洪開文, 賈憲生, 楊賢江, 董登祥*

(1. 安順職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用醫(yī)藥系，貴州 安順 561000; 2. 貴陽中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550001)

·研究論文·

新型常春藤皂苷元衍生物的合成及其體外抗HBV活性

洪開文1, 賈憲生2, 楊賢江2, 董登祥2*

(1. 安順職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用醫(yī)藥系，貴州 安順 561000; 2. 貴陽中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550001)

以常春藤皂苷元為原料，對其3,23-羥基和28-羧基進(jìn)行乙?；?、醚化、苯甲酰化及酯化等反應(yīng)合成了8個常春藤皂苷元衍生物(2～9)，其中6個未見文獻(xiàn)報道，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR， IR和MS表征。采用MTT法測定了2～9的體外抗HBV活性。結(jié)果表明：3～9隨濃度增大，對細(xì)胞活力的抑制率明顯增加，特別是7和9抑制率最明顯，用藥濃度為1×10-6mol·L-1時，抑制率均為9.46±0.47%。對2～9抑制Hep G2.2.15細(xì)胞表達(dá)表面抗原(HBs Ag)進(jìn)行了測試。結(jié)果表明：2～9對HBs Ag的分泌表達(dá)有一定的抑制作用。

常春藤皂苷元; 衍生物; 合成; 抗HBV活性

常春藤皂苷元(Chart 1)及其糖苷在自然界分布相對較廣，但是其在植物中的含量一般較低，而含量高的植物則相對較少。研究表明，常春藤皂苷元具有抗炎、抗抑郁及抗腫瘤等藥理作用[1-5]。孫璐[6]報道以異珠五加甲苷為原料合成了常春藤皂苷元衍生物，該類衍生物在體外對肝癌細(xì)胞有較好的抑制活性。王國華[7]設(shè)計并合成了常春藤皂苷元酰胺衍生物，首先用N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)形成活化酯，再加入3-二甲氨基丙胺進(jìn)行反應(yīng)，合成了目標(biāo)化合物N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺(HGA)，研究表明結(jié)構(gòu)改造后的化合物HGA的抗抑郁生物活性顯著提高。Martin等[8]報道合成了六個商業(yè)二糖(D-乳糖、D-纖維二糖、D-麥芽糖、D-蜜二糖、D-龍膽二糖、D-異麥芽糖)的常春藤皂苷衍生物。毛玝佳等[9]報道常春藤皂苷元在Py/Ac2O， MeI/TBAF等條件下，合成了常春藤皂苷元二乙?；苌顰、常春藤皂苷元羧基甲酯衍生物B和常春藤皂苷元乙酰化羧甲酯衍生物C。吳耀民等[10]報道將常春藤皂苷元的95%乙醇溶液分別加至NaOH和KOH的70%乙醇溶液中，用95%乙醇重結(jié)晶制得常春藤皂苷元鈉和常春藤皂苷元鉀。

Scheme 1

Chart 1

此外，貴州山銀花黃褐毛忍冬為雙子葉植物藥忍冬科植物黃褐毛忍冬(LonicerafulvotnetosaHsu et S. C. Cheng. Ms)的花蕾[11]，具有清熱解毒和疏散風(fēng)熱的功效，用于治療臃腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒及溫?zé)岚l(fā)病。在貴州分布廣，資源極其豐富，其所含化學(xué)成分有常春藤皂苷及苷元和綠原酸等[12]，為本課題研究提供大量原料。

本文設(shè)計了關(guān)于常春藤皂苷元的結(jié)構(gòu)改造途徑。以常春藤皂苷元(1)為原料，經(jīng)酯化、乙?；⒈郊柞；确磻?yīng)，合成了8個常春藤皂苷元衍生物(2～9， Scheme 1)，其中化合物3， 4， 6～9未見文獻(xiàn)報道，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR， IR和MS表征。采用MTT法測定了化合物2～9的體外抗HBV活性，進(jìn)行化合物抑制Hep G2. 2. 15細(xì)胞表達(dá)表面抗原(HBs Ag)的測試。為進(jìn)一步研究常春藤皂苷元衍生物的體內(nèi)活性打下基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

XCL-1型顯微熔點儀；1801型紫外-可見分光光度計；INOVA-400型與INOVA-500型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；WGH-30型雙光束紅外分光光度計；FINNIGANLACQ-DECA型質(zhì)譜儀。

常春藤皂苷元由貴陽中醫(yī)學(xué)院賈憲生教授提供；常春藤皂苷元對照品，純度≥99%，西安昊軒生物科技有限公司；溴化芐，化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碘甲烷，分析純，成都市科龍化工試劑有限公司；其余所用試劑均為分析純。

體外抗HBV活性實驗委托貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室藥理與活性篩選中心完成。

1.2 合成

(1) 1的提取分離

將0.5 kg粉碎黃褐毛忍冬干燥花蕾用75%乙醇回流提取3次，合并提取液，減壓回收乙醇得殘留物150 mL，加5%鹽酸，置水浴中水解3 h(TLC監(jiān)測至無皂苷斑點)。冷卻后過濾，沉淀用水洗至中性，干燥得總皂苷元14.6 g。

取總皂苷元2.0 g，用少量無水乙醇溶解，加入適量硅膠攪拌，水浴上揮干，殘渣研細(xì)，經(jīng)硅膠H柱層析[洗脫劑：氯仿/甲醇(V/V=9/1)]分離純化，合并3～7份洗脫液，回收溶劑，殘留物用甲醇結(jié)晶得白色短柱狀晶體1,收率27.5%，Rf=0.42[展開劑：A=Cy/EtOAc(V/V=1/2)]，與對照品一致, m.p.132～134 ℃;1H NMR(400 MHz)δ: 5.26(m, 1H, 12-H), 3.72(d,J=11.0 Hz, 2H, 23-H), 3.68(m, 1H, 3-H), 3.28(m, 1H, 18-H), 1.25(s, 3H, 27-H), 1.05(s, 3H, 26-H), 1.00(s, 3H, 30-H), 0.88(s, 3H, 24-H), 0.79(s, 3H, 29-H), 0.74(s, 3H, 25-H); IRν: 3 451(OH), 2 942(CH), 1 698(C=O), 1 464, 1 387, 1 303, 1 268(C—O) cm-1。以上數(shù)據(jù)與常春藤皂苷元的表征數(shù)據(jù)一致[13]，故將1鑒定為常春藤皂苷元。

(2) 2的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入1 500 mg(1.05 mmol)，碘甲烷4 mL(6.4 mmol)，氟化四丁基銨(TBAF)167 mg(0.64 mmol)， 5%NaHCO3溶液40 mL和DCM 20 mL， N2保護(hù)，攪拌下于室溫反應(yīng)24 h(TLC監(jiān)測，展開劑：A=1/1，Rf=0.52)。用DCM萃取，萃取液用無水MgSO4干燥，減壓濃縮得粗產(chǎn)物，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=2/1)純化得白色固體粉末2 490 mg,收率95.1%, m.p.144～145 ℃;1H NMR(400 MHz)δ: 5.28(m, 1H, 12-H), 3.73(d,J=10.4 Hz, 2H, 23-H), 3.64(m, 1H, 3-H), 3.62(s, 3H, OCH3), 2.85(dd,J=13.2 Hz, 3.6 Hz, 1H, 18-H), 2.56(br s, 1H, OH), 2.23(br s, 1H, OH), 1.96(m, 2H, 11-H), 1.78(m, 2H, 2-H), 1.67(m, 2H, 22-H), 1.47(m, 2H, 16-H), 1.42(m, 2H, 5, 9-H), 1.38(m, 6H, 1,6,7-H), 1.34(m, 4H, 19,21-H), 1.23(m, 2H, 15-H), 1.12(s, 3H, 27-H), 0.98(s, 3H, 26-H), 0.95(s, 3H, 30-H), 0.89(s, 3H, 24-H), 0.79(s, 3H, 29-H), 0.73(s, 3H, 25-H)。表征數(shù)據(jù)與常春藤皂苷-28-羧甲酯的數(shù)據(jù)[14]一致。

(3) 3～5的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入2 100 mg(0.21 mmol)，吡啶(Py)2 mL(0.02 mol)和醋酸酐1 mL(10.61 mmol)， N2保護(hù)，攪拌下于室溫反應(yīng)1.5 h(TLC檢測，展開劑：A=3/1)。加入1 mol·L-1鹽酸調(diào)至pH 7，用二氯甲烷萃取，萃取液用無水MgSO4干燥，減壓濃縮得粗產(chǎn)物，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=5 ∶1)純化得3～5。

3： 白色固體粉末35 mg，收率32.4%, m.p.153～155 ℃;1H NMR(400 MHz)δ: 5.28(m, 1H, 12-H), 3.82(d,J=11.2 Hz, 2H, 23-H), 3.62(s, 3H, OCH3), 3.59(m, 1H, 3-H), 2.85(dd,J=14.0 Hz, 4.4 Hz, 1H, 18-H), 2.14(s, 3H, COCH3), 2.06(m, 2H, 11-H), 1.71(m, 2H, 2-H), 1.65(m, 2H, 22-H), 1.45(m, 2H, 16-H), 1.41(m, 2H, 5,9-H), 1.39(m, 6H, 1,6,7-H), 1.35(m, 4H, 19,21-H), 1.24(m, 2H, 15-H), 1.16(s, 3H, 27-H), 0.98(s, 3H, 26-H), 0.94(s, 3H, 30-H), 0.88(s, 3H, 24-H), 0.77(s, 3H, 29-H), 0.72(s, 3H, 25-H); IRν: 3 458(OH), 2 944(CH), 2 879(CH3), 1 769(C=O), 1 720 (C=O), l 654(C=C), 1 236(C—O) cm-1; MS(ESI)m/z: 552.3{[M+Na]+}； HR-MSm/z: Calcd for C33H52O5{[M-Bn]-}437.862 6, found 437.861 9。

4： 白色固體粉末20 mg，收率18.5%, m.p.153～154 ℃;1H NMR (400 MHz)δ: 5.28(m, 1H, 12-H), 4.88(m, 1H, 3-H), 3.63(d,J=11.3 Hz, 2H, 23-H), 3.62(s, 3H, OCH3), 2.85(dd,J=15.2 Hz, 5.6 Hz, 1H, 18-H), 2.18(s, 3H, COCH3), 2.07(m, 2H, 11-H), 1.73(m, 2H, 2-H), 1.69(m, 2H, 22-H), 1.46(m, 2H, 16-H), 1.42(m, 2H, 5, 9-H), 1.37(m, 6H, 1,6,7-H), 1.33(m, 4H, 19,21-H), 1.21(m, 2H, 15-H), 1.16(s, 3H, 27-H), 0.96(s, 3H, 26-H), 0.92(s, 3H, 30-H), 0.88(s, 3H, 24-H), 0.72(s, 3H, 29-H), 0.67(s, 3H, 25-H); IRν: 3 448(OH), 2 945(CH), 2 894(—CH3), 1 760(C=O), 1 726(C=O), l 656(C=C), 1 239(C—O) cm-1; MS(ESI)m/z: 552.2{[M+Na]+}; HR-MSm/z: Calcd for C33H52O5{[M-Bn]-}437.762 5, found 437.761 8。

5： 白色固體56 mg，收率47.8%, m.p.163～164 ℃;1H NMR (400 MHz)δ: 5.28(m, 1H, 12-H), 4.78(m, 1H, 3-H), 3.69(d,J=11.6 Hz, 2H, 23-H), 3.62(s, 3H, OCH3), 2.86(dd,J=14.0 Hz, 4.4 Hz, 1H, 18-H), 2.17(s, 3H, COCH3), 2.09(s, 3H, COCH3), 1.97(m, 2H, 11-H), 1.72(m, 2H, 2-H), 1.67(m, 2H, 22-H), 1.45(m, 2H, 16-H), 1.43(m, 2H, 5,9-H), 1.36(m, 6H, 1,6,7-H), 1.34(m, 4H, 19,21-H), 1.21(m, 2H, 15-H), 1.16(s, 3H, 27-H), 0.96(s, 3H, 26-H), 0.92(s, 3H, 30-H), 0.88(s, 3H, 24-H), 0.80(s, 3H, 29-H), 0.72(s, 3H, 25-H);13C NMR (101 MHz)δ: 178.2(C28), 170.7, 171.0(2C, COCH3), 143.8(C13), 122.1(C12), 74.5(C3), 65.4(C23), 51.5(OCH3), 47.8(C9), 47.6(C5), 46.6(C17), 45.7(C19), 41.5(C4), 41.2(C14), 40.4(C18), 39.2(C8), 37.6(C1), 36.7(C10), 33.8(C21), 33.0(C29), 32.3(C22), 32.2(C7), 30.6(C20), 27.6(C15), 25.7(C27), 23.6(C2), 23.3(C11), 22.9(C30), 21.2(C1), 20.9(2C, COCH3), 17.9(C6), 16.8(C26), 15.7(C25), 13.0(C24)。以上數(shù)據(jù)與常春藤皂苷元-3,23-二-O-乙?；?28-羧甲酯的數(shù)據(jù)[14]一致，故將5鑒定為常春藤皂苷元-3,23-二-O-乙?；?28-羧甲酯。

(4) 6的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入2 80 mg(0.16 mmol)和4 ?分子篩30 mg，抽真空，N2保護(hù)，加入無水DCM 5 mL，冰浴(0 ℃)冷卻下攪拌平衡10 min；加入CH3I 1 mL(16.06 mmol)和60%NaH 59 mg(4.10 mmol)，于0 ℃反應(yīng)8 h(TLC監(jiān)測,展開劑：A=2/1，Rf=0.61)。加入適量甲醇中和過量NaH，用二氯甲烷萃取，萃取液用無水MgSO4干燥，減壓濃縮得粗產(chǎn)物，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=5/1)純化得黃白色固體粉末6 61 mg，收率74.82%, m.p.146～147 ℃;1H NMR(400 MHz)δ: 5.28(m, 1H, 12-H), 3.57(d,J=10.4 Hz, 1H, 23-H), 3.62(s, 3H, OCH3), 3.34(s, 3H, OCH3), 3.17(m, 1H, 3-H), 2.85(dd,J=14.0 Hz, 4.4 Hz, 1H, 18-H), 1.97(m, 2H, 11-H), 1.72(m, 2H, 2-H), 1.67(m, 2H, 22-H), 1.45(m, 2H, 16-H), 1.43(m, 2H, 5,9-H), 1.36(m, 6H, 1,6,7-H), 1.34(m, 4H, 19,21-H), 1.21(m, 2H, 15-H), 1.16(s, 3H, 27-H), 0.92(s, 3H, 26-H), 0.89(s, 3H, 30-H), 0.88(s, 3H, 24-H), 0.84(s, 3H, 29-H), 0.71(s, 3H, 25-H);13C NMR(101 MHz)δ: 178.2(C28), 143.6(C13), 122.2(C12), 84.0(C23), 70.0(C3), 59.4(OCH3), 51.5(OCH3), 49.2(C9), 47.6(C5), 46.6(C17), 45.8(C19), 41.8(C4), 41.6(C14), 41.3(C18), 39.2(C8), 37.9(C1), 36.8(C10), 33.8(C21), 33.0(C29), 32.4(C22), 32.3(C7), 30.6(C20), 27.6(C15), 25.8(C27), 23.6(C2), 23.3(C11), 23.0(C30), 21.2(C16), 18.1(C6), 16.8(C26), 15.6(C25), 12.0(C24); IRν: 3 426(OH), 2 945(CH), 2 845(CH3), 2 823(OCH3), 1 721(C=O), l 653(C=C), 1 232(C—O) cm-1; MS(ESI)m/z: 523.2{[M+Na]+}, HR-MSm/z: Calcd for C32H52O4{[M-Bn]-}408.762 4, found 408.761 8。

(5) 7的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入6 51 mg(0.10 mmol)， Py 2 mL(0.02 mol)， Ac2O 1 mL(10.61 mmol)和對二甲氨基吡啶(DMAP)10 mg(0.02 mmol)， N2保護(hù)，攪拌下于室溫反應(yīng)8 h(TLC監(jiān)測，展開劑：A=3/1,Rf=0.72)。加入1 mol·L-1鹽酸調(diào)至中性，用二氯甲烷萃取，萃取液用無水MgSO4干燥，減壓濃縮得粗產(chǎn)物，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=8/1)純化得淡黃白色固體7 54 mg，收率98.2%, m.p.151～152 ℃;1H NMR(400 MHz)δ: 5.28(m, 1H, 12-H), 3.69(d,J=10.2 Hz, 2H, 23-H), 3.62(s, 3H, OCH3), 3.25(s, 3H, OCH3), 3.18(m, 1H, 3-H), 2.85(dd,J=13.7 Hz, 4.4 Hz, 1H, 18-H), 2.05(s, 3H, COCH3), 1.96(m, 2H, 11-H), 1.71(m, 2H, 2-H), 1.66(m, 2H, 22-H), 1.46(m, 2H, 16-H), 1.44(m, 2H, 5,9-H), 1.37(m, 6H, 1,6,7-H), 1.34(m, 4H, 19,21-H), 1.21(m, 2H, 15-H), 1.12(s, 3H, 27-H), 0.92(s, 3H, 26-H), 0.89(s, 3H, 30-H), 0.88(s, 3H, 24-H), 0.84(s, 3H, 29-H), 0.71(s, 3H, 25-H);13C NMR(101 MHz)δ: 178.2(C28), 170.5(COCH3), 143.7(C13), 122.2(C12), 81.3(C3), 75.0(C23), 59.0(OCH3), 51.4(OCH3), 47.9(C9), 47.3(C5), 46.6(C17), 45.7(C19), 41.6(C4), 41.4(C14), 41.2(C18), 39.1(C8), 37.6(C1), 36.8(C10), 33.7(C21), 33.0(C29), 32.3(C22), 32.1(C7), 30.6(C20), 27.6(C15), 25.7(C27), 23.5(C2), 23.3(C11), 23.0 (C30), 21.2 (C16), 20.9(COCH3), 17.7(C6), 16.7(C26), 15.6 (C25), 13.3(C24); IRν: 2 924(CH), 2 893(CH3), 2 826(OCH3), 1 768(C=O), 1 721(C=O), l 645(C=C), 1 238(C—O) cm-1; MS(ESI)m/z: 565.3{[M+Na]+}; HR-MSm/z: Calcd for C34H54O5{[M-Bn]-}450.862 3, found 450.861 7。

(6) 8的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入2 100 mg(0.21 mmol)和4 ?分子篩30 mg，抽真空，N2保護(hù)，加入無水DCM 5 mL，于0 ℃冰浴冷卻下攪拌平衡10 min；加入溴化芐1 mL(8.42 mmol)和60%NaH 69 mg(4.79 mmol)，升至室溫，反應(yīng)8 h(TLC監(jiān)測，展開劑：A=2/1，Rf=0.64)。加入適量甲醇中和過量NaH，用DCM萃取，萃取液用無水MgSO4干燥，減壓濃縮得粗產(chǎn)物，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=5/1)純化得淡黃白色固體8 102 mg，收率86.4%, m.p.221～223 ℃;1H NMR(400 MHz)δ: 7.28～7.35(m, 5H, PhH), 5.28(m, 1H, 12-H), 4.65(d,J=12.0 Hz, 1H, PhCH2), 4.37(d,J=12.0 Hz, 1H, PhCH2), 3.66(d,J=11.2 Hz, 2H, 23-H), 3.62(s, 3H, OCH3), 3.22(m, 1H, 3-H), 2.86(d,J=13.6 Hz, 1H, 18-H), 2.05(m, 2H, 11-H), 1.72(m, 2H, 2-H), 1.67(m, 2H, 22-H), 1.44(m, 2H, 16-H), 1.43(m, 2H, 5,9-H), 1.37(m, 6H, 1,6,7-H), 1.34(m, 4H, 19,21-H), 1.24(m, 2H, 15-H), 1.14(s, 3H, 27-H), 1.12(s, 3H, 26-H), 0.89(s, 3H, 30-H), 0.88(s, 3H, 24-H), 0.84(s, 3H, 29-H), 0.72(s, 3H, 25-H);13C NMR(101 MHz)δ: 178.2(C28), 143.5(C13), 139.3(C1′, Ph), 128.3(C3′，5′, Ph), 127.6(C2′,6′, Ph), 127.3(C4′, Ph), 122.2(C12), 81.5(PhCH2), 70.6(C3), 68.2(C23), 51.5(OCH3), 48.4(C9), 47.5(C5), 46.6(C17), 45.8(C19), 42.1(C4), 41.3(C14), 41.1(C18), 39.2(C8), 37.8(C1), 36.8(C10), 33.8(C21), 33.2(C29), 32.6 (C22), 32.3(C7), 30.6(C20), 27.6(C15), 25.9(C27), 23.6(C2), 23.5(C11), 23.0 (C30), 21.9(C16), 18.0(C6), 16.7(C26), 15.8(C25), 12.4(C24); IRν: 3 438(OH), 3 115(Ph), 2 944(CH), 1 839(CH3), 1 724(C=O), l 646(C=C), 1 578(Ph), 1 236(C—O), 1 158, 762(Ar—H) cm-1; MS(ESI)m/z: 599.5{[M+Na]+}; HR-MSm/z: Calcd for C38H56O4{[M-Bn]-}485.062 8, found 485.062 1。

(7) 9的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入8 52 mg(0.09 mmol)， Py 2 mL(0.02 mol)， Ac2O 1 mL(10.61 mmol)和DMAP 12 mg(0.02 mmol)， N2保護(hù)，攪拌下于室溫反應(yīng)8 h(TLC監(jiān)測，展開劑：A=3/1,Rf=0.73)。加入1 mol·L-1鹽酸調(diào)至中性，用二氯甲烷萃取，萃取液用無水MgSO4干燥，減壓濃縮得粗產(chǎn)物，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=8/1)純化得淡黃白色固體9 54 mg，收率96.9%, m.p.231～233 ℃;1H NMR (400 MHz)δ: 7.26～7.31(m, 5H, Ph), 5.28(m, 1H, 12-H), 4.44(2H, d,J=12.0 Hz, PhCH2), 3.68(d,J=11.5 Hz, 2H, 23-H), 3.62(3H, s, OCH3), 3.25(1H, m, 3-H), 2.86(dd,J=14.1 Hz, 4.0 Hz, 1H, 18-H), 1.92(s, 3H, COCH3), 2.04(m, 2H, 11-H), 1.73(m, 2H, 2-H), 1.66(m, 2H, 22-H), 1.43(m, 2H, 16-H), 1.43(m, 2H, 5,9-H), 1.38(m, 6H, 1,6,7-H), 1.34(m, 4H, 19,21-H), 1.24(m, 2H, 15-H), 1.14(s, 3H, 27-H), 1.05(s, 3H, 26-H), 0.93(s, 3H, 30-H), 0.95(s, 3H, 24-H), 0.89(s, 3H, 29-H), 0.72(s, 3H, 25-H);13C NMR(101 MHz)δ: 178.2(C28), 170.5(COCH3), 143.7(C13), 138.7(C1′, Ph), 128.1(C3′,5′, Ph), 127.5(C2′,6′, Ph), 127.2(C4′, Ph), 122.2(C12), 74.9(C3), 72.7(PhCH2), 71.7(C23), 51.4(OCH3), 47.4(C9), 47.1(C5), 46.6(C17), 45.7(C19), 41.6(C4), 41.2(C14), 41.1(C18), 39.2(C8), 37.6(C1), 36.6(C10), 33.8(C21), 33.0(C29), 32.3(C22), 32.1(C7), 30.6(C20), 27.6(C15), 25.8(C27), 23.6(C2), 23.3(C11), 23.0(C30), 22.9(C16), 21.2(COCH3), 17.7 (C6), 16.7(C26), 15.7 (C25), 13.4(C24); IRν: 3 105(Ph—H), 2 924(CH), 1 849(CH3), 1718(C=O), l 646(C=C), 1 568(Ph), 1 236(C—O), 772(Ar—H) cm-1; MS(ESI)m/z: 627.3{[M+Na]+}; HR-MSm/z: Calcd for C39H56O5{[M-Bn]-}512.862 8, found 512.862 2。

1.3 溶解度測定

取帶有恒溫夾套的小容量瓶(10 mL)18個，其中1～9號加入適量的蒸餾水，10～18號加入適量乙醚。于25 ℃分別加入適量化合物1～9至飽和，啟動電磁攪拌器，恒溫下持續(xù)攪拌，由于容量瓶容積很小，且電磁攪拌的強(qiáng)度大，因此容量瓶各處可視為無濃度梯度。實驗過程中體系始終處于兩相共存的狀態(tài)，1 h后認(rèn)為體系液相中各個化合物的濃度即為其在該溫度下的溶解度[15-16]。為確保溶解平衡的建立，停止攪拌后，靜置1 h,使各化合物未溶解部分沉淀到小容量瓶底部，用注射器抽取少量上清液，分別以蒸餾水和乙醚做空白對照，通過紫外-可見分光光度計測定各化合物飽和溶液的吸光度，同時測定化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，計算得化合物的溶解度(表 1)。

1.4 體外抗HBV活性測定

首先用MTT法評價化合物在預(yù)設(shè)濃度下對細(xì)胞生長的抑制程度，確定合適的2～9濃度，再進(jìn)行化合物抑制Hep G2.2.15 細(xì)胞表達(dá)表面抗原(HBs Ag)的測試。通過計算化合物對HBs Ag表達(dá)的抑制率來評價化合物活性。按下式分別計算化合物對細(xì)胞活力和對表面抗原的抑制率。

抑制率=[(OD對照-OD樣品)/OD對照]×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

在3～5的合成中，主要是控制反應(yīng)時間，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)時間超過3 h后產(chǎn)物只有5；如果時間在30 min以下原料反應(yīng)不完全，TLC檢測只有兩個產(chǎn)物點；經(jīng)過多次試驗探討最終確定反應(yīng)時間為1.5 h。出現(xiàn)這樣的結(jié)果，可能是因為常春藤皂苷元的3-位羥基和23-位羥基的活性或空間位阻不同，也為糖基化反應(yīng)提供參考依據(jù)，同時注意吡啶和醋酸酐的體積比例為2 ∶1，因為該條件下合成化合物產(chǎn)率較高。

在7的合成中，由于NaH加入后反應(yīng)劇烈，而且碘甲烷易揮發(fā)，所以該反應(yīng)需嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度在0 ℃冰浴中且避光，產(chǎn)率相對較高。對于反應(yīng)過量的NaH用適量甲醇中和，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有23-位羥基反應(yīng)，而3-位羥基沒參與反應(yīng)，以乙?；a(chǎn)物有區(qū)別，分析可能是3-羥基空間位阻較大，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

據(jù)文獻(xiàn)[17]報道先將芳香酸的羧基與甲醇在對甲基苯磺酸作用下形成甲酯，用芐基保護(hù)羥基，然后在氫氧化鉀的甲醇溶液中水解甲酯得芐基保護(hù)酚羥基的芳香酸，但該法酯化反應(yīng)需較長時間，且產(chǎn)率僅為75%。本文直接將常春藤皂苷元28-位羧基與碘化鉀、氟化四丁基銨反應(yīng)得2，再加入溴化芐、NaH繼續(xù)反應(yīng)得8。方法不僅可縮短時間，還使產(chǎn)率提高至86.4%。結(jié)果顯示只有23-位羥基反應(yīng)，而3-位羥基未反應(yīng)，可能是空間位阻的原因。

2.2 溶解度

化合物1～9的溶解度見表1。由表1可以看出，1的水溶性和脂溶性都不好，而其衍生物的溶解性有所改變。在25 ℃時，通過水和乙醚中的溶解結(jié)果分析，可以看出5， 7， 9在水中極難溶解，而極易溶于乙醚中，而2～4, 6和8溶解于乙醚，不溶于水。由此可見，合成的常春藤皂苷元衍生物脂溶性均增大，其脂溶性的變化與活性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

表1 1～9的溶解度

2.3 抗HBV活性

考察了化合物2～9的體外抗HBV活性，結(jié)果見表2。由表2可以看出，當(dāng)濃度為10-6～10-4mol·L-1時，2對細(xì)胞活力的抑制率為0，但濃度為10-4mol·L-1時對表面抗原表現(xiàn)有一定抑制率。當(dāng)然，隨著化合物分子量及脂溶性的增加，3～9隨濃度的增大對細(xì)胞活力的抑制率明顯增加，特別是7和9最明顯,用藥濃度為1×10-6mol·L-1，抑制率均為9.46±0.47%。

表2 2～9的篩選結(jié)果

通過表面抗原的抑制率測試結(jié)果分析可知，在一定濃度范圍內(nèi)，化合物2～9對HBsAg的分泌表達(dá)有一定的抑制作用。以上結(jié)果均為體外試驗結(jié)果，還有待進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)活性研究。

3 結(jié)論

以常春藤皂苷元為原料，通過酯化、乙酰化及醚化等反應(yīng)，合成了新型常春藤皂苷元脂溶性衍生物(2～9)，其中3， 4， 6～9未見文獻(xiàn)報道。本研究原料來源于貴州地區(qū)黃褐毛忍冬的提取物，為開發(fā)利用貴州豐富的資源提供參考，還對解決常春藤皂苷元口服不吸收、生物利度低的難題提供依據(jù)。此外，在合成時，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率比較高，脂溶性增大，該方法可以合成較多類型的常春藤皂苷元衍生物。體外抗HBV活性評價分析表明：3～9隨濃度的增大對細(xì)胞活力的抑制率明顯增加，特別是7和9最明顯。同時在一定濃度范圍內(nèi)，2～9對HBsAg的分泌表達(dá)有一定的抑制作用。

考慮到常春藤皂苷元衍生物在體內(nèi)的降解過程中還會在不同時段和部位釋放出具有藥理活性的苷元，將進(jìn)一步通過動物實驗研究其在分析體內(nèi)藥動學(xué)及藥效學(xué)的關(guān)系、釋藥時間及體內(nèi)代謝情況對活性的影響。該研究結(jié)果對進(jìn)一步研究開發(fā)常春藤皂苷元奠定了基礎(chǔ)。

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Synthesis and In vitro Anti-HBV Activities of Novel Hederagenin Derivatives

HONG Kai-wen1, JIA Xian-sheng2, YANG Xian-jiang2, DONG Deng-xiang2*

(1. Applied Medical Department, Vocational and Technical College of Anshun, Anshun 561000, China; 2. College of Pharmacy, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, China)

Eight derivatives(2～9) of hederagenin were synthesized by acetylation, etherification, benzoylation and esterification,etal, on 3,23-hydroxyl and 28-carboxyl of hederagenin. Among them, six derivatives were not reported. The structures were characterized by1H NMR,13C NMR, IR and MS. The anti-HBV activities of the compounds were determined by MTT method. The results showed that cell viabilities of 3～9 was significantly inhibited with increasing of concentration. In particular, inhibition ratio of 7 and 9 were 9.46±0.47% at concentration of 1×10-6mol·L-1. The inhibition abilities on Hep G2.2.15 cells expressing HBs Ag were tested. The results showed that 2～9 have certain inhibitory effect on the secretory expression of HBsAg.

hederagenin; derivative; synthesis; anti-HBV activity

2016-10-08

貴州省科技攻關(guān)項目(黔科合SY【2010】3016號)

洪開文(1987-)，男，穿青族，貴州安順人，碩士研究生，主要從事中藥化學(xué)與民族藥研究。 E-mail: 854374072@qq.com

董登祥，副教授， Tel. 0851-33431699， E-mail: ddx331@163.com

O621.3; O629.2

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.01.16250