劉慧敏，韓延忠，郭玉明，牛 明，張雅銘，沈宏輝，王伽伯，柏兆方，肖小河

(1. 解放軍第三〇二醫(yī)院全軍中醫(yī)藥研究所&中西醫(yī)結(jié)合診療與研究中心，北京 100039；2. 承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

◇復(fù)方藥物藥理學(xué)◇

六味五靈片對刀豆蛋白A誘導(dǎo)的小鼠急性免疫性肝損傷的保護作用研究

劉慧敏1，2，韓延忠1，2，郭玉明1，牛 明1，張雅銘1，沈宏輝1，王伽伯1，柏兆方1，肖小河1

(1. 解放軍第三〇二醫(yī)院全軍中醫(yī)藥研究所&中西醫(yī)結(jié)合診療與研究中心，北京 100039；2. 承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

目的 研究六味五靈片(Liuweiwuling Tables,LWWL)對刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)誘導(dǎo)的小鼠急性免疫性肝損傷的保護作用及機制。方法 將小鼠隨機分成正常組對照組、模型組、雙環(huán)醇組(Bicyclol，39 mg·kg-1)、六味五靈片低劑量組(8 g·kg-1)、六味五靈片高劑量組(16 g·kg-1)，各給藥組每天給藥1次，連續(xù)7 d，末次給藥1 h后，除正常對照組外，其他各組尾靜脈注射ConA(15 mg·kg-1)制備小鼠急性免疫性肝損傷模型。HE染色觀察小鼠肝組織病理變化；比色法檢測小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)；實時定量RT-qPCR測定法檢測肝組織中白介素-12(IL-12)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)mRNA的表達；流式細胞術(shù)(FCM)觀察脾臟Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)細胞的變化；免疫印跡(Western blot)法檢測肝組織中Th1/Th2轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3的表達。結(jié)果 與正常對照組相比，模型組小鼠血清中ALT、AST、TBIL明顯升高，小鼠肝組織病理損傷嚴重，肝細胞大量壞死、凋亡，表明造模成功。與模型組比較，六味五靈片低、高劑量組小鼠血清中ALT、AST、TBIL的水平明顯降低；脾臟中Th1細胞減少，Th2細胞增多。肝組織中IL-12、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達下降， IL-4、IL-10的mRNA表達上升，GATA-3蛋白表達上調(diào)，T-bet蛋白表達無明顯變化。結(jié)論 六味五靈片通過調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡，保護ConA誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷。

六味五靈片; ConA; 急性免疫性肝損傷; Th1/Th2免疫平衡; 保肝; T-bet/GATA-3

目前，肝臟疾病是危害全球人類健康的主要疾病之一，急性肝損傷是其重要臨床表現(xiàn)形式之一。大量文獻報道，多種免疫細胞及相關(guān)的細胞因子參與了急性肝損傷的病理生理過程[1-2]。盡管急性肝損傷的免疫學(xué)機制復(fù)雜多變，但T淋巴細胞，特別是CD4+T細胞亞群Th1/Th2及其相關(guān)的細胞因子作為急性肝損傷炎癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素得到了國內(nèi)外專家的廣泛認可[3-5]。

六味五靈片(Liuweiwuling Tablets,LWWL)是在中醫(yī)理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論共同指導(dǎo)下，根據(jù)君臣佐使的原理組方而成，有滋腎養(yǎng)肝，活血解毒之效，在治療病毒性肝炎的臨床應(yīng)用中具有良好的保肝降酶等作用[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)[8-9]，六味五靈片可通過調(diào)節(jié)T細胞和自然殺傷細胞活化，抑制IL-2的升高，并且對LPS聯(lián)合GaLN及對乙酰氨基酚導(dǎo)致的急性肝損傷均有較好的保護作用等[10-11]。然而其對Th1/Th2免疫細胞失衡導(dǎo)致的肝損傷的保護作用至今未見報道[12-13]。因此本研究采用 ConA誘導(dǎo)的急性免疫肝損傷模型，誘導(dǎo)Th1/Th2免疫失衡，研究六味五靈片的保肝作用及機制。

1 材料

1.1 藥品與試劑 六味五靈片(由五味子、女貞子、連翹、莪術(shù)、苣荬菜、芝孢子粉組成，山東世博金都藥業(yè)有限公司，批號 150705,)；雙環(huán)醇(Bicylcol,北京協(xié)和藥廠，批號150303 )；ConA(美國Sigma公司,C2010)；生理鹽水(石家莊四藥有限公司)；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)檢測試劑盒(均購自南京建成科技有限公司)；TUNEL染色試劑盒(Roche,11684817910)；RNA保存液(北京康為世紀生物科技有限公司)，TRIzol(Life Technology),逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)試劑盒(Thermo)；TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-12、IL-10引物(上海捷瑞生物工程有限公司)；小鼠淋巴細胞分離液(達科為生物工程有限公司)，流式抗體CD8a、IFN-γ、IL-4(BD)，CD3(達科為生物技術(shù)有限公司)；Western blot抗體，GATA-3、T-bet(Abclonal Technology)。GAPDH(美國，CST)。

1.2 實驗動物 Balb/c小鼠，♂[14]，清潔級，體質(zhì)量(20±2) g，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心(合格證號SCXK-(軍)2012-0004)，飼養(yǎng)于解放軍第三O二醫(yī)院動物實驗中心。

1.3 主要儀器 SynergyH2全功能微孔板檢測儀(美國BioTek)；UV-2550紫外分光光度計(日本島津)；愛華KPJ-1A生物組織攤片烤片機(天津天利航空有限公司)；Leica 2016石蠟切片機(上海萊卡儀器有限公司)；Nikon E200光學(xué)顯微鏡；7500型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)；Cantoll流式細胞檢測儀(BD)。

2 方法

2.1 分組與給藥 將50只Balb/c小鼠隨機分為正常對照組、模型組、六味五靈片低、高劑量組、雙環(huán)醇組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，各組分別灌胃給予藥物干預(yù)：六味五靈片低劑量組8 g·kg-1、六味五靈片高劑量組16 g·kg-1、雙環(huán)醇組39 mg·kg-1，正常對照組、模型組以生理鹽水0.2 mL/10 g灌胃，每天1次，連續(xù)7 d。

2.2 模型制備 參照tiegsd等[15]的造模方法，末次給藥1 h后，除正常對照組小鼠給予相同劑量的射生理鹽水外,其余各組小鼠一次性尾靜脈注射ConA 15 mg·kg-1[16]，禁食不禁水，8 h后取材檢測。

2.3 血清ALT、AST、TBIL水平測定 造模后8h小鼠摘眼球采血，4℃，離心15 min(3000 r·min-1)，分離血清，按照試劑盒說明檢測血清中ALT、AST、TBIL水平。

2.4 肝臟病理學(xué)觀察 取相同部位的肝組織，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

2.5 脾臟淋巴細胞的分離及FACS分析 按照說明書操作步驟分離脾臟淋巴細胞，用佛波酯和離子霉素刺激[17]6 h后，分別加入CD3/CD8/IFN-γ/IL-4抗體標(biāo)記，室溫避光30 min后，加入1%的多聚甲醛固定，流式細胞儀檢測。

2.6 RT-qPCR檢測肝組織中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10 mRNA表達水平 取小鼠相同部位肝組織，加TRIzol提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參進行擴增，檢測肝組織中IFN-γ、TNF-α、IL-4 、IL-12、IL-10mRNA的表達水平。試驗操作步驟按試劑盒說明書進行。所有引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences of RT-qPCR

2.7 Western blot 檢測肝組織中GATA-3、T-bet的表達 取50mg左右的肝組織，加入0.5 mL含有cocktail的RIPA裂解液，震蕩勻漿，直至看不到明顯的懸浮物為止，超聲破碎2 s，間隔10 s，共5次，整個過程在冰上操作，靜置20 min，4℃，10 000×g，離心30min，取上清，BCA蛋白定量后用于Western blot檢測。SS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉2 h，一抗4℃過夜，TBST洗3遍，每次5 min，二抗室溫孵育2 h，TBST洗3遍，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影，使用Image J進行結(jié)果定量分析。

3 結(jié)果

3.1 六味五靈片對小鼠血清中ALT、AST、TBIL水平的影響 與正常對照組相比，模型組血清中ALT、AST、TBIL值明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，六味五靈片低、高劑量組小鼠血清中 ALT、AST值均降低，差異有顯著性(P<0.01)；六味五靈片低劑量組小鼠血清中TBIL水平降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。六味五靈片高劑量組血清中TBIL值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見Fig 1。

3.2 六味五靈片對免疫性肝損傷小鼠肝臟病理的影響 與正常組對照組相比，模型組小鼠肝組織突出表現(xiàn)為肝細胞胞質(zhì)腫脹、疏松，肝竇內(nèi)紅細胞淤積，細胞排列紊亂，肝細胞呈點狀、灶狀壞死，壞死細胞處炎性細胞浸潤，肝組織損傷嚴重。雙環(huán)醇和六味五靈片低、高劑量組肝細胞腫脹減輕，肝竇內(nèi)紅細胞減少，細胞呈放射狀排列，僅可見散在的少量細胞壞死，炎性細胞浸潤減少，肝細胞損傷程度明顯減輕。見Fig 2。

Fig 1 Effect of LWWL on serum ALT, AST and TBIL concentration

**P<0.01vsnormal；#P<0.05，##P<0.01vsmodel

3.3 六味五靈片對免疫性肝損傷小鼠脾臟Th1/Th2活化的影響 流式細胞術(shù)檢測CD4+T淋巴細胞IFN-γ、IL-4的分泌，可分別反映Th1、Th2細胞的數(shù)量。與正常對照組相比，模型組小鼠脾臟中Th1細胞增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；模型組Th2細胞增多，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，六味五靈片低、高劑量組脾臟Th1細胞均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；六味五靈片低、高劑量組Th2細胞增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中高劑量組增加更為明顯。見Fig 3。

3.4 六味五靈片對免疫性肝損傷小鼠肝組織Th1/Th2細胞因子mRNA水平的影響 IFN-γ、IL-12、TNF-α是Th1的主要細胞因子，IL-4、IL-10是Th2的主要細胞因子。與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織IFN-γ、IL-12、TNF-α表達均明顯升高(P<0.01)；IL-4、IL-10表達降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組比較，六味五靈片低、高劑量組TNF-α、IFN-γ、IL-12表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；六味五靈片低劑量組IL-4表達升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；六味五靈片高劑量組IL-4表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；六味五靈片低、高劑量組IL-10表達均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，六味五靈片低、高劑量組能明顯降低ConA引起的小鼠肝組織中Th1細胞因子表達，提高Th2細胞因子表達。見Fig 4。

3.5 六味五靈片對免疫性肝損傷小鼠肝組織Th1/Th2轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3活化的影響 Western blot結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組GATA-3蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，T-bet表達升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，六味五靈片能夠上調(diào)GATA-3蛋白表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其中高劑量組升高尤著， T-bet蛋白表達升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見Fig 5。

4 討論

肝臟是ConA體內(nèi)誘導(dǎo)毒性的主要靶器官[18]，本研究采用ConA誘導(dǎo)急性肝損傷模型來探討六味五靈片的保肝作用及其機制。結(jié)果顯示：ConA自小鼠尾靜脈注射8 h后血清ALT、AST 和TBIL明顯升高，肝組織HE染色結(jié)果顯示肝內(nèi)大量淋巴細胞浸潤，肝竇內(nèi)紅細胞淤積，肝細胞凋亡壞死區(qū)明顯。六味五靈片各劑量組能明顯降低小鼠血清ALT、AST 和TBIL水平，明顯改善肝臟的病理損傷及肝細胞凋亡狀況，初步表明六味五靈片對Con A 誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷具有保護作用。

早期研究表明ConA激活CD4+T細胞向肝組織浸潤[19]，輔助性T細胞( Th)和巨噬細胞是該模型的主要效應(yīng)細胞[20]。正常情況下，輔助性T淋巴細胞亞群Th1/Th2細胞處于平衡狀態(tài)，但機體功能異常時，Th1/Th2平衡失調(diào)向Th1或Th2狀態(tài)轉(zhuǎn)化。Th1及其細胞因子占優(yōu)勢的狀態(tài)稱Th1狀態(tài)，Th2及其細胞因子占優(yōu)勢的狀態(tài)稱為Th2狀態(tài)[21-22]。在ConA 誘導(dǎo)的肝損傷模型中，Th1型細胞因子和促炎細胞因子起主要損傷作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)[20]，Th1/Th2細胞因子的活性是相互拮抗的，其平衡和調(diào)控對免疫反應(yīng)至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，ConA造模后，Th1細胞數(shù)量及其分泌的關(guān)鍵性細胞因子IFN-γ、IL-12、TNF-α明顯增加，Th2細胞數(shù)量及其分泌的關(guān)鍵細胞因子IL-4和L-10未發(fā)生明顯變化。說明ConA誘導(dǎo)了小鼠肝臟中Th1/Th2細胞平衡失調(diào)，此時處于Th1狀態(tài)，引起了肝臟損傷，這與文獻中報道的結(jié)果一致。六味五靈片預(yù)處理后，Th1細胞及其所分泌的細胞因子明顯減少，Th2細胞及其所分泌的細胞因子明顯增加，說明六味五靈片可通過抑制ConA引起的小鼠Th1細胞比例的升高，促進Th2細胞比例的增加，從而恢復(fù)Th1/Th2細胞平衡，減輕肝臟損傷。

Fig 2 Effect of LWWL on liver pathology in mice with immunological liver injury(×100)

A：Control group；B：Model group；C：39mg·kg-1Bicyclol group；D：8 g·kg-1LWWL group；E：16 g·kg-1LWWL group

Fig 3 Effect of LWWL on activation of Th1/Th2 in spleen of mice with immunological liver injury(n=4)

**P<0.01vsnormal；#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Fig 4 Effect of LWWL on the level of Th1/Th2 cytokines mRNA in liver tissue of mice with immunological liver injury

**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel

T-bet選擇性表達于Th1細胞，是Th1細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，在Th1 細胞的分化過程中起決定性作用[24]，可反式激活I(lǐng)FN-γ的啟動子[25]；GATA-3則是Th2細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子[26]，可通過IL-4依賴的機制抑制Th1的活化[27]。T-bet/ GATA-3是從Th1/Th2細胞分化的上游控制Th1/ Th2分化的重要蛋白，T-bet/ GATA-3的平衡對Th1/ Th2平衡調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵性的作用[28]。本研究結(jié)果顯示，模型組中GATA-3蛋白表達降低，而T-bet未發(fā)生明顯的改變，相對于T-bet而言，GATA-3蛋白相對降低，此時肝臟環(huán)境處于Th1狀態(tài)，肝細胞損傷嚴重。給予六味五靈片干預(yù)后，GATA-3蛋白的表達上升，T-bet雖有所增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，此時GATA/T-bet比例上升，平衡向Th2狀態(tài)發(fā)生了轉(zhuǎn)化，因此肝臟損傷程度減輕。綜上所述，Th1及其細胞因子占優(yōu)勢，是ConA 誘導(dǎo)的肝損傷重要因素, 是肝損傷的機制之一，六味五靈片可通過作用于GATA-3蛋白，調(diào)節(jié)ConA誘導(dǎo)的Th1/Th2細胞失衡，使機體免疫趨向于平衡協(xié)調(diào)，減輕肝臟損傷，達到保肝作用。

( 致謝：本實驗在解放軍第三〇二醫(yī)院全軍中醫(yī)藥研究所&中西醫(yī)結(jié)合診療與研究中心分子生物學(xué)實驗室完成。特別感謝導(dǎo)師肖小河老師、柏兆方老師在實驗設(shè)計之初給予指導(dǎo)，感謝韓延忠?guī)熜衷诤罄m(xù)的實驗操作、論文撰寫方面給予的幫助，感謝王伽伯老師、郭玉明老師、牛明老師、張雅銘老師、沈宏輝老師在實驗過程中給予的意見和建議，以及實驗室同學(xué)們的支持，在此致以誠摯的謝意。)

Fig 5 Effect of LWWL on the activation of Th1/Th2 transcription factor T-bet/GATA-3 in liver tissues of mice with immunological liver injury

A：Control group；B：Model group；C：8 g·kg-1LWWL group；D：16 g·kg-1LWWL group.**P<0.01vsnormal；##P<0.01vsmodel

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The protection effects of Liuweiwuling Tablets against concanavalin A-induced acute immunological liver injury in mice

LIU Hui-min1,2, HAN Yan-zhong1,2, GUO Yu-ming1, NIU Ming1, ZHANG Ya-ming1, SHEN Hon-hui1, WANG Jia-bo1, BAI Zhao-fang1, XIAO Xiao-he1

(1.ChinaMilitaryInstituteofChineseMateria&IntegrativeMedicalCenter, 302MilitaryHospital,Beijing100039,China; 2.ChengdeMedicalUniversity,Chengde，Hebei067000,China)

Aim To explore the protective effects and underlying mechanisms of Liu weiwuling Tablets (LWWL) in concanavalin A (ConA) induced acute immunological liver injury in mice. Methods Mice were randomly divided into control, model, Bicyclol, LWWL low dose (8 g·kg-1)and LWWL high dose (16 g·kg-1)group. The medicattion was performed once daily for seven consecutive days, then the model of immunological liver injury was prepared by intravenous injection of ConA (15mg·kg-1)in the tail of mice in each group except for the control group one hour after the last treatment. The pathological changes of liver tissues of mice were evaluated by HE staining with, and the levels of alanine amino transferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and total bilirubin (TBIL) in serum were analyzed by colorimetric method; the level of interleukin 12 (IL-12), interferon-γ (IFN-γ), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin 4 (IL-4) and interleukin 10 (IL-10) in liver was measured by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR); the changes of Th1 (IFN-γ) and Th2 (IL-4) cells were observed by flow cytometric (FCM) analysis; the expression of Th1/Th2 transcription factor T-bet/GATA-3 in liver tissue was detected by Western blot. Results Compared with normal control group, the serum ALT, AST and TBIL were significantly increased in model group, the pathological damage of the liver tissue was severe, and the necrosis and apoptosis of hepatic cells were large, which showed that the model was successful. Compared with model group, both low and high dose of LWWL could significantly reduce ALT, AST, TBIL levels in serum induced by ConA; Th1 cells in the spleen decreased, while Th2 cells increased; the expressions of IL-12, IFN-γ and TNF-α mRNA were significantly inhibited with IL-4 and IL-10 mRNA expression elevated in mouse liver tissue; the expression of GATA-3 protein was up-regulated, T-bet protein expression showing no significant changes. Conclusion LWWL could regulate Th1/Th2 balance, thus inhibiting the acute immunity hepatic injury induced by ConA.

Liuweiwuling Tablets; concanavalin A; acute immunological liver injury; immunological balance of Th1/Th2; hepatoprotection; T-bet/GATA-3

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.046.html

2016-09-14，

2016-11-13

國家自然科學(xué)基金資助項目( No 81274026 )

劉慧敏(1989- ) , 女, 碩士生, 研究方向：臨床中藥學(xué),Tel:010-66933324, E-mail:sugg77@163.com; 肖小河(1963 - ) , 男, 博士, 研究員, 博士生導(dǎo)師, 研究方向：臨床中藥學(xué), 通訊作者, E-mail:Pharmacy@126.com; 柏兆方(1982 - ), 男, 博士, 助理研究員, 研究方向：臨床中藥學(xué), 通訊作者, E-mail: baizf2008@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.023

A

1001-1978(2017)01-0133-08

R-332；R282.71；R322.47；R392.12；R575.053.1；R593.053.1