劉盛榮++張維瑞++戴金玉++余浩++鄭春源

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.106

摘要：建立一種靈芝均一性菌種制作方法及其發(fā)酵工藝。超聲破碎靈芝瓊脂固體平板培養(yǎng)物，采用鏡檢和涂布平板法分析超聲均質效果，以生物量和胞外多糖為指標優(yōu)化其發(fā)酵工藝。結果表明：靈芝瓊脂固體菌種破碎完全、均一性好，菌落數(shù)達到186.00 CFU/個（瓊脂塊直徑0.5 cm）；以超聲均質化菌種為接種物于恒搖床發(fā)酵，生物量、胞外多糖分別為9.24、0.62 g/L，低于瓊脂塊菌種（分別為13.37、1.16 g/L）；采用靜置加搖床兩階段發(fā)酵方法（共10 d），以靜置 3 d、搖床7 d為最優(yōu)，生物量、胞外多糖含量分別達到15.14、0.86 g/L；與瓊脂塊菌種恒搖床發(fā)酵相比分別提高2996%、16.21%；超聲均質菌種優(yōu)化后的接種量為7 mL。

關鍵詞：靈芝；瓊脂菌種；超聲波；液體發(fā)酵；發(fā)酵工藝

中圖分類號： S567.3+10.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0363-04

收稿日期：2015-08-08

基金項目：寧德師范學院校企科研合作項目（編號：AF-003）；寧德師范學院人才啟動項目（編號：2013Y008）。

作者簡介：劉盛榮（1973—），男，福建三明人，博士，講師，主要從事食用菌及藥用菌液體發(fā)酵研究。E-mail：fjhost@163.com。靈芝別稱瑞草、萬年蕈、不老草、仙草、神芝，屬擔子菌門層菌綱多孔菌目靈芝科靈芝屬，在我國主要指赤芝（Ganoderma lucidum）、紫芝（G. sinense）、松杉靈芝（G. tsugae）等具有較高藥用價值的芝類。靈芝是我國、日本、韓國、泰國等東方國家的傳統(tǒng)珍貴草藥，其中靈芝多糖、靈芝酸是靈芝藥效的關鍵物質基礎[1-3]，主要用于肝炎、高血壓、高血脂、胃癌等疾病的治療。

野生靈芝資源極其稀少，人工代料栽培是目前靈芝生產(chǎn)的主要方法，但其栽培周期長，且不同批次產(chǎn)品的活性成分及其含量有較大差異，不利于靈芝產(chǎn)品的標準化生產(chǎn)、應用、推廣。不同于前者，靈芝液體發(fā)酵具有周期短、過程易控制、生產(chǎn)自動化水平高等優(yōu)點，且發(fā)酵組分活性與子實體相近[4-8]，因此研究人員以生物量、多糖、三萜為目標對發(fā)酵培養(yǎng)基、真菌激發(fā)子、中藥提取物強化活性物質生物合成等進行研究[9-12]。

液體發(fā)酵是當前食藥用菌研究的熱點，其瓊脂平板培養(yǎng)物常作為液體發(fā)酵[13]或液體菌種生產(chǎn)的接種物[14-15]，其優(yōu)點在于可縮短菌種制備時間，但發(fā)酵周期長。Xing等采用小型攪拌機均質化灰樹花（Grifola frondosa）瓊脂平板培養(yǎng)物，作為漆酶液體發(fā)酵接種物[16]。靈芝液體培養(yǎng)菌種接種前，也常采用攪拌機均質后再用于接種[17]。研究靈芝瓊脂固體菌種超聲破碎效果，并優(yōu)化其作為接種物的發(fā)酵工藝，為均一性菌種制備及其發(fā)酵提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株赤芝購自中國科學院微生物研究所，編號為CCMCC 5.535。

1.1.2培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂18 g、去離子水1 000 mL，于121 ℃下滅菌20 min。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖35.0 g、蛋白胨4.0 g、酵母粉4.0 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4 0.5 g、維生素B1 0.01 g、去離子水 1 000 mL，于121 ℃下滅菌20 min。

1.1.3主要儀器JY-96 IIN型超聲波細胞破碎儀（浙江寧波新芝生物科技股份有限公司），UV5800-PC型紫外可見分光光度儀（上海元析分析儀器有限公司），NRY-2102C型恒溫搖床（上海南榮實驗室儀器有限公司），PHS-3C型精密pH值計（上海儀電科學儀器股份有限公司），DM750型顯微鏡（配LEICA DMC2900型相機，LEICA公司）。

1.2方法

1.2.1菌種活化及平板培養(yǎng)將4 ℃冷箱保藏的斜面菌種轉至新配制的PDA斜面，于25 ℃下活化培養(yǎng)7 d，活化菌種接至PDA平板培養(yǎng)7 d。

1.2.2菌種超聲波破碎采用無菌打孔器（直徑0.5 cm）在平板菌落近邊緣打孔，挑取20個瓊脂塊至裝有20 mL無菌水的50 mL離心管。超聲前采用75%乙醇、無菌水依次擦拭超聲波細胞破碎儀變幅桿；將其浸于懸液開始超聲破碎，每次10 s，共6次（合計時間1 min），功率250 W，形成1 mL懸液的生物量約相當于1個瓊脂塊所含生物量，即為超聲均質菌種。

1.2.3顯微觀察吸取50 μL超聲均質菌種至載玻片，蓋上蓋玻片，于10倍物鏡下觀察并拍照。

1.2.4菌落計數(shù)吸取200 μL超聲均質菌種懸液至9 cm PDA平板上，采用涂布棒均勻涂布，于25 ℃下培養(yǎng)5 d后觀察計數(shù)。

1.2.5恒搖床發(fā)酵吸取3 mL均質菌種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的150 mL搖瓶中，接種3個瓊脂固體菌種作為對照。于30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)10 d。

1.2.6靜置加搖床兩階段發(fā)酵吸取3 mL超聲均質菌種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的150 mL搖瓶中，于30 ℃下靜置培養(yǎng)1～4 d，之后于160 r/min搖床培養(yǎng)，合計培養(yǎng)10 d，優(yōu)化其發(fā)酵；接種3個瓊脂菌種作為對照，同時設瓊脂塊菌種恒搖床發(fā)酵?；趦?yōu)化的兩階段發(fā)酵，接種量分別為1～10 mL，接種至裝有50 mL培養(yǎng)基的150 mL搖瓶中，以優(yōu)化超聲均質菌種接種量。

1.2.7發(fā)酵參數(shù)分析（1）生物量（干質量法）。將發(fā)酵液以3 500 r/min離心，收集菌絲并去除瓊脂塊培養(yǎng)基，上清用于pH值、胞外多糖含量、殘葡萄糖含量的測定；菌絲用去離子水洗滌，離心收集，重復2次。菌絲轉至60目紗布，于 70 ℃ 下烘干至恒質量，計算生物量。（2）殘葡萄糖含量。采用3，5-二硝基水楊酸法測定發(fā)酵液的殘葡萄糖含量。（3）pH值。采用數(shù)顯pH計測定發(fā)酵液的pH值。（4）多糖含量。參照文獻[7，18]進行測定。胞外多糖含量。吸取10 mL離心發(fā)酵液上清于透析膜（分子截留量10 000 u）中，流動自來水透析24 h以去除葡萄糖等小分子，向收集的透析液加入 40 mL 95%乙醇，充分混合后于4 ℃冰箱過夜。過夜沉淀液以3 500 r/min離心10 min并棄上清，將沉淀懸于25 mL 1 mol/L NaOH溶液，于60 ℃下水浴1 h，離心收集上清。胞內(nèi)多糖：干菌絲于研缽中研碎，稱取100 mg至25 mL 1 mol/L NaOH 溶液，于60 ℃下水浴1 h，離心收集上清。采用苯酚-硫酸法測定2種上清液的多糖。

1.2.8數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，作t檢驗分析，以P<0.05為顯著性差異。試驗均重復3次，試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示。

2結果與分析

2.1超聲均質菌種顯微觀察

由靈芝瓊脂固體菌種超聲均質顯微圖（圖1）可知，菌種破碎完全，可看到均一性菌絲體及少量短菌絲?？梢?，超聲波破碎是一種有效的瓊脂固體菌種均質方法，可用于制備均一性菌種。此外，降低培養(yǎng)基瓊脂含量可提高超聲破碎效果并縮短超聲時間。

2.2超聲均質菌種菌落計數(shù)

圖2為瓊脂固體菌種超聲破碎懸液稀釋后涂布平板培養(yǎng)菌落，菌落大小一致，每個瓊脂塊菌種超聲后形成約 186.00±11.35個菌落，此為1 mL超聲均質菌種發(fā)酵生長點。本試驗條件（5 d培養(yǎng)時間）下，相當數(shù)量的短菌絲片段可能未生長至可肉眼觀察的菌落，因此超聲均質菌種發(fā)酵生長點應高于該菌落值。

2.3超聲均質菌種恒搖床發(fā)酵

由超聲均質菌種及瓊脂塊菌種恒搖床發(fā)酵結果（表1）可知，超聲法破碎制備的均一菌種發(fā)酵終點生物量和胞外多糖均低于瓊脂塊菌種。2種菌種在葡萄糖利用方面也存在顯著差異（P<0.05），由于葡萄糖主要作為碳源提供細胞生長能量、參與合成細胞組成成分、合成代謝產(chǎn)物，超聲均質菌種低葡萄糖消耗顯示其弱發(fā)酵力，這與其發(fā)酵低生物量和多糖吻合。

超聲均質菌種所含生長點遠高于瓊脂塊菌種，但發(fā)酵液所形成菌球數(shù)量少甚至低于后者，很顯然超聲均質菌絲搖床過程發(fā)生聚集并降低其生長點，這是超聲均質菌種發(fā)酵水平低的重要原因。此外，菌種超聲破碎過程其細胞必然受損傷，或影響超聲均質菌種發(fā)酵性能。

2.4超聲均質菌種不同靜置時間加搖床培養(yǎng)兩階段發(fā)酵

由超聲均質菌種和瓊脂塊菌種作為接種物的不同靜置時間加搖床培養(yǎng)兩階段發(fā)酵結果（表2）可知，超聲均質菌種不同靜置時間加搖床發(fā)酵以靜置3 d、搖床培養(yǎng)7 d的生物量和胞外多糖含量最高，分別為15.14、0.86 g/L，與其恒搖床發(fā)酵生物量、胞外多糖含量9.24、0.62 g/L（表1）相比分別提高 63.85%、38.71%?？梢姡o置3 d、搖床7 d兩階段發(fā)酵是超聲均質菌種優(yōu)化的發(fā)酵工藝。

作為對照，瓊脂塊菌種靜置培養(yǎng)時間1～3 d加搖床培養(yǎng)兩階段發(fā)酵的生物量、胞外多糖含量均高于其恒搖床發(fā)酵（P<0.05）；靜置時間（1～3 d）對發(fā)酵結果無顯著影響（P>0.05），但靜置時間為4 d時生物量和胞外多糖明顯下降。靜置期（1～3 d）細胞可能以適應發(fā)酵環(huán)境和恢復性生長為主，即為遲滯期，細胞進入生長期后需要豐富的氧分及營養(yǎng)供應，而此時靜置培養(yǎng)氧質及溶質傳遞有限，成為其發(fā)酵的制約因素。

2.5超聲均質菌種不同接種量靜置加搖床（3 d/7 d）兩階段發(fā)酵

采用優(yōu)化的靜置加搖床兩階段發(fā)酵工藝（3 d靜置培養(yǎng)，7 d搖床培養(yǎng)）對不同超聲均質菌種接種量的發(fā)酵結果見表3。由表3可知，隨著接種量的增大，發(fā)酵終點生物量及胞外多糖含量相應提高，于接種量為7 mL（約相當于7個瓊脂塊菌種）時達到最高，生物量、胞外多糖含量分別為17.43、1.27 g/L；進一步增大接種量，生物量、胞外多糖含量均未提高，表明該優(yōu)化發(fā)酵工藝下超聲均質菌種的優(yōu)化接種量為7 mL。

3討論

超聲波是指頻率為2×104～2×109 Hz的聲波，是機械波的一種，因其超越了人類聽覺的上限而被稱為超聲波。超聲波在生物研究中的應用主要以細胞破碎[19-20]、成分輔助提取[21-23]為主。細胞破碎是利用超聲波在液體中的空化作用產(chǎn)生密集小氣泡，依靠小氣泡的迅速炸裂將細胞破碎。本研究表明，超聲波可有效破碎靈芝瓊脂固體菌種。傳統(tǒng)的攪拌法通過高速攪拌子產(chǎn)生巨大的機械剪切力將細胞破碎，相比之下，超聲波法具有使用方便快捷、不易污染、安全性高等優(yōu)點，且對細胞的損傷可能較小。超聲探頭（變幅桿）易與生物反應器集成，由此可實現(xiàn)均一性菌種的即時制備，減少污染發(fā)生，使高均一性和高純度液體菌種發(fā)酵生產(chǎn)成為現(xiàn)實。

本研究利用超聲波破碎技術成功制備高均一性、高生長點的靈芝菌種，但其作為接種物搖床發(fā)酵的生物量和胞外多糖產(chǎn)率低于未破碎瓊脂塊菌種。主要因為超聲均質菌種搖床過程菌絲發(fā)生聚集現(xiàn)象，降低了其發(fā)酵生長點；此外，靈芝細胞超聲破碎時受到損傷，這2種不利因素制約了其發(fā)酵水平。瓊脂塊菌種的起始生長點較少，但搖床培養(yǎng)過程中其自身逐漸碎片化，且新生長菌絲于原菌種脫落為新生長點，發(fā)酵液生長點不斷增多。盡管搖床發(fā)酵時瓊脂塊菌種的生長點少，但其發(fā)酵水平仍高于超聲均質菌種。

兩階段發(fā)酵工藝是一種廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)及科學研究的發(fā)酵技術。根據(jù)細胞生長及目標產(chǎn)物生物合成條件的差異，兩階段發(fā)酵有多種不同的調(diào)控模式，以最大化目標產(chǎn)物的合成。例如，ε-聚賴氨酸（ε-polylysine）兩階段pH值發(fā)酵，細胞生長期pH值控制在5.0以上，ε-聚賴氨酸合成期pH值控制為4.0[24]；凝膠多糖（curdlan）兩階段細胞密度控制發(fā)酵，前期采用高密度發(fā)酵技術，凝膠多糖合成階段采用低細胞密度[25]；蝦青素（astaxanthin）發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖濃度采用兩階段控制方式，生長期、合成期分別為20、50 g/L[26]。

崔建東等研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草多糖搖動加靜置兩階段發(fā)酵，搖動培養(yǎng)115 h后靜置培養(yǎng)120 h最優(yōu)，多糖產(chǎn)量分別為搖動培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)的1.5、2.0倍[27]。Fang等采用先搖動培養(yǎng)4 d、后靜置培養(yǎng)12 d的發(fā)酵方法，靈芝菌絲靈芝酸由恒搖床發(fā)酵的0.136 mg/g提高至0.319 mg/g[28]。Bigelis等采用靜置培養(yǎng)7 d、搖動培養(yǎng)7 d的兩階段發(fā)酵工藝，使抗癌疾先導化學物Flavomannin產(chǎn)率提高10～100倍[29]。本研究針對超聲均質菌種傳統(tǒng)恒搖床過程中菌絲發(fā)生聚集的現(xiàn)象，采用先靜置培養(yǎng)以避免和減輕菌絲聚集，從而維持其多發(fā)酵生長點，使發(fā)酵水平大幅提高。

4結論

超聲波破碎可有效均質化靈芝瓊脂固體菌種，每個瓊脂塊（直徑為0.5 cm）菌種超聲破碎可形成186.00個菌落。

采用超聲波破碎制備的均一性菌種，其搖床發(fā)酵生物量和胞外多糖低于傳統(tǒng)瓊脂塊菌種；靜置加搖床兩階段發(fā)酵以靜置3 d、搖床振蕩培養(yǎng)7 d為最優(yōu)發(fā)酵工藝。

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