龔瑞玥++方春林++萬正義++舒漢鼎++胡成鈺++毛慧玲

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.021

摘要：選用64對SRAP引物對黃顙魚屬進行遺傳多樣性研究。結(jié)果顯示，有46對引物能成功擴增，其中19對條帶清晰、顯示較高多態(tài)性。檢測其PCR產(chǎn)物共獲得179條，每對引物擴增條帶5～15條不等，擴增片段介于90～510 bp 之間，物種間遺傳相似系數(shù)范圍為0.500～1.000，黃顙魚屬各物種間具有較大的遺傳差異性。SRAP聚類結(jié)果顯示，瓦氏黃顙魚與其他物種差異最大，普通黃顙魚、長須黃顙魚和中間黃顙魚親緣關(guān)系較近。遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，5種黃顙魚遺傳多樣性處于較高水平，有助于后續(xù)深入對黃顙魚屬各物種親緣關(guān)系和系統(tǒng)演化進行分析。

關(guān)鍵詞：黃顙魚屬；SRAP；遺傳多樣性；遺傳相似系數(shù)

中圖分類號： S961.2文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0092-03

收稿日期：2015-08-15

基金項目：江西省科技支撐資助項目（編號：20112BBF60011）；江西省教育廳科技資助項目 （編號：GJJ14152）。

作者簡介：龔瑞玥（1990—），女，江西南昌人，碩士研究生，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。 E-mail：enidpace713@gmail.com。

通信作者：毛慧玲，碩士，教授，主要從事魚類遺傳與育種研究。E-mail：huilinm6@163.com。黃顙魚俗稱黃丫頭，是備受我國老百姓喜愛的主要經(jīng)濟魚類之一。據(jù)中國動物志中報道，黃顙魚屬共有普通黃顙魚（P.eupogon）、長須黃顙魚（P.fulvidraco）、瓦氏黃顙魚（P.vachelli）、光澤黃顙魚（P.nitidus）和中間黃顙魚（P.intermedius）等5種，中間黃顙魚僅分布于珠江水系及海南島，其他4種均廣泛分布于長江水系[1-2]。隨著市場對黃顙魚需求的增大，其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，隨之出現(xiàn)魚種混雜，品種退化現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在生長速度變慢、抗病力及抗逆力降低等方面。從良種選育、養(yǎng)殖和種質(zhì)資源保護角度考慮，亟須提供一種有效的方法來鑒別這些物種，并研究其遺傳多樣性。

序列相關(guān)擴增多態(tài)性（SRAP，sequence-related amplified polymorphism）分子標(biāo)記是由美國加州大學(xué)蔬菜系Li等于2001年提出[3]，該標(biāo)記具有簡單、高效、高共顯、高重復(fù)、易測序等優(yōu)點[4-5]，廣泛運用于物種遺傳多樣性、品種鑒定和親緣關(guān)系的研究當(dāng)中。本研究從分子水平角度，應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)來鑒別黃顙魚屬5個種，并探討它們的遺傳多樣性及其親緣關(guān)系，為黃顙魚屬種質(zhì)資源保護和開發(fā)利用提供理論資料[6-7]，對黃顙魚漁業(yè)資源的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的科學(xué)指導(dǎo)意義。

1材料與方法

1.1樣品采集

2011年6月至2012年9月，從江西鄱陽湖和廣東西江野外采得魚類（表1），并應(yīng)用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法將它們逐一進行分類。

1.2基因組DNA

每個物種隨機選取4尾，共20尾樣品。取背部肌肉，采用苯酚-氯仿法提取基因組DNA[8]。

1.3SRAP引物來源

由表2可知，SRAP引物序列，將上游引物與下游引物交叉組合得到64對SRAP引物，按照簡寫上下游序號原則進行命名，如上游2號引物me與下游3號引物em組合而成的SRAP引物命為m2e3。

1.4PCR擴增和電泳檢測

20 μL SRAP的PCR擴增體系含：100 ng/μL模板DNA 1.0 μL，50 μmol/L上下游引物各0.06 μL，10×PCR buffer （Mg2+） 2.0 μL，200 μmol/L dNTPs 1.6 μL，5.0 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 15.08 μL；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，5個循環(huán)；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。采用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物多態(tài)性。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

對著SRAP的PCR擴增圖譜，自下而上按遷移率不同排列計數(shù)，無帶則賦值為“0”，有帶則賦值為“1”，建立不同SRAP引物“0-1”矩陣表。應(yīng)用軟件包括POPGENE32、POWERMARKER V3.25等不同軟件處理、分析“0-1”矩陣表數(shù)據(jù)，獲得等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、等位基因有效率（A）、多態(tài)信息含量（PIC）等遺傳多樣性指標(biāo)。分別應(yīng)用NTSYS-pc2.0軟件、UPGMA程序計算遺傳相似系數(shù)[9]、聚類分析[10]。

2結(jié)果與分析

2.1SRAP擴增結(jié)果

由64對SRAP引物擴增結(jié)果獲悉，46對引物能成功擴增，占引物總數(shù)的71.9%。檢測引物擴增的PCR產(chǎn)物，共獲得179條，每對引物擴增條帶5～15條不等，擴增片段介于 90～510 bp之間。由此可確定46對引物是黃顙魚屬SRAP標(biāo)記的有效引物。

選取其中條帶清晰、多態(tài)性較高的19對引物（表3）用于分析。DNA圖譜（圖1）清楚地顯示了引物m2e1、m6e5在20尾黃顙魚樣品特異性擴增產(chǎn)物所具有的多態(tài)性，相同引物下擴增出的同種不同個體均能顯示明顯的相同特征性條帶，體現(xiàn)出種內(nèi)差異較?。欢瑢俨煌N間條帶差異明顯，多態(tài)性高，清晰地體現(xiàn)出黃顙魚屬5個種之間的差異。

2.2遺傳多樣性指標(biāo)分析

19對SRAP引物對黃顙魚屬5個物種20尾樣品進行擴增，檢測到118個等位基因，每個位點可擴增出的等位基因數(shù)為4～8個不等，平均數(shù)為6.2個，大小在90～510 bp之間，計算出有效等位基因數(shù)。由表4可知，有效等位基因數(shù)等位基因有效率、多態(tài)信息含量等平均數(shù)值分別為5.348 6、0.834 2、0.766 7。由表5可見，除中間黃顙魚外的4個物種Shannon信息指數(shù)均較高，特別是長須黃顙魚高達0.683 9。上述數(shù)據(jù)都是反映遺傳多樣性的指標(biāo)，其數(shù)值越大，說明基因豐富度越高。

2.3黃顙魚屬各種聚類分析

由圖2可知，根據(jù)PCR產(chǎn)物的多態(tài)性和聚類分析結(jié)果，5種黃顙魚間遺傳相似系數(shù)范圍為0.500～1.000，這說明黃顙魚屬各物種間具有較大的遺傳差異性。其中，不同物種間遺傳相似系數(shù)低，同一物種間遺傳相似系數(shù)高，說明親緣關(guān)系近。根據(jù)材料間的遺傳相似系數(shù)對黃顙魚屬進行聚類分析，在遺傳相似系數(shù)為0.50水平時，可將瓦氏黃顙魚與其他物種區(qū)分開；在遺傳相似系數(shù)為0.56水平時，可明確地將光澤黃顙魚與其他3個物種區(qū)分開來；在遺傳相似系數(shù)為 0.64 的水平下，可將普通黃顙魚與長須黃顙魚、中間黃顙魚分開；隨后在0.72水平時，長須黃顙魚和光澤黃顙魚分為2類。綜合來說，供試的黃顙魚屬5個物種相似系數(shù)不高，遺傳距離相對較遠(yuǎn)，分屬于不同種。19對SRAP引物所構(gòu)成的各物種的特異性譜系，能夠為黃顙魚屬各物種提供更準(zhǔn)確的分子水平上的鑒定。

3討論

SRAP作為一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，不需要像RAPD、SSR標(biāo)記那樣花費大量人力和時間進行引物設(shè)計開發(fā)，重復(fù)試驗結(jié)果穩(wěn)定，PCR擴增所需求的DNA質(zhì)量要求低，最為重要的一點是SRAP標(biāo)記穩(wěn)定且多態(tài)性可與AFLP標(biāo)記相媲美[11-12]。本試驗利用了19對SRAP引物對黃顙魚屬進行遺傳多樣性研究，結(jié)果顯示5種黃顙魚遺傳多樣性處于較高水平。相對于其他幾個物種而言，中間黃顙魚的多樣性指數(shù)偏低，原因可能是廣州西江采樣點為經(jīng)濟高度發(fā)達區(qū)域，環(huán)境污染、過度捕撈等人為干擾比較嚴(yán)重，而其余4個物種都采于生態(tài)環(huán)境較好的鄱陽湖，物種受到破壞程度相對較小[13]。

對196個擴增條帶構(gòu)建的各物種特異性譜系，雖然能夠用于對黃顙魚屬幼苗和幼魚的鑒別，但是由于SRAP引物擴增出的條帶較多，需通過多對引物擴增檢測才能對黃顙魚屬進行區(qū)分，這將浪費大量人力、物力，如果將SRAP轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記能夠克服這一缺點[14-17]。丁煒東等通過SRAP方法對3種草魚基因組進行分析，設(shè)計了3對SCAR引物，其中SCAR1能夠區(qū)分人工養(yǎng)殖和野生草魚種群[18]。由此可見，將SRAP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記后，其特異性和穩(wěn)定性均大幅度提高，可以更方便快捷地應(yīng)用于相似物種的鑒定。

鲿科魚類的分類系統(tǒng)一直比較混亂，在屬的劃分上還存在許多爭議，黃顙魚屬亦如此。肖調(diào)義等對洞庭湖4種黃顙魚的生態(tài)學(xué)特征和遺傳多樣性的RAPD分析結(jié)果表明，長須黃顙魚與瓦氏黃顙魚具有較近的親緣關(guān)系，而光澤黃顙魚與普通黃顙魚關(guān)系較近[19]，與本研究結(jié)果相反。SRAP聚類結(jié)

果表明普通黃顙魚和長須黃顙魚關(guān)系相近，光澤黃顙魚與瓦氏黃顙魚關(guān)系相近，這與丁言偉對黃顙魚屬分子系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果[20]相近；與趙哲霞等的SSR分析結(jié)果[9]略有不同，主要原因可能在于普通黃顙魚和瓦氏黃顙魚之間的位置調(diào)換了，各物種種內(nèi)遺傳差異與SSR分析相比較小。其可能的原因在于SSR引物設(shè)計是根據(jù)普通黃顙魚相關(guān)序列設(shè)計的，擴增出來的多態(tài)性條帶相對于其他物種較多；而SRAP分子標(biāo)記是通過獨特的引物設(shè)計對ORFs進行擴增。

基因組DNA不同區(qū)域進化速率相差很大，而分子標(biāo)記是根據(jù)特定序列設(shè)計引物進行擴增檢測來解決所研究物種的親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)生，結(jié)果肯定存在差別。至于選取那種方法得出的結(jié)論最準(zhǔn)確、具有更高的可信性都還沒有定論，需要之后進一步研究比較。

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