李繼印，洪仕君，黃舒柏清，劉青青，任國印，李樹華

草烏為毛茛科烏頭屬植物，主要分為北草烏和黃草烏兩種。云南烏頭屬(Aconitum)植物資源豐富，有66種[1-2]，主要以黃草烏或滇南草烏為基源植物[3]，多分布于滇西及滇中部；其主要成分為滇烏堿、粗莖烏頭堿甲、塔拉薩敏等[4]，因產(chǎn)地不同、種屬間生物堿的含量差別較大[5]。黃草烏塊根具有舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)除濕、消腫止痛的功效，民間廣泛用于治療風(fēng)濕和跌打損傷等病癥[6]，但黃草烏毒性較強(qiáng)，安全范圍窄，中毒案件頻繁發(fā)生。由于對(duì)黃草烏的認(rèn)識(shí)不充分，法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中對(duì)草烏中毒案件的鑒定主要關(guān)注烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的檢測。對(duì)黃草烏中毒案(事)件中毒性成分的檢測報(bào)道較少，未見測定人體生物檢材中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究建立的粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的UPLC-MS/MS檢測方法對(duì)黃草烏中藥物成分分析及法醫(yī)學(xué)鑒定均具有應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥98.0%)；8-去乙酰基滇烏堿對(duì)照品(云南中醫(yī)學(xué)院馬曉霞提供，純度為94.5%)；乙腈和甲醇(色譜純)，甲酸和乙醚(分析純)，pH 9.2硼酸鹽緩沖溶液，娃哈哈純凈水等。

1.1.2儀器UPLC-MS/MS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent1290型液相色譜儀和AB SCIEX 4000Q TRAP串聯(lián)質(zhì)譜儀)，電子天平(賽多利斯BT125D)，臺(tái)式高速離心機(jī)(Thermo Mx120)。

1.1.3檢驗(yàn)材料公安機(jī)關(guān)送檢的檢材：疑為黃草烏中毒死者肝臟組織及現(xiàn)場提取的黃草烏(經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院楊耀文副教授鑒定證實(shí)為黃草烏)干燥塊根5 g。

1.2方法

1.2.1色譜質(zhì)譜條件UPLC條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸(含5 mmoL乙酸銨)水溶液，梯度洗脫(0～0.5 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)為5%；0.5～5.0 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)5%→95%；5.0～5.5 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)為95%；5.5～5.6 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)95%→5%；5.6～7.5 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)5%)；流速0.5 mL·min-1，柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積5 μL。Mass條件：電噴霧離子源，正離子模式，三重四極桿檢測器，MRM檢測模式；粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的監(jiān)測離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)見表1。

表1 待測物的監(jiān)測離子對(duì)和電壓參數(shù) V

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制分別精密稱取10.0 mg粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶內(nèi)，用甲醇溶解定容至刻度線，振搖均勻后分別得到1.0 mg·mL-1粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置4 ℃冰箱保存。

1.2.3樣品處理黃草烏的處理：稱取送檢黃草烏干燥塊根2 g，粉碎后用甲醇浸泡5 d，得到20 mL浸泡液。取適量黃草烏浸泡液，經(jīng)甲醇稀釋1 000倍后，離心(10 000 r·min-1)3 min，上清液經(jīng)有機(jī)濾膜(13 mm×0.22 μm)過濾后得到黃草烏樣品。肝組織的處理：準(zhǔn)確稱取1 g肝組織，勻漿后，用硼酸鹽緩沖液(pH為9.2)浸泡60 min，離心(15 000 r·min-1)3 min，上清液經(jīng)乙醚萃取后氮?dú)獯蹈桑状级ㄈ葜? mL，經(jīng)有機(jī)濾膜(13 mm×0.22 μm)過濾，得到送檢肝組織樣品。

2 結(jié)果

2.1方法適用性驗(yàn)證在1.2.1分析條件下，分別對(duì)空白人體肝組織對(duì)照樣品、粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及送檢肝組織樣品和黃草烏樣品進(jìn)行檢測；各以目標(biāo)物對(duì)照品的兩對(duì)離子對(duì)和保留時(shí)間對(duì)送檢肝組織樣品和黃草烏樣品中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏進(jìn)行定性分析。結(jié)果顯示：空白對(duì)照無干擾，方法專屬性好(見圖1)。

圖1 樣品中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的MRM圖

2.2線性范圍和檢出限取空白人體肝組織，按“1.2.3”方法處理后，用粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的混標(biāo)溶液配制質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、50、100 ng·mL-1的系列基質(zhì)加標(biāo)溶液，并配制質(zhì)量

濃度分別為1、5、10、20、50、100 ng·mL-1的系列混標(biāo)溶液，按“1.2.1”分析條件測定，以定量離子對(duì)的積分峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C，ng·mL-1)進(jìn)行線性回歸(表2)。取線性最低點(diǎn)溶液逐級(jí)稀釋后測定，檢出限以信噪比(S/N)﹥3作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，定量限以信噪比﹥10為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的線性方程(線性范圍1～100 ng·mL-1)及檢出限見表2。

2.3精密度、回收率及穩(wěn)定性配制低、中、高3個(gè)濃度的空白人體肝臟添加樣品(n=6)，按“1.2.3”方法處理樣品，在“1.2.1”節(jié)條件下測定，記錄粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的定量離子對(duì)的峰面積As，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，計(jì)算日間精密度；取空白肝臟組織，按“1.2.3”方法處理樣品后，配制成低、中、高3個(gè)濃度的基質(zhì)加標(biāo)溶液(n=6)，在“1.2.1”條件下測定，記錄峰面積為Am；另取上述3個(gè)濃度的混標(biāo)溶液直接進(jìn)樣，記錄峰面積為Astd。以As/Am計(jì)算提取回收率，Am/Astd計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表3。配制低、中、高3個(gè)濃度的肝臟質(zhì)控樣品(n=6)，在室溫放置24 h及3次凍融循環(huán)后，按“1.2.3”方法處理樣品，在“1.2.1”條件下測定，計(jì)算精密度，考察其短期穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性。結(jié)果表明，粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的RSD%均低于5.0%，說明樣品在上述條件下穩(wěn)定。

表2 粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的線性方程及檢出限(n=6)

表3 待測物的精密度、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

2.4樣品測定將“1.2.3”處理得到的送檢肝組織樣品和黃草烏樣品，在“1.2.1”條件下測定，送檢肝組織樣品中定性檢出粗莖烏頭堿甲和滇烏堿，未檢出塔拉薩敏和8-去乙?；釣鯄A；其中粗莖烏頭堿甲的含量為54.25 ng·g-1，滇烏堿的含量為125.0 ng·g-1。送檢黃草烏塊根中定性檢出粗莖烏頭堿甲、滇烏堿、塔拉薩敏和8-去乙?；釣鯄A，其中粗莖烏頭堿甲的含量為0.16 mg·g-1，滇烏堿的含量為0.43 mg·g-1，塔拉薩敏的含量為0.52 mg·g-1。

3 討論

目前，用HPLC[8]或LC/MS[9-10]法測定草烏中的烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的報(bào)道較多，對(duì)黃草烏及黃草烏中毒案件生物檢材中的主要毒性成分的檢測報(bào)道鮮見，赫偉等[11]采用HPLC法測定長喙烏頭中的滇烏堿、草烏甲素和黑烏弱堿；張盼盼等[12]用LC-MS/MS法檢測了尿液中滇烏堿、烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿成分；劉偉等[13]用LC-MS/MS法檢測了血液中的草烏甲素、烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿；李繼印等[5]用UPLC-MS/MS法檢測了云南5種不同產(chǎn)地的黃草烏中滇烏堿、粗莖烏頭堿甲和塔拉薩敏的含量；未見檢測黃草烏中毒人體生物檢材中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的報(bào)道。本文建立的UPLC-MS/MS檢測人體肝臟中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的方法，經(jīng)驗(yàn)證同樣適用于8-去乙酰基滇烏堿、烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的檢測。本研究也對(duì)死者肝臟組織和對(duì)照檢材黃草烏塊根進(jìn)行了烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的檢測，均未檢出這3種生物堿成分，進(jìn)一步驗(yàn)證了本案涉及的草烏塊根為黃草烏。此外，從案件涉及的黃草烏塊根中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的含量可以看出：3種成分相比，塔拉薩敏的含量最高，而中毒尸體肝臟組織中卻未檢出塔拉薩敏成分，原因可能是塔拉薩敏化學(xué)性質(zhì)不如滇烏堿和粗莖烏頭堿甲穩(wěn)定，或者塔拉薩敏在體內(nèi)代謝較快。因此，涉及黃草烏中毒案件的檢驗(yàn)鑒定應(yīng)優(yōu)先考慮滇烏堿和粗莖烏頭堿甲的檢驗(yàn)。

本文建立的方法適用于各類檢材中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的分析檢測，本研究為黃草烏中毒案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供更多的檢測目標(biāo)物，為案(事)件的死亡原因分析及定性判定提供更多的依據(jù)。

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