王建軍，馮莉赟，申虎飛，劉 佼

（山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院隰縣農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，山西隰縣041399）

超聲波輔助的植物轉(zhuǎn)化方法的研究進(jìn)展

王建軍，馮莉赟，申虎飛，劉 佼

（山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院隰縣農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，山西隰縣041399）

為了探索超聲波處理在植物轉(zhuǎn)化中的功效及潛在發(fā)展能力，從超聲波輔助植物轉(zhuǎn)化的原理入手，歸納了方法的驗(yàn)證、超聲波處理的受體材料和超聲波處理對(duì)外源DNA的影響；總結(jié)了前人在超聲波輔助植物轉(zhuǎn)化方面的研究進(jìn)展，進(jìn)而分析了方法自身的優(yōu)缺點(diǎn)及存在問(wèn)題。指出超聲波輔助植物轉(zhuǎn)化方法雖然處于初級(jí)發(fā)展階段，但超聲波輔助的植物轉(zhuǎn)化仍然是一個(gè)操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、適用范圍廣的植物轉(zhuǎn)化方法，文中還提出了存在的問(wèn)題且給出了相應(yīng)的解決對(duì)策；通過(guò)分析認(rèn)為超聲波輔助的植物轉(zhuǎn)化方法具有廣闊的發(fā)展前景。

超聲波；輔助；植物；轉(zhuǎn)化方法

0 引言

植物轉(zhuǎn)基因研究已有30多年的歷史，自從1983年第一例轉(zhuǎn)基因煙草植物問(wèn)世以來(lái)[1]，轉(zhuǎn)基因植物的新品種培育及其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展非常迅速、趨勢(shì)向好。目前，植物轉(zhuǎn)基因的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[2]、基因槍法[3]、花粉管通道法[4]、PEG介導(dǎo)法[5]、電激穿孔法[6]、電泳法[7]、激光微束法[8]等，其中全球通用的，也是應(yīng)用較多的是前3種方法。雖然這些方法各有特點(diǎn)，并在植物轉(zhuǎn)基因研究中做出了很大貢獻(xiàn)，但這些方法仍然存在不同程度的缺陷，如有些方法過(guò)程冗長(zhǎng)、操作繁瑣，有些方法受限于植物的基因型，一些化學(xué)轉(zhuǎn)化方法可能產(chǎn)生細(xì)胞毒害，特別是一些轉(zhuǎn)化方法還需要貴重精密的設(shè)備等。為了能開(kāi)發(fā)出一種既能克服這些缺陷又能提高轉(zhuǎn)化效率的植物轉(zhuǎn)化方法，眾多學(xué)者進(jìn)行了大量的研究工作，超聲波介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法就是其中成功的一例。

超聲波是一種頻率高于20000 Hz的聲波，特點(diǎn)是直線傳播、能量大。由于其特有的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和生物學(xué)效應(yīng)等，應(yīng)用范圍十分廣闊。英國(guó)學(xué)者Rayleigh[9]于1917年發(fā)表的論文《液體中球形空穴崩潰時(shí)產(chǎn)生的壓力》為今天根據(jù)超聲波原理設(shè)計(jì)各種儀器設(shè)備并應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、工業(yè)和分子生物學(xué)研究提供了重要的理論依據(jù)。也正是基于這種理論，超聲波被用來(lái)輔助其他動(dòng)植物的轉(zhuǎn)化方法，試圖能以此來(lái)解決植物轉(zhuǎn)化過(guò)程中的基因型依賴(lài)性、轉(zhuǎn)化效率低等難題。

周光宇[4]根據(jù)遠(yuǎn)緣雜交現(xiàn)象，提出了DNA片段雜交理論，使外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞并產(chǎn)生變異后代有了理論依據(jù)。1990年許寧等[10]根據(jù)超聲波的作用原理，提出“超聲誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移”方法，并在小麥幼胚和動(dòng)物細(xì)胞上成功轉(zhuǎn)化。同年，Joersbo等[11]將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)導(dǎo)入甜菜和煙草原生質(zhì)體中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子中目的基因的瞬間表達(dá)；1991年章力健等[12]將GUS基因、卡那霉素抗性基因和NPT??基因?qū)氲綗煵萑~片小塊，得到轉(zhuǎn)化小苗，轉(zhuǎn)化率達(dá)到22.3%；1997年，Trick等[13]將超聲處理技術(shù)與農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法相結(jié)合，建立了超聲波輔助農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化方法(SAAT)，他們用此法將GUS基因?qū)氪蠖购汪菇M織中，發(fā)現(xiàn)GUS基因的平均短暫表達(dá)頻率提高100～140倍；同年王景雪等[14]報(bào)道利用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株，轉(zhuǎn)化率高達(dá)42.9%，這是關(guān)于超聲波輔助花粉介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化玉米并得到可育轉(zhuǎn)化后代的首例報(bào)道；2002年，陳定虎[15]報(bào)道將攜帶PAP基因的植物轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入玉米材料中，獲得1個(gè)轉(zhuǎn)化事件；解志紅[16]將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化棉花遠(yuǎn)緣雜交高代材料，轉(zhuǎn)化率達(dá)到32%；隨后采用超聲波輔助植物轉(zhuǎn)化方法在谷子[17]、油菜[18]、花生[19]、高粱[20]、野罌粟[21]、黃花梨[22]等植物上也有轉(zhuǎn)化成功的報(bào)道。

超聲波輔助植物轉(zhuǎn)化方法雖有操作簡(jiǎn)單、周期較短、克服了植物轉(zhuǎn)化過(guò)程中的基因型依賴(lài)性等優(yōu)點(diǎn)，但其較為突出的缺陷是不同植物、不同品種、不同的外植體都要求不同的超聲波處理強(qiáng)度、處理時(shí)間和間歇時(shí)間，具體實(shí)驗(yàn)要各自尋找最佳超聲波處理參數(shù)的組合，所以顯得較繁瑣，不能一勞永逸，加之目前所能使用的超聲波發(fā)生儀及探頭的質(zhì)量不過(guò)關(guān)，易破損，給實(shí)驗(yàn)操作帶來(lái)不必要的困擾。另外超聲波處理易導(dǎo)致受體材料的機(jī)械損傷和熱損傷，轉(zhuǎn)化效率較低。

為提高轉(zhuǎn)化效率，進(jìn)一步簡(jiǎn)化操作流程，有必要對(duì)前人的研究工作進(jìn)行總結(jié)，以便發(fā)現(xiàn)和解決轉(zhuǎn)化方法還存在的理論和技術(shù)問(wèn)題，為國(guó)內(nèi)大規(guī)模開(kāi)展轉(zhuǎn)基因研究提供技術(shù)儲(chǔ)備。

本研究就超聲波輔助的植物轉(zhuǎn)化方法的研究進(jìn)展情況予以綜述，希望能為相關(guān)領(lǐng)域的研究工作提供一些有價(jià)值的參考資料。

1 超聲波輔助植物轉(zhuǎn)化方法的原理及驗(yàn)證

超聲波輔助植物轉(zhuǎn)化的原理，關(guān)于超聲波輔助植物轉(zhuǎn)化的原理，眾說(shuō)紛紜，目前還沒(méi)有一個(gè)肯定而確切的定論。不過(guò)，大多數(shù)說(shuō)法都圍繞Rayleigh的超聲波能產(chǎn)生空化效應(yīng)的理論，認(rèn)為空化效應(yīng)是超聲波能夠輔助植物轉(zhuǎn)化的根本原因。在此基礎(chǔ)上，形成了目前較有說(shuō)服力的2個(gè)假設(shè)：（1）1980年，Zimmermann等[23]提出，假設(shè)細(xì)胞膜的實(shí)際膜厚度是由膜兩側(cè)的電壓和所施加的壓力決定的，膜被擠壓的程度取決于其的介電常數(shù)和抗壓強(qiáng)度等，并預(yù)測(cè)存在著一個(gè)可以引起細(xì)胞膜機(jī)械損傷的膜電位差，而且這個(gè)理論預(yù)期值的臨界壓力取決于假設(shè)了膜的彈性模量的壓力依賴(lài)性和固有膜電位，這就是著名的Zimmermann電場(chǎng)機(jī)制模型；1991年，Joersbo等[11]根據(jù)這個(gè)模型提出了使用溫和的超聲波輔助對(duì)植物原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的新方法，認(rèn)為在超聲波作用下，細(xì)胞膜內(nèi)的流體靜壓力引發(fā)細(xì)胞膜的可逆性破裂，從而引發(fā)細(xì)胞與周?chē)橘|(zhì)的物質(zhì)交換。（2）1997年，丁志山和沃興德[24]根據(jù)超聲波的生物學(xué)效用是由空化現(xiàn)象產(chǎn)生的，提出超聲波處理時(shí)產(chǎn)生的空化泡在破裂時(shí)會(huì)釋放出瞬時(shí)的高壓與高溫，這種高溫高壓所形成的沖擊波可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜的局部破裂，使得細(xì)胞周?chē)奈镔|(zhì)如外源DNA能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。這2種假設(shè)的共同點(diǎn)是都用超聲波處理，引起細(xì)胞膜損傷而形成物質(zhì)的跨膜交換，不同點(diǎn)是細(xì)胞膜損傷的機(jī)理不同，前者認(rèn)為細(xì)胞破裂是由于超聲波處理下，膜內(nèi)流體靜壓力發(fā)生改變所致，后者認(rèn)為是由于超聲波所產(chǎn)生的沖擊波直接損傷細(xì)胞膜。在某一轉(zhuǎn)化事件中，也可能這種原理都起一定作用。

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：路德明等[25]用超聲波處理鹽藻，發(fā)現(xiàn)超聲波強(qiáng)度大小是鹽藻細(xì)胞能否破碎的主因，一定時(shí)間范圍內(nèi)隨著作用時(shí)間的增加，鹽藻破碎率呈直線上升，最高破碎率可達(dá)80%，此后再延長(zhǎng)工作時(shí)間，鹽藻破碎率變化不大；Gambihler等[26]用超聲波處理‘L1210白血病細(xì)胞’時(shí)發(fā)現(xiàn)，超聲波處理既可減少細(xì)胞膜原有厚度，又可使細(xì)胞膜的通透性增加，這樣有益于將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞；Tachibana等[27]用0.3 W/cm2、48 kHz超聲波強(qiáng)度處理‘HL-60細(xì)胞’的懸浮液，發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度的超聲波就能使細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞膜的通透性也因而增強(qiáng)，結(jié)果便是Ara-C更容易進(jìn)入‘HL-60細(xì)胞’，細(xì)胞毒性因而得到加強(qiáng)；Parvizi等[28]在用超聲波處理大鼠軟骨細(xì)胞蛋白聚糖合成時(shí)發(fā)現(xiàn)，超聲波的空化作用增加了軟骨細(xì)胞的通透性，加速了鈣離子內(nèi)流；盧群等[29]用超聲波處理酵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲波參數(shù)為300 W的功率，工作時(shí)間3 s，間隔時(shí)間為4 s，工作30次時(shí)，透射電鏡觀察的結(jié)果是，細(xì)胞膜有不同程度的損傷，并且形成可逆小孔，即“穿孔效應(yīng)”，并認(rèn)為這是細(xì)胞膜通透性提高的主要原因。當(dāng)超聲波參數(shù)增加為功率為500 W，總作用時(shí)間為225 s，脈沖時(shí)間為3 s時(shí)，膜的損傷也嚴(yán)重一些，但細(xì)胞并沒(méi)有死亡，一定時(shí)間的自我修復(fù)后細(xì)胞又會(huì)恢復(fù)正常；姚詠嫦[30]更巧妙地選擇能生產(chǎn)1,6-二磷酸果糖(FDP)的酵母細(xì)胞作為研究對(duì)象，用超聲波處理酵母細(xì)胞后，根據(jù)細(xì)胞的生存能力和介質(zhì)中FDP濃度的變化，間接證明膜通透性的改變，用400、500、600 W功率的超聲波分別進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：600 W的超聲波功率處理時(shí)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)介質(zhì)中FDP的滲出濃度逐漸提高，在處理間隙時(shí)間為4 s時(shí)，3種處理均使介質(zhì)中FDP濃度增加，但當(dāng)間隙時(shí)間增大到6、8、10 s時(shí)，F(xiàn)DP的濃度不增反降，再延長(zhǎng)間隙時(shí)間為12 s時(shí)，F(xiàn)DP的濃度又開(kāi)始上升，同時(shí)還注意到，同樣的處理，介質(zhì)中核酸、蛋白質(zhì)濃度的變化不如FDP那么大，分析可能是因?yàn)镕DP分子比較小，更容易穿透細(xì)胞膜所致。

上述研究根據(jù)細(xì)胞顏色的變化、顯微鏡或電子顯微鏡觀察、細(xì)胞毒性分析等，取得了充分可信的證據(jù)證明超聲波處理可以增加細(xì)胞膜的通透性，為超聲波輔助植物轉(zhuǎn)基因研究提供了科學(xué)依據(jù)。目前，有關(guān)超聲波輔助植物轉(zhuǎn)化的方法有2種，一是超聲波輔助其他植物轉(zhuǎn)化方法的轉(zhuǎn)化方法，如超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、超聲波輔助花粉介導(dǎo)法等，它們以通常的轉(zhuǎn)化方法為主，輔助于超聲波處理用來(lái)提高該方法的轉(zhuǎn)化效率等；二是超聲波處理直接導(dǎo)入法，即直接將外源基因的DNA片段用超聲波處理方式導(dǎo)入到受體組織或細(xì)胞中，不需要農(nóng)桿菌介導(dǎo)等技術(shù)手段。

2 超聲波處理的受體類(lèi)型

作為超聲波處理的受體材料也是超聲波輔助轉(zhuǎn)化方法研究的主要內(nèi)容之一，因?yàn)橹参锝M織、器官或者細(xì)胞的生理年齡、基因型等與轉(zhuǎn)化效率有關(guān)，篩選易于得到、方便操作、適于轉(zhuǎn)化的材料作為處理對(duì)象是為了獲得轉(zhuǎn)化材料和提高轉(zhuǎn)化效率的有效手段。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，用作受體接受超聲波處理的植物材料有葉片、子葉、子葉節(jié)、莖段（包括莖尖）、愈傷組織、百合鱗片、胚軸、細(xì)胞（包括原生質(zhì)體、花粉、單細(xì)胞植物等）、胚（包括幼胚和成熟胚）、幼根、上表皮細(xì)胞等。不同植物品種的同一材料（如大豆葉片和煙草葉片）、同一植物品種的不同材料（如子葉、胚、莖段等），超聲波的處理強(qiáng)度、處理時(shí)間都不盡相同，選擇合適的超聲波處理參數(shù)是超聲波輔助植物轉(zhuǎn)化研究的重要任務(wù)。因?yàn)楹笪脑诮榻B研究進(jìn)展時(shí)要涉及這方面的具體內(nèi)容，故就不加詳述。

3 超聲波處理對(duì)外源DNA的影響

外源DNA的完整性也是關(guān)系到轉(zhuǎn)化成敗的關(guān)鍵因素之一。超聲波處理時(shí)所產(chǎn)生的強(qiáng)大外力直接或間接地導(dǎo)致外源DNA分子斷裂，這樣即使轉(zhuǎn)化成功，目的基因因斷裂而達(dá)不到轉(zhuǎn)化初始目的。因此在有關(guān)超聲波輔助的轉(zhuǎn)化研究中，必須選擇合適的超聲波強(qiáng)度和處理時(shí)間，以保證外源DNA分子的完整性[31-32]。

張宏等[31]在超聲波介導(dǎo)玉米愈傷組織轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，超聲波處理40 m，不同聲強(qiáng)對(duì)DNA產(chǎn)生的效果不同，聲強(qiáng)為0.5 W/cm2時(shí)，外源DNA完好無(wú)損，聲強(qiáng)上升為0.75 W/cm2時(shí)，還能看到明顯的主帶，當(dāng)聲強(qiáng)達(dá)到1.0W/cm2時(shí)，外源DNA嚴(yán)重?cái)嗔眩鲙?；Wyber等[33]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波處理不會(huì)改變質(zhì)粒DNA的狀態(tài)，如超螺旋、線性和開(kāi)環(huán)等；趙婷婷等[34]以聲強(qiáng)400 W的超聲波處理鮭魚(yú)精DNA，處理時(shí)長(zhǎng)分別為20、25、30 m，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理20 m時(shí)，鮭魚(yú)精DNA的條帶大小集中于100～250 bp，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)鮭魚(yú)精DNA被打斷，電泳條帶逐漸變寬；叢郁等[35]在應(yīng)用超聲波直接轉(zhuǎn)化法把rolC基因?qū)氚死夂Ｌ牡倪^(guò)程中發(fā)現(xiàn)，超聲波功率100 W時(shí)，質(zhì)粒DNA在30 m之內(nèi)均能保持完整，而處理40 m后發(fā)生降解；Karshafian等[36]采用超聲波介導(dǎo)輔助動(dòng)物細(xì)胞‘HTC’的基因轉(zhuǎn)化，他發(fā)現(xiàn)在超聲波處理下，分子量為10 kD～2 MD的大分子均可以導(dǎo)入受體細(xì)胞，這是首次報(bào)道外源DNA大小與轉(zhuǎn)化的關(guān)系；張瑩等[37]報(bào)道說(shuō)，最大功率的超聲波處理（未報(bào)道功率數(shù)字）質(zhì)粒DNA時(shí)，處理5 m，質(zhì)粒DNA完好無(wú)損，處理15～20 m，質(zhì)粒DNA略有降解，處理30 m時(shí)，質(zhì)粒DNA完全降解；董蓮華等[38]用功率300 W、頻率24 kHz的超聲波處理質(zhì)粒DNA，可將質(zhì)粒DNA降解為200～500 bp的小片段。

4 超聲波輔助轉(zhuǎn)化方法的研究進(jìn)展

1990—1994年，許寧等[10]根據(jù)超聲波的作用原理，提出“超聲誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移”方法，并在小麥幼胚和動(dòng)物細(xì)胞上成功轉(zhuǎn)化。由于其操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高、不受植物基因型限制等優(yōu)點(diǎn)，得到大家認(rèn)可，截至目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)超聲波輔助或超聲波直接介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化的研究已有不少報(bào)道。

4.1 超聲波介導(dǎo)的直接轉(zhuǎn)化法研究進(jìn)展

1990年，許寧等[10]利用超聲波介導(dǎo)法將GUS基因、NPT??基因?qū)胄←溣姿胝T導(dǎo)的愈傷組織，用XGluc檢測(cè)GUS活性，超聲波處理的愈傷組材料均顯藍(lán)色，而對(duì)照組不顯藍(lán)色；超聲波處理轉(zhuǎn)化愈傷組織207塊，其中30%呈藍(lán)色，愈傷組織壓片鏡檢發(fā)現(xiàn)其中顯藍(lán)色的面積達(dá)70%～80%；1994年，許寧等[39]在用超聲波處理小麥幼胚時(shí)發(fā)現(xiàn)，在超聲波功率為0.5 W/cm2、處理時(shí)間也相同的情況下，連續(xù)型處理比脈沖型處理的轉(zhuǎn)化率低，當(dāng)功率為1.0 W/cm2、處理時(shí)長(zhǎng)還一樣，連續(xù)型超聲導(dǎo)致幼胚全部死亡，結(jié)論為脈沖型超聲更適合于基因轉(zhuǎn)移；同一年，許寧等[40]將二氫葉酸還原酶基因(dhfr)導(dǎo)入缺失二氫葉酸還原酶基因的倉(cāng)鼠細(xì)胞(CHO)，外源基因轉(zhuǎn)化率達(dá)到2.8×10-3，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，脈沖寬度對(duì)轉(zhuǎn)化率也有較大影響，在‘CHO細(xì)胞’導(dǎo)入Calcein的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)占空比5:1、作用時(shí)間2 m時(shí)基因?qū)寺蕿?9%，而當(dāng)占空比5:4、作用時(shí)間2 m時(shí)導(dǎo)入率則下降到43%；1990年，Joersbo等[41]采用溫和超聲波處理將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)導(dǎo)入甜菜和煙草原生質(zhì)體中，即在含質(zhì)粒DNA的介質(zhì)中用20 kHz超聲波處理原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子中目的基因的瞬間表達(dá)，當(dāng)瞬間表達(dá)在煙草原生質(zhì)體中達(dá)到80%時(shí)，超聲波處理對(duì)原生質(zhì)體的活性還沒(méi)有太大影響，同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)，在30 W、570 ms脈沖超聲波處理下，隨著介質(zhì)中質(zhì)粒DNA 濃度的增大(0～110 μg/mL)，CAT基因活性也增高(0%～2.0%)；1991年章力健等[12]采用超聲波直接導(dǎo)入外源基因法轉(zhuǎn)化煙草，將GUS基因、卡那霉素抗性基因和NPT??基因?qū)氲綗煵萑~片小塊，即在含上述基因的處理介質(zhì)中用強(qiáng)度為0.5 W/cm2的超聲波脈沖處理30 m，經(jīng)檢測(cè)，有86%的葉片小塊有GUS短暫表達(dá)，處理葉塊在含卡那霉素培養(yǎng)基上再生出小苗，經(jīng)分子檢測(cè)，得到轉(zhuǎn)化小苗，轉(zhuǎn)化率達(dá)到22.3%，他認(rèn)為，超聲波處理可以在外植體上產(chǎn)生易于農(nóng)桿菌進(jìn)入的通道，使得農(nóng)桿菌與外植體間的接觸面增大，所以轉(zhuǎn)化率有所提高；1995年，秦松等[42]報(bào)道用超聲波處理飩頂螺旋藻制備原生質(zhì)體和單細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲波以20 kHz頻率、15 W功率處理飩頂螺旋藻懸浮液30 s，可使藻絲體斷裂成(15.0±1.6)個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)度，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，藻絲體斷成2～6個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)度，此時(shí)發(fā)現(xiàn)有些細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，得到部分原生質(zhì)體，再延長(zhǎng)作用時(shí)間,可得到少量原生質(zhì)體和大量單細(xì)胞；1997年，Wyber等[33]將酵母(AH22)細(xì)胞等分并懸浮在含有質(zhì)粒DNA的緩沖液中，用20 kHz超聲波處理緩沖液，發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲波強(qiáng)度為2 W，處理30 s時(shí)，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù)量是對(duì)照組的20倍，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在他所使用的超聲波強(qiáng)度和時(shí)間范圍內(nèi)，質(zhì)粒DNA完好無(wú)損；同年，張宏等[31]玉米愈傷組織切塊，與質(zhì)粒DNA一并放入緩沖液中，用聲強(qiáng)為0.5～1.0 W/cm2的超聲波處理緩沖液，處理時(shí)間范圍為10～45 m，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理30 m時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，為13.3%，分子檢測(cè)結(jié)果表明，他們首次成功地將Bt殺蟲(chóng)蛋白基因?qū)肓酥匾魑镉衩字?，并最終得到可育的轉(zhuǎn)基因植株及后代；1999年，李重九等[43]將煙草葉肉細(xì)胞與煙草花葉病毒(TMV)粒子放在緩沖液中，用超聲波處理，脈沖波強(qiáng)0.5～1.0 W/cm2，處理時(shí)間5～30 m，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理5 m，再培養(yǎng)48 h，檢測(cè)到細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率為59.7%，此時(shí)TMV粒子在細(xì)胞內(nèi)的增殖也達(dá)到高峰，且這些TMV子代有較高的致病力；2005年，謝寶貴等[44]將銀耳菌株Tr21與帶有超霉素抗性基因和GUS基因的質(zhì)粒DNA在超聲緩沖液中用超聲波處理，超聲波功率設(shè)80、120、160 W 3個(gè)處理，間隙時(shí)間分別分5、30、60 s 3個(gè)時(shí)段，工作時(shí)間分1、3、5 m 3個(gè)時(shí)段，按正交試驗(yàn)設(shè)置，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，功率80 W、間隙60 s、處理1 m的組合為最佳組合，得到754.7個(gè)轉(zhuǎn)化子，統(tǒng)計(jì)分析證明，間隙時(shí)間和處理時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)銀耳芽孢轉(zhuǎn)化率有顯著影響，而聲強(qiáng)的影響不大，超霉素抗性檢測(cè)得到抗性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子GUS活性檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；2007年，Song等[45]利用低頻超聲波(40 kHz)處理法，將質(zhì)粒pBBR1MCS2導(dǎo)入惡臭假單胞菌(UWC1)、大腸桿菌DH5α和假單胞菌SBW25，轉(zhuǎn)化率比常規(guī)的組合轉(zhuǎn)化法高9倍，比電穿孔法高4倍；Ananthakrishnan等[46]用超聲波處理不易組培再生的南瓜子葉外植體，把芐基腺嘌呤導(dǎo)入其外植體組織，發(fā)現(xiàn)非超聲波處理的外植體僅再生出很小的苗或芽狀結(jié)構(gòu)，而超聲波處理的外植體出苗多、生長(zhǎng)快，并認(rèn)為這是超聲波處理增加了農(nóng)桿菌與外植體細(xì)胞接觸的機(jī)會(huì)，從而提高了轉(zhuǎn)化效率。

4.2 超聲波輔助植物轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法：1997年，Trick等[13]將超聲處理技術(shù)與農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法相結(jié)合，建立了超聲波輔助農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化方法(SAAT)，他們用此法將GUS基因?qū)氪蠖购汪菇M織中，發(fā)現(xiàn)GUS基因的平均短暫表達(dá)頻率提高100～140倍，隨后他們又用此方法轉(zhuǎn)化大豆胚性懸浮培養(yǎng)物（直徑2～4 mm的胚性團(tuán)塊）[47]，處理6～8周后發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因克隆，未用此法轉(zhuǎn)化的同樣組織沒(méi)有得到轉(zhuǎn)基因克隆，對(duì)超霉素抗性苗的分子檢測(cè)證實(shí)T-DNA已整合到胚性組織中；1999年，Humara等[48]利用SAAT法將含有uidA基因的質(zhì)粒導(dǎo)入葉松的子葉中，培養(yǎng)7天后，49.7%的子葉呈現(xiàn)彌散的藍(lán)色，不過(guò)培養(yǎng)30天時(shí)，所有子葉全部死亡，作者認(rèn)為這可能與細(xì)菌感染后植物的過(guò)敏性反應(yīng)有關(guān)；國(guó)內(nèi)，2001年，姚春娜等[49]用超聲波介導(dǎo)發(fā)根農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化，將發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4、黃瓜子葉和下胚軸切段放入超聲波處理緩沖液中，超聲波強(qiáng)度500 W，頻率50 kHz，處理時(shí)間設(shè)為0、2、5、10 s 4個(gè)時(shí)段。發(fā)現(xiàn)處理對(duì)子葉和下胚軸的發(fā)根誘導(dǎo)頻率有明顯的促進(jìn)作用，對(duì)照組發(fā)根生成率依次分別為21.1%和2.7%，而處理組（超聲波處理2 s）的根生成率依次為54.1%和33.4%(P＜0.01)，經(jīng)冠癭堿檢測(cè)證明發(fā)根合成了農(nóng)桿堿；2003年，趙東利等[50]采用超聲波處理將發(fā)根農(nóng)桿菌A4等導(dǎo)入苦豆子子葉和下胚軸外植體中，超聲波功率120 W，頻率50 kHz，處理時(shí)間分5、15、25、30 m 4個(gè)時(shí)間段，處理外植體繼續(xù)培養(yǎng)、誘導(dǎo)生根，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)子葉和下胚軸的轉(zhuǎn)化率逐漸提高，25 m時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)（分別為83.7%和39.1%），而對(duì)照組的轉(zhuǎn)化率僅有14.4%和9.8%，處理30 m時(shí)，轉(zhuǎn)化率又明顯下降，下胚軸的轉(zhuǎn)化率由39.1%下降為30.2%，子葉的轉(zhuǎn)化率由83.7%下降到60.5%，說(shuō)明此時(shí)超聲波的處理已導(dǎo)致外植體組織受損；2004年，姜玲等[51]應(yīng)用SAAT法轉(zhuǎn)化番木瓜胚性愈傷組織，其他條件相同的情形下，超聲波處理15 s，CP基因G轉(zhuǎn)化系的轉(zhuǎn)化率由對(duì)照組的1.6%上升為26.3%，CP基因B轉(zhuǎn)化系的轉(zhuǎn)化率由對(duì)照組的0提高到16.7%；2014年，薛曉鋒等[52]采用SAAT法將耐鹽基因SeNHX1導(dǎo)入紫苜蓿子葉外植體中，超聲波源自超聲波清洗儀，處理時(shí)間為0、5、10、20、30 m 5個(gè)時(shí)間段，處理時(shí)間20 m之前，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，卡那霉素抗性愈傷存活率也逐漸增加，但處理時(shí)間為30 m時(shí)，存活率反而下降，轉(zhuǎn)化體DNA進(jìn)行分子檢測(cè)證實(shí)耐鹽基因的存在。

超聲波輔助花粉介導(dǎo)法：關(guān)于外源DNA能否進(jìn)入花粉粒，最早采用的方法是花粉粒與外源DNA混合培養(yǎng)，處理花粉授粉后，有些后代植株表型發(fā)生變化[53-55]，此間，Hesolp-Harrison[56]通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源DNA能進(jìn)入水合花粉的內(nèi)壁，Picton等[57]和O’Driscoll等[58]發(fā)現(xiàn)萌發(fā)的花粉管尖端細(xì)胞的細(xì)胞壁缺失，并認(rèn)為外源DNA可能通過(guò)花粉管尖端缺少細(xì)胞壁的細(xì)胞的胞吞作用進(jìn)入花粉內(nèi)，但這些發(fā)現(xiàn)或推論都沒(méi)有分子學(xué)上的依據(jù)，何況Hesolp-Harrison等[59]在1988年、Kranz等[60]在1990年還有相反的報(bào)道，所以Langridge等[61]認(rèn)為，通過(guò)花粉途徑進(jìn)行谷物類(lèi)植物的轉(zhuǎn)化是很難的，上述一些研究成果大概有人為造假之嫌；接著研究者又試圖用一些其他方法解決外源基因?qū)牖ǚ哿?wèn)題，如，Matthews等[62]通過(guò)電激法將外源基因?qū)霟煵荩⑸浞?、基因槍法等也成功將外源DNA導(dǎo)入花粉粒，這些研究結(jié)果經(jīng)分子雜交實(shí)驗(yàn)、GUS活性分析、電鏡觀察等手段均得到花粉被轉(zhuǎn)化的依據(jù)；但是證明外源DNA能夠進(jìn)入花粉且能夠保證花粉具有一定的生活力的研究還不夠，對(duì)這些攜帶外源基因的花粉的育性大小還需要詳細(xì)探討[63]；1996年，Deng等[64]在總結(jié)以前的有關(guān)轉(zhuǎn)化花粉的研究時(shí)首次提出花粉介導(dǎo)法這個(gè)概念，就在1997年，王景雪等[65]報(bào)道利用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株，轉(zhuǎn)化率高達(dá)42.9%，這是關(guān)于超聲波輔助花粉介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化玉米并得到可育轉(zhuǎn)化后代的首例報(bào)道；2004年，王景雪等[14]進(jìn)一步介紹該轉(zhuǎn)化材料中目的基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，獲得了轉(zhuǎn)基因純合株系，并認(rèn)為采用這種轉(zhuǎn)化方法，避免了傳統(tǒng)的基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化所要求冗長(zhǎng)的組織培養(yǎng)過(guò)程，轉(zhuǎn)化方法簡(jiǎn)單，易操作，具有很強(qiáng)的實(shí)用性；2002年，陳定虎[15]報(bào)道采用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法將攜帶PAP基因的植物轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入玉米材料中，獲得1個(gè)轉(zhuǎn)化事件，抗病鑒定結(jié)果為接種病毒后對(duì)照7天發(fā)病，轉(zhuǎn)化系25天時(shí)也未發(fā)?。唤庵炯t[16]采用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化棉花遠(yuǎn)緣雜交高代材料，轉(zhuǎn)化率達(dá)到32%；2004年，王節(jié)之等[17]采用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法將幾丁質(zhì)酶基因?qū)牍茸悠贩N‘晉谷21號(hào)’不育系，T1代得到PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株，T2代噴霧除草劑篩選，存活植株做抗病鑒定，結(jié)果轉(zhuǎn)化系抗病性明顯高于對(duì)照，獲得了雙抗植株；杜春芳等[18]利用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法將GUS基因?qū)胗筒恕瘯x油7號(hào)’，獲得6個(gè)轉(zhuǎn)化植株；2006年，梁雪蓮等[19]利用花粉介導(dǎo)法將抗蟲(chóng)基因CpT?導(dǎo)入花生品種‘仲愷01號(hào)’，并發(fā)現(xiàn)超聲波強(qiáng)度為100 W時(shí)，花粉無(wú)損傷，200 W時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，但細(xì)胞壁受損，300 W時(shí)，花粉解體，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)超聲波強(qiáng)度為200 W時(shí)，染色觀察結(jié)果顯示花粉仍具有生活力；2007年，Wang等[20]以超聲波輔助花粉介導(dǎo)方法把帶有GUS基因和NPT??基因的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入高粱雄性不育系‘A2V4A’，獲得了轉(zhuǎn)基因后代材料；2008年，Wang等[65]將抗草甘膦基因aroA-M1用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入油菜品種，獲得了抗草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因植株；杜建中等[66]以超聲波輔助花粉介導(dǎo)法將水稻幾丁質(zhì)酶基因?qū)胗衩鬃越幌怠?2-1’中，獲得了5株轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)其后代株系進(jìn)行抗病鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系植株的抗病性比非轉(zhuǎn)化對(duì)照株系提高1～2級(jí)；2009年，魏玉杰等[21]以超聲波輔助花粉介導(dǎo)法將蘿卜抗菌肽基因轉(zhuǎn)入野罌粟花粉并給野罌粟授粉，結(jié)實(shí)率高達(dá)80%，超聲波處理時(shí)間對(duì)授粉后結(jié)實(shí)率的影響達(dá)顯著水平；2010年，任小燕等[67]采用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法把山菠菜膽堿單加氧酶基因(AhCMO)導(dǎo)入玉米自交系‘鄭58’中，測(cè)定生理指標(biāo)的結(jié)果證明轉(zhuǎn)化植株的耐鹽性比對(duì)照提高1～3級(jí)；2011年，韓凱[68]采用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法將EPSPS基因和谷氨酰胺合成酶基因(GSI)導(dǎo)入玉米‘玉美頭’品種中，獲得了轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化率僅為4.17%，但仍高于基因槍法的轉(zhuǎn)化率；林春晶等[69]利用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法（有改良）將玉米植酸酶基因phy轉(zhuǎn)入玉米品種，經(jīng)PCR和RT-PCR檢測(cè)，證明得到轉(zhuǎn)化植株，目的基因也得到轉(zhuǎn)錄表達(dá)；2012年，宋鑒達(dá)等[70]利用經(jīng)過(guò)改良的超聲波輔助花粉介導(dǎo)法將植酸酶基因phy和bar基因轉(zhuǎn)化到玉米品種‘鄭單958’中，經(jīng)分子檢測(cè)，獲得了轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株；2013年，馬倩倩等[22]以黃花梨花粉為載體，將綠色熒光蛋白基因GFP導(dǎo)入黃花梨植株，獲得了轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化率為3%，這在果木轉(zhuǎn)化中也算是較高的轉(zhuǎn)化效率；同年，李娜等[71]把綠色熒光蛋白基因GFP轉(zhuǎn)入玉米離體花粉中，對(duì)轉(zhuǎn)化花粉進(jìn)行體外培養(yǎng)和人工授粉，用熒光顯微鏡觀察GFP基因在花粉、花粉管以及胚中的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化胚與非轉(zhuǎn)化胚均有強(qiáng)烈熒光，認(rèn)為以花粉粒熒光反應(yīng)作為花粉轉(zhuǎn)化依據(jù)不可靠；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化花粉人工授粉后，被授粉植株的花粉管和胚中均有GFP表達(dá)的熒光反應(yīng)，認(rèn)為后兩者可作為花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的證據(jù)，授粉植株的種子播種后得到轉(zhuǎn)化植株及后代。2014年，王小麗等[72]采用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法首次將BADH基因?qū)搿?8’玉米自交系，獲得了耐鹽的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化材料。

除上述超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、超聲波輔助花粉介導(dǎo)法外，就作者本人目前掌握的資料還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)超聲波輔助其他遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究。就狄紅梅《超聲波處理對(duì)大白菜花粉管通道法轉(zhuǎn)基因的影響》[73]一文經(jīng)作者甄別也應(yīng)屬于超聲波輔助花粉介導(dǎo)法，嚴(yán)格意義上講其采用方法與超聲波輔助花粉介導(dǎo)法更相近。

5 超聲波輔助植物轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)點(diǎn)

超聲波輔助的遺傳轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)點(diǎn)包括：不需要貴重精密儀器設(shè)備，所以投資少；方法簡(jiǎn)單易于操作；組培過(guò)程簡(jiǎn)單或不需組培過(guò)程，省時(shí)省力；出現(xiàn)嵌合體的概率低或沒(méi)有；突破基因型屏障，適用范圍廣，單子葉植物也廣泛應(yīng)用；轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化工作效率也高。

1996，王國(guó)英等[74]用基因槍法、超聲波法等轉(zhuǎn)化玉米，轉(zhuǎn)化玉米幼胚或胚性愈傷組織，基因槍法兩種外植體均轉(zhuǎn)化成功，但轉(zhuǎn)化率低，最高轉(zhuǎn)化率為平均每皿0.58個(gè)轉(zhuǎn)化體（每皿50～60個(gè)幼胚或胚性愈傷），超聲波處理直接轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化率最高為15.3%(0.5 W/cm2，30 m)，超聲波處理提高轉(zhuǎn)化效率的效果明顯；2002年，梁雪蓮等[75]采用注射法、花粉介導(dǎo)法和萌動(dòng)胚法轉(zhuǎn)化bar基因?qū)胗衩住S糯’、‘白糯’、‘金黃96C’等中，均獲得了轉(zhuǎn)化植株，但3種轉(zhuǎn)化方法結(jié)實(shí)率分別為1%、3%～4%、3%～4%，從轉(zhuǎn)化目的性看，后兩者也強(qiáng)于注射法，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，同種試驗(yàn)條件下，這3種方法的轉(zhuǎn)化率高于基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，且不需組培和再生過(guò)程，省時(shí)省力；2011年，韓凱[68]采用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法將EPSPS基因和谷氨酰胺合成酶基因(GSI)導(dǎo)入玉米‘玉美頭’品種中，獲得了轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化率僅為4.17%，但仍高于基因槍法的轉(zhuǎn)化率。

6 展望

6.1 存在問(wèn)題和應(yīng)對(duì)策略

超聲波介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法除了上述的優(yōu)缺點(diǎn)，還存在的問(wèn)題包括：（1）導(dǎo)入的外源基因通過(guò)非同源重組形式整合，隨機(jī)性較大，可能導(dǎo)致導(dǎo)入基因的沉默或者插入位點(diǎn)原功能基因的失活。這一問(wèn)題可通過(guò)重組位點(diǎn)介導(dǎo)定點(diǎn)整合技術(shù)或者定點(diǎn)酶切介導(dǎo)定點(diǎn)整合技術(shù)來(lái)解決，即將外源DNA構(gòu)建到Cre-lox等重組整合系統(tǒng)[76]，然后轉(zhuǎn)化，也可結(jié)合鋅指酶介導(dǎo)的定點(diǎn)整合技術(shù)[77]來(lái)完成轉(zhuǎn)化；（2）超聲波輔助介導(dǎo)對(duì)受體材料所產(chǎn)生的機(jī)械損傷和熱損傷，1998年，Santarem等[78]用掃描隧道顯微鏡觀察超聲波輔助處理的大豆子葉，發(fā)現(xiàn)子葉表面和深層有許多的微傷口；章力健等[12]、邱樹(shù)毅等[79]分別觀察到超聲波在介質(zhì)中傳播時(shí)，會(huì)使介質(zhì)的溫度升高，升高17～25℃，溫度升高也會(huì)造成外植體損傷。其解決方案一是優(yōu)化超聲波處理強(qiáng)度，盡量降低機(jī)械損傷，二是配備冰浴系統(tǒng)，使整個(gè)超聲波處理過(guò)程處于低溫狀態(tài)，減少高溫?fù)p傷；（3）針對(duì)不同的受體材料，都需要摸索不同的超聲波處理強(qiáng)度和處理時(shí)長(zhǎng)，工作繁瑣，且重復(fù)性差。解決問(wèn)題的關(guān)鍵是開(kāi)發(fā)植物轉(zhuǎn)化專(zhuān)用的超聲波處理設(shè)備，這個(gè)設(shè)備除操作簡(jiǎn)單外，其超聲波強(qiáng)度范圍應(yīng)適當(dāng)加寬，探頭強(qiáng)度要更硬，處理室應(yīng)可放置一定體積的冰浴盒，這樣便于優(yōu)化處理強(qiáng)度和處理時(shí)長(zhǎng)的組合，并且無(wú)需購(gòu)買(mǎi)多臺(tái)設(shè)備以備用；（4）轉(zhuǎn)化效率有待提高，通過(guò)儀器配制的改進(jìn)、處理介質(zhì)的優(yōu)化、處理參數(shù)等的完善，可以提高超聲波介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法的轉(zhuǎn)化效率。

6.2 未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)

植物轉(zhuǎn)基因研究已有30年歷史，中國(guó)的轉(zhuǎn)基因研究也正在步入轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化的起步階段，隨著時(shí)代發(fā)展和社會(huì)進(jìn)步，植物轉(zhuǎn)基因研究將呈現(xiàn)一個(gè)欣欣向榮、成果斐然的新時(shí)代，因而完善現(xiàn)有植物轉(zhuǎn)化方法，開(kāi)發(fā)新的轉(zhuǎn)化方法是歷史賦予人們的使命。

隨著人們對(duì)超聲波物理、化學(xué)性質(zhì)的進(jìn)一步了解和掌握，超聲波介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法的操作過(guò)程和步驟將不斷簡(jiǎn)化，轉(zhuǎn)化效率得到提高，加之其又可克服轉(zhuǎn)化過(guò)程中基因型的依賴(lài)性和便于推廣應(yīng)用，故其應(yīng)用前景十分廣闊。

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Advance in Plant Transformation Method Assisted by Ultrasonic

Wang Jianjun,Feng Liyun,Shen Hufei,Liu Jiao
(Xixian Agricultural Experiment Station,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Xixian 041399,Shanxi,China)

To evaluate the efficiency and potential development capacity of ultrasonic treatment for plant transformation,we started with the principle of ultrasonic-assisted plant transformation,summarized the validation of method,the receptor materials of ultrasonic treatment and the effects of ultrasonic treatment on exogenous DNA.Then,the research progresses in ultrasonic-assisted plant transformation were reviewed,and the advantages as well as disadvantages and existing problems of the method were discussed.Our results indicated that although the development of ultrasonic-assisted plant transformation was still in the primary stage,it demonstrated that the method was a simple,time-saving,labour-saving and widely applied plant transformation approach.Moreover,we proposed respective solution to the existing problems.Taken together,we consider that ultrasonic-assisted plant transformation method has broad development prospect.

Ultrasonic;Assistance;Plant;Transformation Method

Q812

A論文編號(hào)：cjas16120034

國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專(zhuān)項(xiàng)“抗病蟲(chóng)、抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米新品種選育”(2016ZX08003001-002-003)；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目“多抗耐密型玉米新種質(zhì)創(chuàng)制及新品種選育”(20140311002-1)。

王建軍，男，1972年出生，副研究員，本科，學(xué)士，主要從事作物遺傳育種工作。通信地址：041399山西省隰縣龍泉鎮(zhèn)下王家莊村164號(hào)山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院隰縣農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，Tel：0357-7321591，E-mail：wangjianjun1123@126.com。

2016-12-29，

2017-02-06。