú)機(jī)物占25%～26%，脂肪含量占8%～12%，水分含量占58%～62%，還有豐富的鈣、磷、鐵、鋅等微量元素[6]。我國(guó)對(duì)雞骨的開(kāi)發(fā)利用比較晚，在其產(chǎn)品的多樣性、加工工藝的優(yōu)化等方面還需進(jìn)一步改善。本研究以雞骨為原料，采用蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解處理，并在酶解基料的基礎(chǔ)上進(jìn)行微生物發(fā)酵，通過(guò)對(duì)酶解和發(fā)酵產(chǎn)物中的活性成分及抗氧化活性進(jìn)行比較，為畜禽骨的加工利用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞骨架 武漢白沙洲凍品市場(chǎng)；植物乳桿菌凍干粉、木糖葡萄球菌凍干粉和魯氏酵母凍干粉 廣東省微生物菌種保藏中心；風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶 諾維信中國(guó)生物技術(shù)有限公司；福林酚試劑、MRS培養(yǎng)基等其他化學(xué)試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL2002電子分析天平、FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DF-101S恒溫磁力攪拌器 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SPX系列生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療機(jī)械制造有限公司；SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 雞骨泥處理流程

雞骨架→去頭去尾→清洗→速凍→粉碎→酶解→混菌發(fā)酵→指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 雞骨泥酶解基料的制備

將雞骨泥解凍后，按1∶1比例取雞骨泥和水置于燒杯中，攪拌均勻，用磁力攪拌器于85 ℃下預(yù)處理0.5 h。調(diào)節(jié)溫度至50 ℃，加入酶料比為6‰的風(fēng)味蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為7.0，酶解4 h；然后加入酶料比為5‰的復(fù)合蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為7.0，酶解4 h。待反應(yīng)完成后，升溫至90 ℃滅酶0.5 h，冷卻至室溫后，去除酶解底料的大顆粒骨渣，將酶解液定容，得到產(chǎn)物即為雞骨泥酶解基料。

1.3.3 雞骨泥發(fā)酵產(chǎn)物的制備

采用混菌發(fā)酵法對(duì)雞骨泥酶解基料進(jìn)行發(fā)酵[7-9]。取30 mL的酶解基料于發(fā)酵瓶中，加入5%的氯化鈉和1%的葡萄糖，滅菌、冷卻后于超凈工作臺(tái)中接種6%的混菌發(fā)酵劑(植物乳桿菌、木糖葡萄球菌和魯氏酵母比例為1∶1∶1)，將發(fā)酵瓶放入生化培養(yǎng)箱中，于40 ℃條件下培養(yǎng)4天，即得雞骨泥發(fā)酵產(chǎn)物。

1.3.4 多肽的測(cè)定

采用福林-酚比色法[10]測(cè)多肽含量。稱取樣品2～3 g，用15%的TCA溶液溶解并定容至25 mL，混勻，靜置5 min，過(guò)濾后吸取1 mL樣液，加入福林酚試劑甲液5 mL，混勻，30 ℃下保溫10 min；然后加入福林酚試劑乙液0.5 mL，立即振蕩搖勻，30 ℃下準(zhǔn)確保溫40 min，于500 nm處測(cè)定吸光值，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多肽的含量(g/100 g)。

1.3.5 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定

稱取均勻樣品3～4 g，用適量的水溶解，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取10.00 mL，置于200 mL燒杯中，加入60 mL水，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，加入甲醛溶液10 mL，記錄pH從8.20變化至9.20時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，同時(shí)做試劑空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 總酸的測(cè)定

稱取均勻樣品3～4 g，用適量的水溶解，移入25 mL比色管中，加水至刻度，混勻后過(guò)濾，吸取濾液5 mL于200 mL錐形瓶中，加入20 mL水，滴加2滴酚酞指示劑(10 g/mL)，搖勻，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液顏色變?yōu)槲⒓t，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，同時(shí)做試劑空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 呈味核苷酸二鈉的測(cè)定

用萬(wàn)分之一天平精確稱取呈味核苷酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約0.1 g，用0.01 mol/L HCl定容至100 mL，分別配制成稀釋倍數(shù)為25，40，50，80，100的系列溶液，以0.01 mol/L HCl溶液作為空白，于250 nm處測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取樣品約1 g，用0.01 mol/L HCl定容至100 mL，過(guò)濾后于250 nm處測(cè)其吸光值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中呈味核苷酸二鈉的含量。

1.3.8 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

先將樣品進(jìn)行過(guò)濾，然后配制成不同濃度梯度，分別取不同濃度的樣品溶液3 mL，加入等體積的0.16 mmol/L DPPH自由基乙醇溶液，搖勻，避光反應(yīng)15～20 min，于517 nm 處測(cè)定試樣吸光度(Ai)。以等體積的蒸餾水代替樣品測(cè)得空白吸光度(A0)，以等體積的蒸餾水代替DPPH自由基乙醇溶液測(cè)得樣品本底吸光度(Aj)，每個(gè)樣品濃度做3個(gè)平行，按下式計(jì)算清除率：

清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%。

1.3.9 清除羥基自由基能力的測(cè)定

采用Fenton反應(yīng)，利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生羥基自由基(·OH)，在該體系中加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收。先將樣品進(jìn)行過(guò)濾，然后配制成不同濃度梯度，分別取不同濃度的樣品溶液4 mL，9 mmol/L FeSO40.5 mL，9 mmol/L水楊酸0.5 mL，8.8 mmol/L H2O20.5 mL，混勻，37 ℃水浴中加熱30 min，于510 nm處測(cè)定樣品吸光度(Ai)。以4 mL蒸餾水代替樣品測(cè)得空白吸光度(A0)，以0.5 mL蒸餾水代替8.8 mmol/L H2O2測(cè)得樣品本底吸光度(Aj)，每個(gè)樣品濃度做3個(gè)平行，按下式計(jì)算清除率：

清除率=[ A0-(Ai-Aj)]/A0×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞骨泥酶解和發(fā)酵產(chǎn)物中多肽含量的變化

圖1 雞骨泥原料、酶解和發(fā)酵產(chǎn)物中的多肽含量

由圖1可知，雞骨泥經(jīng)過(guò)酶解和發(fā)酵后，多肽的含量顯著增大(P<0.05)。原料中多肽含量?jī)H為0.13 g/100 g，而酶解產(chǎn)物中多肽含量可達(dá)5.10 g/100 g，經(jīng)混菌發(fā)酵后，多肽含量較酶解產(chǎn)物又進(jìn)一步提高了17.61%，可能是由于雞骨泥在發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)被微生物分泌的蛋白酶分解，轉(zhuǎn)化為多肽等小分子物質(zhì)。

2.2 雞骨泥酶解和發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮含量的變化

圖2 雞骨泥原料、酶解和發(fā)酵產(chǎn)物中的氨基酸態(tài)氮含量

由圖2可知，雞骨泥經(jīng)過(guò)酶解和發(fā)酵后，氨基酸態(tài)氮的含量顯著增大(P<0.05)。原料中氨基酸態(tài)氮含量?jī)H為0.03 g/100 g，而酶解產(chǎn)物和發(fā)酵產(chǎn)物中的氨基酸態(tài)氮含量分別為0.13，0.18 g/100 g，表明雞骨泥經(jīng)酶解和發(fā)酵后蛋白質(zhì)大分子被分解，以氨基酸形式存在的氮元素含量顯著提高，且發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮含量較酶解產(chǎn)物增加38.93%。

2.3 雞骨泥酶解和發(fā)酵產(chǎn)物中總酸含量的變化

圖3 雞骨泥原料、酶解和發(fā)酵產(chǎn)物中的總酸含量

由圖3可知，雞骨泥經(jīng)過(guò)酶解和發(fā)酵后，總酸含量顯著增大(P<0.05)。原料中總酸含量?jī)H為1.33 g/kg，酶解產(chǎn)物中總酸含量上升至9.35 g/kg，可能是由于雞骨泥經(jīng)酶解后游離氨基酸含量提高所致?；炀l(fā)酵后，總酸含量大幅提高，可達(dá)24.74 g/kg，主要是由于混菌發(fā)酵劑中植物乳桿菌和木糖葡萄球菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量有機(jī)酸，且與發(fā)酵時(shí)間呈正相關(guān)。

2.4 雞骨泥酶解和發(fā)酵產(chǎn)物中呈味核苷酸二鈉含量的變化

呈味核苷酸二鈉(I+G)是一種新型的高級(jí)調(diào)味劑，在食品工業(yè)中越來(lái)越受到重視[11]，可由酵母所得核酸分解、分離制得或由發(fā)酵法制取。

圖4 雞骨泥原料、酶解和發(fā)酵產(chǎn)物中的呈味核苷酸二鈉含量

由圖4可知，雞骨泥經(jīng)酶解和發(fā)酵后，I+G含量均有所提高，表明酶解和發(fā)酵產(chǎn)物的鮮味明顯增強(qiáng)，且發(fā)酵產(chǎn)物較酶解產(chǎn)物的I+G含量提高32.95%，可成為食品天然增鮮劑的良好來(lái)源。

2.5 雞骨泥酶解和發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性比較

2.5.1 清除DPPH自由基的能力

圖5 雞骨泥原料、酶解和發(fā)酵產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力

由圖5可知，隨著試樣濃度提高，3個(gè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除率均逐漸增大。相同試樣濃度下，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力略高于原料，而發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力則顯著提高，當(dāng)試樣濃度為10 mg/mL時(shí)，其清除率可達(dá)47.4%，可能是由于發(fā)酵處理后小分子短肽與氨基酸的比例增加，使其抗氧化活性得以提高。

2.5.2 清除羥基自由基的能力

圖6 雞骨泥原料、酶解和發(fā)酵產(chǎn)物清除羥基自由基的能力

由圖6可知，隨著試樣濃度提高，3個(gè)樣品對(duì)羥基自由基的清除率均逐漸增大，但其清除能力存在一定差異，相同試樣濃度下，3個(gè)樣品對(duì)羥基自由基的清除能力大小順序?yàn)榘l(fā)酵產(chǎn)物>酶解產(chǎn)物>原料，表明雞骨泥經(jīng)酶解和發(fā)酵處理后產(chǎn)生了更多的抗氧化物質(zhì)，這與清除DPPH自由基的研究結(jié)果是一致的。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)：雞骨泥經(jīng)酶解處理后，多肽、氨基酸態(tài)氮、總酸和呈味核苷酸二鈉等活性成分含量顯著提高，而酶解-發(fā)酵技術(shù)處理樣品對(duì)活性成分含量進(jìn)一步提高，可使多肽、氨基酸態(tài)氮、總酸和呈味核苷酸二鈉的含量較酶解產(chǎn)物分別提高17.61%，38.93%，164.74%和32.95%。抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：相同試樣濃度下，樣品對(duì)DPPH和羥基自由基的清除能力大小順序均為發(fā)酵產(chǎn)物>酶解產(chǎn)物>原料，可能是由于雞骨泥經(jīng)酶解和發(fā)酵處理后小分子短肽與氨基酸的比例增加，使其抗氧化活性得以提高，表明酶解-發(fā)酵技術(shù)不僅可以提高原料的利用率和風(fēng)味，還可增強(qiáng)其營(yíng)養(yǎng)保健功能。

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Comparison of Component Analysis and Antioxidant Activity of Chicken Bone Paste Processed by Enzymolysis and Fermentation

LIU An-kang1, LU Mei-zhen1, CHEN Hui1, WANG Lan2, FU Xiao-yan1*

(1.College of Food & Biology Science and Technology, Wuhan Institute of Design and Sciences, Wuhan 430205,China;2.Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear-agricultural Technology,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430064,China)

Comparison of active components and antioxidant activity of chicken bone paste processed by enzymolysis and fermentation are performed. The results show that the enzymolysis and fermentation technology could significantly increase the active components'content, especially the enzymolysis-fermentation technology. The content of polypeptide, amino acid nitrogen, total acid and flavor nucleotides disodium in the fermentation product is increased by 17.61%, 38.93%, 164.74% and 32.95% respectively compared with the enzymatic hydrolysate. The antioxidation experiment results indicate that the order of radical scavenging activity is fermentation product, enzymatic hydrolysate and raw material. The enzymolysis-fermentation technology has not only improved the raw material utilization ratio and flavor, but also enhanced its nutrition and health function.

chicken bone; enzymolysis; fermentation; active components; antioxidant activity

2016-07-12 *通訊作者

武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(201302)

付曉燕(1985-)，女，湖北武漢人，講師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.016

1000-9973(2017)01-0072-04