朱峰++陳孝仁++錢坤++紀(jì)兆林++孔維文++楊益眾

摘要：植物NAC1轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物的抗生物脅迫反應(yīng)中起著重要的作用。為探究生物逆境相關(guān)NAC1轉(zhuǎn)錄因子的功能，通過生物信息學(xué)的方法對8個生物逆境脅迫相關(guān)NAC1蛋白氨基酸序列一致性、氨基酸組成、理化性質(zhì)、親/疏水性、保守結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點、亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了預(yù)測和分析。結(jié)果表明，8個生物逆境脅迫相關(guān)NAC1蛋白N-端保守性較強(qiáng)，包括5個保守的亞結(jié)構(gòu)域，共同組成NAC1結(jié)構(gòu)域。C-端含有多個保守的氨基酸，具有轉(zhuǎn)錄激活功能。同時蛋白中含有多個絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）和酪氨酸（Y）磷酸化位點。8個NAC1蛋白都為親水性蛋白，大多定位于細(xì)胞核，個別定位于細(xì)胞質(zhì)或葉綠體。二級結(jié)構(gòu)則以α-螺旋和β-折疊為主。8個NAC1蛋白三維結(jié)構(gòu)上的相似性暗示了功能上存在相似。本研究結(jié)果為進(jìn)一步挖掘生物逆境相關(guān)NAC1轉(zhuǎn)錄因子的功能和改良植物抗生物逆境特性提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：生物脅迫；NAC1轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)；抗生物逆境特性

中圖分類號： Q78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）10-0043-06

收稿日期：2016-04-14

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31500209）；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項目（編號：15KJB210007）；江蘇省揚州市自然科學(xué)基金-青年科技人才項目（編號：YZ2015106）。

作者簡介：朱峰（1985—），男，江西九江人，博士，講師，主要從事植物病理與分子生物學(xué)研究。E-mail：zhufeng@yzu.edu.cn。

[ZK）]

NAC（NAM/ATAF/CUC）轉(zhuǎn)錄因子家族是目前發(fā)現(xiàn)的最大的一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在其他真核生物中尚未發(fā)現(xiàn)該家族成員[1-2]。NAC家族的命名源于矮牽牛（Petunia hybrida）NAM（no apical meristem）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）[WTBX][STBX]ATAF1、ATAF2[WTBZ][STBZ]以及[WTBX][STBX]CUC2[WTBZ][STBZ]（cup-shaped cotyledon）基因[3-4]。研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子具有多種功能，在植物的生長發(fā)育、器官建成、激素信號應(yīng)答及逆境脅迫中均發(fā)揮重要的作用，已成為當(dāng)前植物基因功能及表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究中的熱點[2，5-6]，如枝頂端分生組織發(fā)育[7]、植物的衰老[8-10]、細(xì)胞分裂[11]、植物激素調(diào)控與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[12-13]和參與生物脅迫中植物的防御反應(yīng)[14-16]等。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是一個龐大的家族，大量的NAC基因被識別，其中在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)117個NAC基因，水稻中發(fā)現(xiàn)151個NAC基因，葡萄中發(fā)現(xiàn)79個NAC基因，煙草中發(fā)現(xiàn)152個NAC基因[17]。越來越多的研究表明了NAC1基因在調(diào)控植物的抗生物脅迫反應(yīng)起著重要的作用。辣椒[WTBX][STBX]CaNAC1[WTBZ][STBZ]在細(xì)菌性斑點病菌侵染后快速誘導(dǎo)，而且非寄主病菌侵染和抗病信號分子SA和ET處理后也能誘導(dǎo)[WTBX][STBX]CaNAC1[WTBZ][STBZ]強(qiáng)烈的表達(dá)[18]。先前的研究表明假單胞桿菌可以誘導(dǎo)番茄[WTBX][STBX]SlNAC1[WTBZ][STBZ]基因的表達(dá)[19]，進(jìn)一步研究表明番茄[WTBX][STBX]SlNAC1[WTBZ][STBZ]在調(diào)控植物抗性抵抗假單胞桿菌侵染起著重要的作用，并且番茄[WTBX][STBX]SlNAC1[WTBZ][STBZ]和本生煙[WTBX][STBX]NbNAC1[WTBZ][STBZ]有高度的同源性，抑制[WTBX][STBX]NbNAC1[WTBZ][STBZ]，削弱植物的抗性，增加本生煙對假單胞桿菌的敏感性[20]。葡萄[WTBX][STBX]VvNAC1[WTBZ][STBZ]基因調(diào)控葡萄的防御反應(yīng)應(yīng)答壞死型和活體營養(yǎng)型病原菌的入侵，在擬南芥中過量表達(dá)[WTBX][STBX]VvNAC1[WTBZ][STBZ]基因可以增強(qiáng)植物對壞死型和活體營養(yǎng)型病原菌的入侵，并且防御相關(guān)的植物激素（如SA、MeJA、ABA和乙烯）可以誘導(dǎo)葡萄[WTBX][STBX]VvNAC1[WTBZ][STBZ]基因的表達(dá)[21]。在大麥中過量表達(dá)[WTBX][STBX]HvSNAC1[WTBZ][STBZ]基因能夠增強(qiáng)大麥對鐮刀菌的抗性，減輕葉斑病癥狀[22]。一些研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在應(yīng)答病毒入侵時也起著一定的作用。番茄曲葉病毒（tomato leaf curl virus，TLCV）能夠誘導(dǎo)番茄[WTBX][STBX]SlNAC1[WTBZ][STBZ]基因的表達(dá)，并且該病毒編碼的Ren（geminiviral replication enhancer）蛋白能與[WTBX][STBX]SlNAC1[WTBZ][STBZ]蛋白相互作用，過量表達(dá)SlNAC1后可以加速TLCV的DNA積累[23]。

因此本研究將通過生物信息學(xué)的方法對生物逆境脅迫相關(guān)的普通煙[WTBX][STBX]NtNAC1[WTBZ][STBZ]、番茄[WTBX][STBX]SlNAC1[WTBZ][STBZ]、擬南芥[WTBX][STBX]AtATAF1[WTBZ][STBZ]、辣椒[WTBX][STBX]CaNAC1[WTBZ][STBZ]、大麥[WTBX][STBX]HvSNAC1[WTBZ][STBZ]、小麥[WTBX][STBX]TaNAC1[WTBZ][STBZ]、水稻[WTBX][STBX]OsNAC1[WTBZ][STBZ]和葡萄[WTBX][STBX]VvNAC1[WTBZ][STBZ]轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)、等電點、親/疏水性、序列一致性、磷酸化位點、保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)和蛋白三維結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測和比較分析，旨在為進(jìn)一步挖掘生物逆境相關(guān)NAC1轉(zhuǎn)錄因子的功能和改良植物抗生物逆境特性提供理論支持。

1材料與方法

1.1材料

從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GenBank上下載普通煙[WTBX][STBX]NtNAC1[WTBZ][STBZ]、番茄[WTBX][STBX]SlNAC1[WTBZ][STBZ]、擬南芥[WTBX][STBX]AtATAF1[WTBZ][STBZ]、辣椒[WTBX][STBX]CaNAC1[WTBZ][STBZ]、大麥[WTBX][STBX]HvSNAC1[WTBZ][STBZ]、小麥[WTBX][STBX]TaNAC1[WTBZ][STBZ]、水稻[WTBX][STBX]OsNAC1[WTBZ][STBZ]和葡萄[WTBX][STBX]VvNAC1[WTBZ][STBZ]轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列。

1.2NAC1蛋白氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列一致性分析。利用在線程序Clustal Omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行氨基酸多重序列比對。利用MEGA 5.0軟件[24]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，采取遺傳距離建樹法的相鄰連接法（neighbor-joining，NJ）建樹，對構(gòu)建的樹進(jìn)行自檢（bootstrap），重復(fù)設(shè)定為1 000。

1.3NAC1蛋白一級結(jié)構(gòu)及理化特性分析

利用在線程序ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析[25]。利用在線程序ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行氨基酸疏水性分析，利用NetPhos 2.0 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進(jìn)行蛋白磷酸化位點修飾分析[26]。

1.4NAC1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位分析

[JP2]利用在線程序SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測α-螺旋（alpha helix）、β-折疊（extended strand）、β-轉(zhuǎn)角（beta turn）、無規(guī)卷曲（random coil）等蛋白二級結(jié)構(gòu)。利用在線程序WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位[27]。

1.5NAC1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SWISS-MODEL workspace （http：//swissmodel.expasy.org/workspace/） 對蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模擬[28]。其中[WTBX][STBX]SlNAC1、CaNAC1、AtATAF1 TaNAC1、NtNAC1、OsNAC1和HvSNAC1[WTBZ][STBZ]的模板PDB號都是3ulxA，VvNAC1的模板PDB號是1ut7B。然后通過UCSF Chimera軟件將蛋白三維結(jié)構(gòu)讀取出來[29]。

2結(jié)果與分析

2.1NAC1蛋白氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

通過DNAMAN軟件對這8個生物逆境脅迫相關(guān)NAC1蛋白氨基酸序列的一致性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們的氨基酸序列一致性為46.52%。進(jìn)一步通過在線程序Clustal Omega對它們進(jìn)行多重序列比對，尋找NAC1中的保守區(qū)域。如圖1所示，8個生物逆境脅迫相關(guān)NAC1轉(zhuǎn)錄因子在氨基酸序列N-端保守性較強(qiáng)，其結(jié)構(gòu)域由高度保守的約150個氨基酸殘基組成。C-端氨基酸則具有高度的多樣性，但C-端仍有幾個較為保守的氨基酸，如酪氨酸（Y）、亮氨酸（L）、纈氨酸（V）、絲氨酸（S）。利用MEGA 5.0軟件對這8個生物逆境脅迫相關(guān)NAC1蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖2所示，SlNAC1和CaNAC1親緣關(guān)系最近，和AtATAF1親緣關(guān)系稍近，與 NtNAC1 的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。[FL）]

[FK（W33][TPZF1.tif][FK）]

[FK（W8][TPZF2.tif][FK）]

2.2NAC1蛋白理化性質(zhì)及親疏水性分析

利用在線程序ProtParam預(yù)測NAC1蛋白的理化性質(zhì)（表1），結(jié)果表明，NtNAC1、OsNAC1、SlNAC1和CaNAC1為穩(wěn)定蛋白，而TaNAC1、VvNAC1、HvSNAC1和AtATAF1為不穩(wěn)定蛋白。由預(yù)測的等電點可知，生物逆境脅迫相關(guān)NAC1蛋白中堿性等電點居多，如NtNAC1、SlNAC1、CaNAC1、TaNAC1和VvNAC1，也有酸性等電點，如OsNAC1、HvSNAC1、AtATAF1。從蛋白組成可以看出，NtNAC1中精氨酸（Arg）含量最高，TaNAC1中亮氨酸（Leu）含量最高，OsNAC1和HvSNAC1中丙氨酸（Ala）含量最高，VvNAC1和AtATAF1中脯氨酸（Pro）含量最高，SlNAC1和CaNAC1中賴氨酸（Lys）含量最高。

另外由表1可以看出，8個生物逆境脅迫相關(guān)NAC1蛋白的親水性平均系數(shù)都為負(fù)值，說明它們都是親水性蛋白，其中SlNAC1的親水性平均系數(shù)最小，說明SlNAC1蛋白的親水性最強(qiáng)。為了進(jìn)一步證實NAC1蛋白都屬于親水性蛋白，利用在線程序ProtScale對8個生物逆境脅迫相關(guān)NAC1蛋白進(jìn)行疏水性/親水性預(yù)測（圖3）。根據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)和分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律，介于+0.5至-0.5之間

的主要為兩性氨基酸，從整體來看，這8個生物逆境脅迫相關(guān)NAC1蛋白氨基酸的分值為負(fù)值，也就說明了它們都為親水性蛋白。從圖3還可以看出，SlNAC1蛋白氨基酸整體上的分值是最低的，說明了SlNAC1蛋白的親水性最好。這也證實了在線程序ProtParam預(yù)測8個生物逆境脅迫相關(guān)NAC1蛋白都為親水性蛋白的結(jié)果。其中在SlNAC1多肽鏈中第252位的谷氨酸（Glu）具有最低分值為-3.122，親水性最強(qiáng)，第44位的異亮氨酸（Ile）具有最高分值2.389，疏水性最強(qiáng)。

2.3NAC1蛋白磷酸化分析

蛋白質(zhì)合成后，化學(xué)修飾是一種對其活性進(jìn)行調(diào)節(jié)的重要形式。因此對氨基酸序列翻譯后修飾的預(yù)測和分析可以為認(rèn)識蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位以及推測蛋白功能提供重要的幫助。蛋白質(zhì)磷酸化（protein phosphorylation）是生物界最普遍也是最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾。蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化是原核和真核生物細(xì)胞表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對許多生物的細(xì)胞功能起開關(guān)調(diào)控作用。如蛋白激酶C的磷酸化對于基因表達(dá)、細(xì)胞分化、機(jī)體代謝和增殖起著重要的作用。其中蛋白磷酸化主要有氨基酸序列中蘇氨酸（T）、酪氨酸（Y） 和絲氨酸（S）的磷酸化。因此利用NetPhos 2.0 Server在線程序?qū)@8個NAC1蛋白氨基酸磷酸化位點進(jìn)行了預(yù)測。生物逆境脅迫相關(guān)NAC1蛋白的磷酸化位點數(shù)量如表2所示。結(jié)果顯示，這8個生物逆境脅迫相關(guān)NAC1蛋白中絲氨酸磷酸化位點最多。

2.4NAC1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋、 β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等。如表3所示，通過在線程序SOPMA的預(yù)測，結(jié)果表明，生物逆境脅迫相關(guān)NAC1蛋白中無規(guī)卷曲的比例較高（38.66%～54.33%），它具有連接其他二級結(jié)構(gòu)元件的作用；此外的主要二級結(jié)構(gòu)元件有α-螺旋（18.69%～32.80%）和β-折疊（14.63%～24.57%）。生物逆境脅迫相關(guān)NAC1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測見圖4，它們在二級結(jié)構(gòu)上也具有較高的相似性。尤其是SlNAC1和CaNAC1中的二級結(jié)構(gòu)（如α-螺旋和β-折疊）出現(xiàn)的氨基酸殘基的位置比較相近，同樣[WTBX][STBX]OsNAC1和HvSNAC1[WTBZ][STBZ]中的二級結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的氨基酸殘基的位置也很相近。

利用在線程序WOLF PSORT分別對8個NAC1成員蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，結(jié)果以得分形式表現(xiàn)。結(jié)果（表4）表明，TaNAC1定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性較大，CaNAC1定位于葉綠體的可能性較大，其余蛋白定位于細(xì)胞核，這也從側(cè)面表明了這些轉(zhuǎn)錄因子的存在及其發(fā)揮功能的場所主要是細(xì)胞核。

2.5NAC1蛋白三維結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析對理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能

3討論與結(jié)論

植物轉(zhuǎn)錄因子的研究不僅是當(dāng)前生物科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點，而且是功能基因組學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。大量研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用[2]，而且也參與植物對干旱、高鹽、低溫等非生物和病原菌侵染等生物脅迫的抗逆反應(yīng)、激素信號途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)、機(jī)體的凋亡等方面[2，5-6]。越來越多的研究表明，[WTBX][STBX]NAC1[WTBZ][STBZ]基因在調(diào)控植物的抗生物脅迫（如細(xì)菌、真菌、病毒的侵染）方面起著重要的作用。因此本研究重點針對[WTBX][STBX]NAC1[WTBZ][STBZ]基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

氨基酸序列比對結(jié)果表明NAC1轉(zhuǎn)錄因子在N-端保守性非常強(qiáng)，其結(jié)構(gòu)域可以分為5個亞結(jié)構(gòu)域。研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子C-端富含酸性氨基酸、谷氨酰胺和脯氨酸等氨基酸時，一般是轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域[30-32]。本研究比對結(jié)果顯示，生物逆境脅迫相關(guān)NAC1轉(zhuǎn)錄因子的C-端氨基酸組成比較符合這個特征，推測參與轉(zhuǎn)錄激活。近年來，關(guān)于核定位信號 （nuclear localization signal，NLS）的研究已經(jīng)越來越深入，大致可分為以下3類[33]：（1）單一型（monopartite）NLS。這種NLS最初發(fā)現(xiàn)存在于猿猴病毒40的大T抗原中，包含7個氨基酸（PKKKRKV）的短肽[34]。單一型NLS一般是由4～8個氨基酸組成的短肽，富含帶正電荷的Lys-和Arg-，通常還含有Pro。（2）雙分型（bipartite）NLS。這種NLS是由2簇堿性氨基酸組成，中間是由10～12個非保守性氨基酸分隔而形成的序列。研究表明雙向的信號可能是標(biāo)準(zhǔn)的NLS[35]。Nogueira等發(fā)現(xiàn)SsNAC23包含1個雙向的核定位信號[36-37]。（3）其他類型NLS。除上述2類典型的NLS外，還有一些沒有特定序列特征的NLS，它們主要存在于可在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間穿梭的蛋白質(zhì)中。本研究中8個生物逆境脅迫NAC1轉(zhuǎn)錄因子大多定位于細(xì)胞核，由亞細(xì)胞定位的結(jié)果可以推斷，具有相近生物學(xué)功能的NAC1蛋白可能定位于相同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

對這些生物逆境脅迫NAC1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析進(jìn)一步得知這些蛋白均屬于親水蛋白，但他們在親水程度方面存在差異。SlNAC1蛋白的親水性最強(qiáng)，表明SlNAC1蛋白更易水解。蛋白三維結(jié)構(gòu)與其生物學(xué)功能息息相關(guān)[38]。通過SWISS-MODEL workspace 對NAC1蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模擬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SlNAC1、CaNAC1和AtATAF1結(jié)構(gòu)相似，包含A鏈和B鏈，各自形成1個對稱的同源二聚體。目前，已有研究通過晶體衍射的方法將擬南芥ANAC蛋白和水稻脅迫響應(yīng)NAC1蛋白的結(jié)構(gòu)解析出來。結(jié)果證實它們的晶體結(jié)構(gòu)為1個對稱的同源二聚體，并且每個單體包含6個反向平行的β-折疊和3個α-螺旋[39-40]?？傮w來看，8種成員的二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲具有較高的保守性。這也從某種程度上反映了它們在三級結(jié)構(gòu)上的相似性以及生物學(xué)功能的相似性。

綜上所述，NAC1轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的序列將直接影響到NAC1蛋白的親水性、疏水性、亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)的形成等，進(jìn)而影響NAC1蛋白的生理功能。因此本研究應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對已知蛋白序列NAC1進(jìn)行序列比對、分析、推斷和預(yù)測其結(jié)構(gòu)和功能，為進(jìn)一步挖掘生物逆境相關(guān)NAC1轉(zhuǎn)錄因子的功能和改良植物抗生物逆境特性提供理論依據(jù)。

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