張曉瓊++喬琳++胡利宗++廖立冰++王秋霞++解恒昌++周琳

摘要：二脂酰甘油?；D移酶Ⅱ（DGAT2）是催化三酰甘油生物合成的關鍵酶，利用生物信息學手段在二倍體棉花和6種模式植物中共鑒定出25個DGAT2基因，詳細剖析這些基因的結構、序列和進化特征。基因結構分析表明，絕大多數(shù)植物包含8個或9個外顯子，且內含子相位高度保守，說明該基因結構起源于陸生植物。蛋白序列分析顯示，核心保守基序1、2、3與功能結構域相互重疊，說明功能結構域起源于藻類植物。進化分析顯示：在棉花中，DGAT2基因發(fā)生特異性擴增，其分子機制為串聯(lián)重復；結合滑動窗口方法和位點模型選擇壓力檢測結果，DGAT2蛋白均受制于負選擇作用。這些結果為棉花及模式植物DGAT2的功能研究提供幫助。

關鍵詞：二酰甘油酰基轉移酶；保守基序；棉花；模式植物；進化

中圖分類號： S562.03；Q78文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0069-04

收稿日期：2015-08-28

基金項目：周口師范學院高層次人才科研啟動經(jīng)費（編號：ZKNU2014109）；周口師范學院大學生科研創(chuàng)新基金（編號：ZKNUD15037）。

作者簡介：張曉瓊（1991—），女，河南安陽人，碩士研究生，主要從事植物遺傳學研究。E-mail：zxqxiaoqiong00@163.com。

通信作者：胡利宗，博士，副教授，主要從事植物遺傳學研究。E-mail：hulizong@126.com。二酰甘油?；D移酶（DGAT，EC 2.3.1.20）是催化三酰甘油（TAG）合成最后一步的關鍵酶[1]。目前，在植物中存在3種類型的DGAT，即DGAT1、DGAT2和DGAT3[2]。前人研究表明，DGAT1、DGAT2和DGAT3隸屬于不同基因家族，其蛋白序列相似性極低，但三者均具有二脂酰甘油酰基轉移酶活性，過表達這些基因均可不同程度提高植物種子含油量[3]。前人研究顯示，DGAT酶參與種子油脂合成、種子萌發(fā)與發(fā)育以及幼苗發(fā)育等眾多生物學過程，具有多樣化的功能[4]。自Lardizabal等成功克隆MrDGAT2基因以來，在人類、擬南芥和藻類等物種中均克隆出DGAT2基因[5-7]。DGAT2基因功能研究顯示，DGAT2基因具有底物特異性，優(yōu)先利用特殊脂肪酸進行三酰甘油合成[8]。因此，DGAT2基因的相關研究越來越受到人們的重視。棉花不僅是一種重要的經(jīng)濟作物，還是天然纖維與油料作物。雖然在棉花纖維發(fā)育、纖維品質以及抗逆性等方面開展了許多研究，但棉花DGAT2基因的研究仍未見報道。此外，二倍體雷蒙德氏棉[9]和亞洲棉[10]全基因組序列測定已經(jīng)被完成，這為在棉花中研究DGAT2基因提供了數(shù)據(jù)資源。利用生物信息學手段鑒定棉花DGAT2基因，并剖析這些基因的結構、保守基序、功能結構域以及系統(tǒng)進化關系。這些結果能為闡明棉花油脂積累的分子機制奠定基礎，為進一步研究棉花DGAT2基因的功能提供線索。

1材料與方法

1.1物種抽樣與基因序列下載

本研究涉及的物種包括亞洲棉、雷蒙德氏棉和其他6種模式植物。序列下載步驟為：在NCBI數(shù)據(jù)庫直接檢索并下載已知的DGAT2基因序列，以這些序列為檢索序列，利用BLAST工具在默認參數(shù)條件下分別搜索相關數(shù)據(jù)庫CottonGen（http：//www.cottongen.org/）、Greenphyl V4（http：//www.greenphyl.org/cgi-bin/index.cgi）和Phytozome V9.1（http：//www.phytozome.net/），最終獲取棉花及其他模式植物的DGAT2基因。并利用Pfam工具[11]確定這些基因是否含有DAGAT（PF03982）。

1.2序列特征與蛋白特性分析

通過DNA和cDNA的比較，棉花與模式植物DGAT2基因外顯子和內含子的組織結構模式被鑒定，由GSDS 2.0工具繪制[12]。MEME服務器被用于剖析棉花與模式植物DGAT2蛋白的保守基序組成模式，參數(shù)設置如下：保守基序氨基酸長度為6～180 bp；保守基序數(shù)目最大值為10；E閾值為 0.000 01，其他參數(shù)默認[13]。此外，利用HMMTOP工具剖析DGAT2蛋白的跨膜結構域的數(shù)目與位置[14]。

1.3系統(tǒng)進化與選擇壓力檢測

為闡明DGAT2蛋白的系統(tǒng)進化關系，利用Clustal X軟件[15]在默認條件下對DGAT2蛋白進行序列比對，其比對結果直接導入MEGA軟件[16]中，輸出進化樹并進行細微調整。在進化樹的末端，可鑒定出同源基因對，同時基于滑動窗口方法剖析同源基因對的選擇壓力，其計算由DnaSP 5.10完成，參數(shù)設置為：滑動窗口100 bp和步長10 bp[17]。此外，利用Pal2nal工具準備所有DGAT2基因的密碼子比對序列[18]，利用位點特異模型對DGAT2基因進行選擇壓力分析，其計算過程由PAML 3.15軟件包中的CODEML程序完成[19]。

2結果與分析

2.1棉花與模式植物DGAT2鑒定與蛋白序列特征

利用Blast工具在2種棉花與6種模式植物中共鑒定出25個DGAT2基因，這些基因的位點標識符、染色體、正負鏈位置以及基因組匹配區(qū)段均被列出（表1）。功能結構域分析表明，DGAT2基因編碼的蛋白均具有典型的功能結構域DAGAT（PF03982）。聚類分析顯示，2種棉花DGAT2與擬南芥和水稻DGAT2聚在一起形成了一個雙子葉植物類群；低等植物DGAT2傾向于聚為一類，但有些低等植物DGAT2蛋白單獨形成一個分支（圖1-A）。此外，利用HMMTOP工具分析DGAT2蛋白的跨膜結構，結果顯示，除PaDGAT2c外，棉花與模式植物DGAT2蛋白均具有至少1個跨膜結構域（表1）。

利用MEME軟件對DGAT2蛋白的保守基序進行分析，結果表明，在25個棉花和模式植物DGAT2蛋白中存在10個保守基序（Motif1～10），共形成13種保守基序組織模式，其中6個棉花DGAT2蛋白共享的保守基序組成模式為 Motif4-6-2-1-3，而AtDGAT2、OsDGAT2a/b和PpDGAT2d等共享的保守基序模式為Motif9-6-2-1-3（圖1-B）。就單個保守基序而言，所有DGAT2蛋白保守基序被分為兩大類型，即種屬普遍類型和種屬特異類型。保守基序1、2、3、6、9幾乎存在于所有DGAT2蛋白中，屬于種屬普遍類型；但保守基序4、5、7、8、10表現(xiàn)出不同程度的種屬特異性，屬于種屬特異類型。此外，DGAT2蛋白的DAGAT（PF03982） 功能結構域與保守基序1、2、3、6、9相互重疊，這說明植物的5個保守基序均可能與DGAT2活性高度相關。

2.2棉花與模式植物DGAT2基因的外顯子與內含子組成模式

通過比較DNA與CDS序列，棉花與模式植物DGAT2基因的結構特點均被闡明，并鑒定其內含子相位。根據(jù)外顯子數(shù)目，這些DGAT2基因結構被分為三大類型：（1）8個外顯子類型，這種類型的基因包括GrDGAT2a、GrDGAT2d和AtDGAT2等5個基因；（2）9個外顯子類型，這種類型的基因包括GrDGAT2b、GaDGAT2a和OsDGAT2a等11個基因；（3）2、3、5、6、7、13個或14個外顯子類型，這類基因包括CrDGAT2a、PpDGAT2b和PaDGAT2c等9個基因（圖1-C）。結合DGAT2蛋白聚類結果可知，位于同一進化分支的基因往往具有相同或相似的基因結構，甚至外顯子和內含子長度、內含子相位具有高度保守性；棉花DGAT2蛋白聚為一類，具有高度相似的基因結構，并且這些基因的內含子相位高度保守；此外，有些物種DGAT2蛋白單獨形成一個分支，具有獨特的基因結構如PaDGAT2d、CrDGAT2a和PaDGAT2b，它們分別擁有2、6、5個外顯子，并且其內含子相位變異較大?？傊藁ㄅc模式植物DGAT2基因的結構多數(shù)以8個或9個外顯子形式存在，尤其是在高等植物中該基因的結構具有較高的保守性。

2.3棉花與模式植物DGAT2基因的系統(tǒng)進化關系

在構建棉花與模式植物DGAT2基因的進化樹前，移走覆蓋度低于80%、相似度低于30%的序列，進而構建由亞洲棉、雷蒙德氏棉和水稻等8種植物的14個DGAT2蛋白形成的進化樹。系統(tǒng)進化分析表明，藻類植物CrDGAT2a蛋白單獨形成1個進化分支，與其他植物具有較遠的親緣關系；其他苔蘚類、蕨類、裸子與被子植物DGAT2蛋白明顯被分為2個進化分支，其中被子植物DGAT2蛋白形成1個進化分支，蘚類、蕨類和裸子植物DGAT2形成另一個進化分支（圖2）。此外，在進化樹末端分支上，存在4對同源基因，其中2對屬于直系同源基因，2對屬于旁系同源基因；旁系同源基因包括GaDGAT2b/GaDGAT2c和OsDGAT2a/OsDGAT2b，它們起源于物種特異的基因擴增；直系同源基因包括GrDGAT2c/GaDGAT2d和GaDGAT2a/GrDGAT2d，它們起源于物種分化事件（圖2）。

2.4基于同源對水平的棉花與模式植物DGAT2基因的選擇壓力

為考察進化樹末端的4對同源基因之間是否經(jīng)歷適應性進化，本研究利用DnaSP 5.10軟件對4對DGAT2同源基因進行滑動窗口分析，參數(shù)設置：窗口尺寸為100 bp，步移長度為10 bp。結果顯示，4對同源基因的ω平均值從大到小為044（GrDGAT2d/GaDGAT2a）>0.31（GaDGAT2b/GaDGAT2c）>016（OsDGAT2b/OsDGAT2a）>0.15（GaDGAT2d/GrDGAT2c）。就旁系同源基因而言，亞洲棉旁系基因對GaDGAT2b/GaDGAT2c和水稻旁系同源基因對OsDGAT2b/OsDGAT2a的每個步移窗口對應的進化速率具有異質性，但所有的步移窗口的ω值均小于1，這充分說明這2對旁系同源基因均受控于負選擇作用，也揭示了基因重復之后并未發(fā)生適應性進化（圖3-A）。同理，在2種棉花物種中，直系同源基因對GrDGAT2d/GaDGAT2a 和GaDGAT2d/GrDGAT2c的ω均不大于1，這說明物種分化產(chǎn)生重復基因受到負選擇作用，這可能與功能限制密切相關（圖3-B）。

2.5基于類群水平的棉花與模式植物DGAT2基因的選擇壓力

以亞洲棉、雷蒙德氏棉和水稻等8種植物的14個DGAT2基因為研究對象，利用位點模型對DGAT2基因進行選擇壓力檢測，鑒定出正選擇位點，并利用貝葉斯后驗概率推斷每個正選擇位點概率值。似然比檢驗表明，2ΔlnL=271.62>13277（M0/M3），這說明M3極顯著優(yōu)于M0（P<0.01），因此，這些DGAT2蛋白位點間的進化速率明顯具有異質性；就M2a和M1a比較而言，似然比檢驗值2ΔlnL=0<5.991，說明M2a并不優(yōu)于M1a模型，DGAT2基因可能未經(jīng)歷適應性進化；同理，2ΔlnL=0<5.991（M7/M8），說明M8模型并不優(yōu)于M7模型，進而可推知棉花與模式植物DGAT2基因中并沒有鑒定到正選擇氨基酸位點（表2）。結合似然比測驗和貝葉斯推斷分析可知，棉花與模式植物DGAT2基因均受制于負選擇作用，這意味著DGAT2具有高度保守性，這可能與嚴格的功能限制相關。

3結論與討論

DGAT2基因廣泛存在于真菌、藻類、植物和動物基因組中，尤其是在藻類植物中通常以多拷貝形式存在[1，3，20-21]，這說明DGAT2基因起源較早，是一個古老的基因家族。與藻類植物相比，被子植物中DGAT2基因數(shù)目較少，絕大多數(shù)物種僅包括1個或2個成員。但令人感興趣的是，在2種二倍體棉花中均發(fā)現(xiàn)了4個DGAT2基因，并且在2種二倍體棉花中DGAT2基因均以串聯(lián)重復方式排列在同一個染色體區(qū)段內，這說明棉花DGAT2基因發(fā)生了物種特異性串聯(lián)重復?；蚪Y構和蛋白保守基序分析顯示，所有物種DGAT2序列特征具有較高的多樣性，但在被子植物中DGAT2基因的結構與蛋白基序均表現(xiàn)出高度保守性，這說明被子植物DGAT2蛋白受到嚴格的功能限制，具有高度相似的生物學功能，這與前人的研究結果[21-22]基本一致。此外，水稻和棉花的DGAT2同源基因對選擇壓力檢測顯示，同源基因對分化后并沒有發(fā)生適應性進化。同時，基于位點模型對DGAT2蛋白進行選擇壓力分析，結果表明植物的14個DGAT2蛋白均受控于負選擇作用，受到嚴格的功能限制作用[21]?？傊扼w棉花基因組中存在4個DGAT2基因，這些基因呈現(xiàn)串聯(lián)重復特征，并且棉花DGAT2基因受純凈選擇作用，這與其功能重要性密切相關。這些結果揭示了DGAT2基因的序列特征與進化關系，為其功能研究提供了理論基礎。

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