唐濤+張維冰+徐基偉+夏明珠+貢雪東+王風(fēng)云+李彤

摘 要 以十八烷基三氯硅烷和3.巰丙基三甲氧基硅烷為改性劑，采用一鍋法對(duì)硅膠表面加以修飾，進(jìn)一步將巰基氧化制備成C 18.磺酸基雙改性液相色譜固定相。在優(yōu)化的反應(yīng)條件下得到了十八烷基和磺酸基摩爾比為3∶7的固定相，分別采用掃描電鏡、元素分析、紅外光譜對(duì)固定相的形貌和特征加以表征。針對(duì)制備的固定相，在不同的分離模式下，系統(tǒng)考察其色譜分離性能。在反相色譜模式下，成功分離了5種烷基苯化合物； 在親水模式下，分離了3種核苷； 進(jìn)一步應(yīng)用于牛血清白蛋白酶解產(chǎn)物的分離，得到了較好的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 制備的混合模式固定相同時(shí)具有多種分離機(jī)理，在分離復(fù)雜樣品、調(diào)整選擇性方面具有潛在的優(yōu)勢(shì)。

關(guān)鍵詞 混合模式色譜固定相； 反相色譜； 親水作用色譜； 3.巰丙基三甲氧基硅烷

1 引 言

隨著藥物組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，需要分析的樣品越來(lái)越復(fù)雜，對(duì)高效液相色譜的分離能力也提出了更高要求。高效液相色譜的分離介質(zhì)，從最初的無(wú)定形硅膠發(fā)展到多孔硅膠、金屬氧化物微球以及聚合物整體柱等，針對(duì)不同的分析目的，已經(jīng)研制出了大量具有特殊結(jié)構(gòu)的液相色譜填料，為色譜分離方法發(fā)展提供了更多的選擇。

在硅膠表面的硅羥基上鍵合新型官能團(tuán)、雙官能團(tuán)，如聚乙二醇[1]、聚丙烯酰胺[2]、胡敏酸[3]、肽段[4]、氨基酸[5，6]等，并應(yīng)用于復(fù)雜樣品的分離一直是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。 Wei等[7]以3.氯丙基三氯硅烷和十八烷基三氯硅烷為改性劑，制備了一種反相/強(qiáng)陰離子交換混合模式固定相，并進(jìn)一步將制備的固定相應(yīng)用于固相萃取馬兜鈴酸。Dabre等[8]利用一種新型的反相/弱陰離子交換色譜柱，實(shí)現(xiàn)了7種水溶性維生素和3種脂溶性維生素混合物的基線分離。Zhao等[9]采用活化硅膠依次與3.縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、疊氮化鈉和N，N.二乙基丙炔胺反應(yīng)，制備了一種弱陰離子交換/親水雙模式色譜固定相，并利用制備的同一支色譜柱通過(guò)兩次不同模式的分離，實(shí)現(xiàn)了離線二維分離9種蛋白質(zhì)。彭西甜等[10]制備了一種辛基.羧基共同鍵合的反相/弱陽(yáng)離子交換混合色譜固定相，成功應(yīng)用于3種陽(yáng)離子表面活性劑、6種抗抑郁藥的分離。Shen等[11]通過(guò)巰基.烯烴點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，制備了多種適用于極性物質(zhì)分離的色譜固定相，并應(yīng)用于二維色譜分離模式。在我們的前期工作[12]中，針對(duì)反相和離子交換混合固定相，在電色譜的模式下系統(tǒng)研究了溶質(zhì)的保留特性，取得了較好的基礎(chǔ)。在固定相表面進(jìn)行多種模式改性，可以使固定相在分離過(guò)程中提供不同分離機(jī)理的多位點(diǎn)的相互作用，對(duì)復(fù)雜樣品的分離表現(xiàn)出良好的選擇性。

本研究在硅膠表面同時(shí)鍵合十八烷基三氯硅烷與3.巰丙基三甲氧基硅烷，并通過(guò)氧化巰基制備雙改性固定相，使其具有多種保留機(jī)理，并應(yīng)用于不同模式的色譜行為研究。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

P1201高效液相色譜儀，配有P1201高壓恒流泵、UV1201紫外.可見(jiàn)檢測(cè)器、EC2006色譜數(shù)據(jù)工作站（大連依利特分析儀器有限公司）； Vario EL型有機(jī)元素分析儀（德國(guó)Elementar公司）； Tensor27紅外光譜儀（德國(guó)布魯克公司）； pH酸度計(jì)（Mettler Toledo公司）； JSM.7800F超高分辨熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（JEOL，日本電子株式會(huì)社）。

5 μm球形硅膠（169 m2/g，120 ， ThermoFisher公司）； 十八烷基三氯硅烷（95%， 0.984 g/mL）、3.巰丙基三甲氧基硅烷（97%， 1.057 g/mL）、胰蛋白酶（Trypsin）、牛血清白蛋白（98%， Albumin from bovine serum， BSA）、二硫蘇糖醇（98%， Dithiothreitol， DTT）、尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷（北京百靈威科技有限公司）； 碘乙酰胺（99%， Iodoracetamide， IAA， Amresco公司）； 甲苯、乙苯、丙苯、丁苯、戊苯、鹽酸、過(guò)氧化氫、二氯甲烷、濃H2SO4（98%）、醋酸銨、三乙胺、尿素、NH4HCO3（天津科密歐試劑有限公司）； 甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA試劑公司）。

2.2 C 18.磺酸基雙改性液相色譜固定相的制備

考察了十八烷基三氯硅烷和3.巰丙基三甲氧基硅烷投料比分別為1∶1、2∶1、4∶1的鍵合率，并最終選擇1∶1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的投料比，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：稱取3 g硅膠于150 mL圓底燒瓶中，加入50 mL HCl、20 mL水，在110℃下攪拌回流8 h，過(guò)濾，使用500 mL水，分5次洗滌，120℃下真空干燥過(guò)夜，得到活化硅膠（Activated silica，AS）。將AS加入250 mL三口燒瓶中，依次加入50 mL甲苯、1.0 mL十八烷基三氯硅烷、0.5 mL 3.巰丙基三甲氧基硅烷，50 μL三乙胺，氮?dú)獗Ｗo(hù)、100℃攪拌回流24 h，過(guò)濾，依次用100 mL二氯甲烷、50 mL甲醇、100 mL水、50 mL甲醇洗滌，80℃下真空干燥過(guò)夜，得到C 18.巰基鍵合硅膠（Octadecyl.mercapto silica， OMS）。將OMS加入到150 mL圓底燒瓶中，依次加入15 mL甲醇、50 mL 30% H2O2、20 μL濃H2SO4，25℃下攪拌反應(yīng)20 h，過(guò)濾，依次用100 mL水、100 mL甲醇洗滌，80℃下干燥過(guò)夜，得到目標(biāo)產(chǎn)物C 18.磺酸基雙改性固定相（Octadecyl.sulfonic silica， OSS）。C 18.磺酸基雙改性色譜固定相的制備路線見(jiàn)圖1。

2.3 色譜柱的裝填

采用高壓等密度勻漿技術(shù)，準(zhǔn)確稱取2.2 g 固定相于50 mL燒杯中，配制勻漿液，超聲； 倒入勻漿罐中，用頂替液加壓，裝色譜柱（150 mm × 4.6 mm i.d.）進(jìn)行后續(xù)評(píng)價(jià)。

2.4 BSA酶解樣品的制備

稱取1.0 mg BSA溶于8 mol/L 尿素和100 mmol/L NH4HCO3緩沖液（pH 8.0）中； 加入8 μL 1 mol/L DTT ，60℃水浴鍋中反應(yīng)2 h； 加入20 μL 1 mol/L IAA，常溫下避光反應(yīng)0.5 h； 隨后使用100 mmol/L NH4HCO3將樣品中尿素濃度稀釋至1.0 mol/L，并按質(zhì)量比1∶25加入胰蛋白酶，37℃下反應(yīng)過(guò)夜； 最后，將得到的蛋白質(zhì)酶解液調(diào)至酸性，除鹽后凍干， 待用。

3 結(jié)果與討論

3.1 固定相的表征

3.1.1 電鏡掃描 硅膠改性前后的掃描電鏡圖如圖2所示。從圖2a和圖2b可見(jiàn)，改性前后，硅膠顆粒直徑、粒度大小分布沒(méi)有明顯變化。對(duì)比放大圖（圖2c和2d）可見(jiàn)，硅膠微球表面的多孔結(jié)構(gòu)也沒(méi)有明顯改變，僅是改性后的表面略顯粗糙。間接說(shuō)明改性實(shí)驗(yàn)對(duì)硅膠粒度和多孔結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響，表面微小的變化也符合硅膠表面改性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

3.1.2 元素分析 對(duì)C 18.磺酸基雙改性固定相制備過(guò)程中各步產(chǎn)物進(jìn)行了元素分析，結(jié)果如表1所示。固定相中含有C、H、S元素，表明十八烷基三氯硅烷、3.巰丙基三甲氧基硅烷均已成功鍵合到硅膠表面。根據(jù)元素分析結(jié)果推算出固定相中十八烷基與磺酸基的摩爾比為3∶7； 參考公式[13]，計(jì)算出十八烷基表面覆蓋率為1.0 μmol/m2，磺酸基為2.37 μmol/m2。計(jì)算所得鍵合相之比與投料比不同的原因可能是十八烷基在反應(yīng)過(guò)程中受到的空間位阻效應(yīng)較大，導(dǎo)致鍵合到硅膠表面的量較少。

3.2 固定相的色譜行為評(píng)價(jià)

3.2.1 反相色譜模式 使用5種烷基苯作為分析樣品，考察固定相在反相色譜模式中的色譜行為。從圖4a可見(jiàn)，固定相對(duì)烷基苯具有很好的分離選擇性，5種樣品均得到了基線分離。按照盧佩章等[14]闡述的同系物保留值的碳數(shù)規(guī)律，在反相色譜分離模式中，lnk′與同系物的碳數(shù)成線性關(guān)系。以5種烷基苯的lnk′為縱坐標(biāo)，含碳數(shù)為橫坐標(biāo)，做lnk′.C關(guān)系圖，如圖4b所示，線性關(guān)系良好， R2=0.995，說(shuō)明制備的固定相具有典型的疏水作用保留機(jī)理。

3.2.2 親水作用色譜模式 使用3種核苷樣品作為探針，考察這些物質(zhì)在該固定相上的色譜保留性能。由圖5a可知，固定相對(duì)3種核苷具有很好的分離選擇性。進(jìn)一步改變流動(dòng)相中乙腈含量，考察其對(duì)核苷類物質(zhì)保留的影響，結(jié)果表明，當(dāng)乙腈含量大于80%時(shí)，隨著乙腈含量的不斷升高，3種核苷的保留時(shí)間逐漸增加，如圖5b所示，說(shuō)明固定相具有典型的親水作用保留機(jī)理。

3.2.3 BSA酶解產(chǎn)物的分離 很多的研究報(bào)道[15，16]采用BSA酶解產(chǎn)物作為評(píng)價(jià)固定相分離性能的樣品。BSA酶解產(chǎn)物是一種典型的蛋白質(zhì)類復(fù)雜樣品，同時(shí)具有疏水、親水等成分，單一的分離模式很難取得理想效果。采用制備的混合固定相，分離BSA酶解產(chǎn)物的譜圖如圖6所示，以1 mAU為積分門(mén)檻，共識(shí)別譜峰27個(gè)，獲得了較好的分離效果。

4 結(jié) 論

利用“一鍋法”，將十八烷基三氯硅烷和3.巰丙基三甲氧基硅烷鍵合到硅膠表面，進(jìn)一步氧化制得C 18.磺酸基混合固定相。通過(guò)掃描電鏡、元素分析、紅外光譜分析，證明了雙改性基團(tuán)被成功鍵合。采用制備的固定相，在反相模式下分離了5種烷基苯化合物，在親水模式下分離了3種核苷，并在分離BSA酶解產(chǎn)物時(shí)獲得了良好結(jié)果，說(shuō)明固定相能提供多個(gè)活性位點(diǎn)，同時(shí)具有多重分離機(jī)理，尤其適合于蛋白質(zhì)類的復(fù)雜樣品分離。

References

1 Song C， Wang J S， Zhao K L， Bai Q. Biomed. Chromatogr.， 2013， 27： 1741-1753

2 YANG Duo， YU Dong.Ping， DONG Xue.Fang， SHEN Ai.Jin， JIN Gao.Wa， GUO Zhi.Mou， YAN Jing.Yu， LIU Ming.Yang， LIANG Xin.Miao. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（10）： 1439-1444

楊 鐸， 俞冬萍， 董雪芳， 沈愛(ài)金， 金高娃， 郭志謀， 閆競(jìng)宇， 劉名揚(yáng)， 梁鑫淼. 分析化學(xué)， 2015， 43（10）： 1439-1444

3 Gezici O， Kara H. Talanta， 2011， 85（3）： 1472-1482

4 Ray S， Takafuji M， Ihara H. J. Chromatogr. A， 2012， 1266： 43-52

5 Aral T， Aral H， Ziyadanoullar B， Ziyadanoullar R. Talanta， 2015， 131： 64-73

6 Wu S J， Li X L， Zhang F F， Jiang G， Liang X M， Yang B C. Analyst， 2015， 140： 3921-3924

7 Wei J， Guo Z M， Zhang P J， Zhang F F， Yang B C， Liang X M. J. Chromatogr. A， 2012， 1246： 129-136

8 Dabre R， Azad N， Schwmmle A， Lmmerhofer M， Lindner W. J. Sep. Sci.， 2011， 34 （7）： 761-772

9 Zhao K L， Yang F， Xia H J， Wang F， Song Q G， Bai Q. J. Sep. Sci.， 2015， 38： 703-710

10 PENG Xi.Tian， WANG Yu， FENG Yu.Qi. Chinese Journal of Chromatography， 2013， 31（4）： 329-334

彭西甜， 王 鈺， 馮鈺琦. 色譜， 2013， 31（4）： 329-334

11 Shen A J， Guo Z M， Cai X M， Xue X Y， Liang X M. J. Chromatogr. A， 2012， 1228： 175-182

12 ZHANG Wei.Bing， ZHANG Li.Hua， ZHANG Ling.Yi， ZHANG Yu.Kui. Chinese Journal of Chromatography， 2002， 20（4）： 295-298

張維冰， 張麗華， 張凌怡， 張玉奎. 色譜， 2002， 20（4）： 295-298

13 Berthod A，Chang C D， Armstrong D W. Talanta， 1993， 40（9）： 1367-1373

14 LU Pei.Zhang， DAI Chao.Zheng， ZHANG Xiang.Min. Fundamentals of Chromatography Theory. Beijing： Science Press， 1997： 282-285

盧佩章， 戴朝政， 張祥民. 色譜理論基礎(chǔ). 北京： 科學(xué)技術(shù)出版社， 1997： 282-285

15 WEI Juan， GU Xue， WANG Yan， YAN Chao. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（2）： 188-192

魏 娟， 谷 雪， 王 彥， 閻 超. 分析化學(xué)， 2011， 39（2）： 188-192

16 XIE Jing.Xin， BI Kai.Shun， QIAN Xiao.Hong， ZHANG Yang.Jun. Chinese Journal of Chromatography， 2009， 27（2）： 186-190

謝晶鑫， 畢開(kāi)順， 錢小紅， 張養(yǎng)軍. 色譜， 2009， 27（2）： 186-190

Abstract A C 18.sulfonic group dual modification chromatographic stationary phase was prepared by one.pot reaction to modify the surface of silica with two modifier of octadecyltrichlorosilane （OTS） and trimethoxysilylpropanethiol （MPS） and oxidize the thiol group. Under the optimized reaction conditions， the stationary phase with a mole ratio of 3∶7 between C 18 and sulfonic group was obtained. The morphology and feature of the stationary phase were characterized by scanning electronic microscopy， elemental analysis and infrared spectra. The chromatographic properties of the prepared stationary phase were systematically investigated in different separation modes. Five alkyl benzenes and three nucleosides were separated successfully in reversed phase chromatography and hydrophilic interaction chromatography respectively. The bovine serum albumin digests could also be separated well on the stationary phase. The results indicated that the prepared mixed.mode stationary phase could provide multiple separation mechanism and had potential advantages in separating complex samples and adjusting the selectivity.

Keywords Mixed.mode chromatography stationary phase； Reversed phase chromatography； Hydrophilic interaction chromatography； 3.Mercaptopropyltrimethoxysilane