李 嬌，謝金文，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

我國豬博卡病毒的流行現(xiàn)狀及檢測技術(shù)

李 嬌1，謝金文2，李 峰2，沈志強1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬博卡病毒（PBoV）屬于細(xì)小病毒科（Parvovirus）細(xì)小病毒亞科（Parvovirus）博卡病毒屬（bocavirus），為無囊膜的單股DNA病毒，病毒粒子大小為25～30nm，呈正二十面體結(jié)構(gòu)。病毒基因組全長5.2 kb，編碼3個主要的開放閱讀框（ORF1～3），其中ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，ORF2編碼衣殼蛋白VP1和VP2，ORF3編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NP1。根據(jù)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的核苷酸同源性分為5個基因型（PBoV-1型、PBoV-2型、PBoV-3型、PBoV-4型、PBoV-5型）。該病毒于2009年被首次報道[1]，我國翟少倫等[2]于2010年首次在191份疑似患高熱病的病料中檢出PBoV，隨后國內(nèi)養(yǎng)豬密集地區(qū)相繼檢測出PBoV。目前國內(nèi)對于該病毒的研究仍處于起步階段，病毒的理化性質(zhì)、致病機(jī)理、致病性尚不清楚，病毒的體外細(xì)胞培養(yǎng)系和動物模型尚未建立。筆者就目前國內(nèi)PBoV的流行現(xiàn)狀及檢測技術(shù)進(jìn)行綜述，以期為我國PBoV的防控提供參考。

1 流行現(xiàn)狀

1.1 病原學(xué)調(diào)查情況

PBoV自2010年首次在國內(nèi)被檢測到以來，在短短幾年的時間內(nèi)，在豬群中就有較高的流行率。Liu等[3]對遼寧、天津、河北、河南、山東5個省區(qū)采集的403份組織樣品進(jìn)行檢測，PBoV平均感染陽性率為11.41%，其中以山東的感染率最高（41.86%），河北次之（20.8%），河南和遼寧的感染率分別為11.0%和10.0%，天津市的感染率最低（1.3%）。Zhai等[4]對采自浙江、江西、安徽、河北、河南、江蘇、北京、上海、新疆9省市的組織病料樣品進(jìn)行檢測，PBoV感染率在12.5%～88.9%之間。Shan等[5]對上海、江蘇、安徽、山東、貴州的共計340份健康豬樣品進(jìn)行檢測，PBoV感染率在45%～75%之間。胡軍勇等[6]對湖北、湖南、河南省的79個規(guī)?；i場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，248份病料樣品中有172份樣品為PBoV陽性，PBoV陽性感染率高達(dá)69.35%。Zhang等[7]對國內(nèi)10個省份的166份樣品進(jìn)行PBoV的分型檢測，結(jié)果PBoV-1、PBoV-2、PBoV-3、PBoV-4的感染率分別為28.9%、6.6%、19.3%和39.4%，說明中國豬群中存在多種基因型的PBoV感染。蔡雨函等[8]對四川省189份仔豬腹瀉病料進(jìn)行檢測，PBoV陽性樣品121份，陽性率達(dá)64.02%，121份陽性樣品中有79份為PBoV 3/4/5型，29份為PBoV 1/2型，13份為PBoV 1/2型及3/4/5型混合感染，表明四川地區(qū)主要的流行毒株可能是PBoV 3/4/5型。鄧波等[9]對上海市1 800份豬血清、45份豬糞便、27份豬鼻棉拭、9份高熱病死豬內(nèi)臟進(jìn)行檢測，陽性率依次為24%、30%、0%、67%，并且對6份PBoV陽性病料進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）的檢測，陽性率依次為83%、100%、0%、0%，表明上海市PBoV感染情況普遍存在，豬內(nèi)臟中檢出率較高，且春秋兩季高發(fā)，仔豬比較易感，并與PRRSV、PCV2存在混合感染。以上流行病學(xué)調(diào)查資料共同表明，PBoV在國內(nèi)豬群中流行廣泛，感染率較高，且存在PBoV多種基因型的感染，以及PBoV與PRRSV、PCV2等疫病的混合感染，感染情況比較復(fù)雜。

1.2 分子流行病學(xué)調(diào)查情況

分子流行病學(xué)通過對病毒核酸序列或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，可在同一病毒種屬內(nèi)進(jìn)行種系分析，研究一定時期內(nèi)病毒的遺傳變異和流行情況，為尋找病毒的傳播途徑以及制定不同地區(qū)不同時間的防控措施提供指導(dǎo)。郝飛等[10]根據(jù)GenBank收錄的25條PBoV全基因或部分基因序列，利用DNAStar分析軟件，通過Jotun-Hein算法，分別從PBoV的NS、NP、VP以及全基因序列進(jìn)行相似性臨近排組分析，并建立了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)PBoV基因較為離散，種屬內(nèi)的差異較大，大體可分為2個大支和若干遺傳簇，不同的遺傳簇所包含的毒株在核苷酸序列上存在著一定的差異，同支序列的分離株相似性較高，PBoV在進(jìn)化過程中存在一定的地域差異性，推測PBoV在傳播過程中可能發(fā)生了重組，從而產(chǎn)生了較大的變異。

2 檢測方法研究進(jìn)展

PBoV在臨床中常常與PRRSV、PCV2、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等疫病混合感染，增加了PBoV臨床確診的難度，對于PBoV的確診需借助實驗室檢測技術(shù)。過去對于動物病毒病的實驗室檢測技術(shù)一般都采用病毒的分離鑒定方法，但PBoV作為一種新發(fā)病毒，對其研究尚處于初級階段，目前只有北愛爾蘭科研人員利用豬原代腎細(xì)胞成功分離出PBoV的報道[11]，我國還未見PBoV成功分離的報道，至今尚未找到合適的PBoV體外細(xì)胞培養(yǎng)系和動物模型，故國內(nèi)對PBoV的實驗室檢測技術(shù)研究主要集中在分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測方面，而且取得了較大進(jìn)展。

2.1 PCR方法

PCR方法是目前最簡單的分子生物學(xué)檢測方法，該方法操作簡單、檢測快速、具有一定的敏感性，已被廣泛應(yīng)用于動物疫病的檢測。葉星宇等[12]根據(jù)GenBank公布的PBoV的核苷酸序列，在其NP1保守區(qū)域設(shè)計1對特異性引物，經(jīng)過PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測PBoV的PCR方法，該方法檢測豬瘟病毒（CSFV）、PPV、PRRSV、PCV2均為陰性，特異性好。該方法的敏感度可以達(dá)到58 pg/μL，敏感性高。該方法3次重復(fù)檢測的結(jié)果完全一致，重復(fù)性好。對陽性擴(kuò)增產(chǎn)物測序，與Gen－Bank公布的PBoV NP1序列同源性在97.3%以上，可靠性強。胡軍勇等[6]也根據(jù)PBoV NS1基因序列設(shè)計1對引物，建立了檢測PBoV的PCR方法，該方法能夠從PBoV陽性樣品中特異性地擴(kuò)增出482 bp的片段，而對PPV、PCV2、沙門氏菌、大腸桿菌、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌的核酸樣品均無非特異性擴(kuò)增反應(yīng)，該方法對PBoV的最低檢測量為213.6拷貝，為PBoV臨床診斷和病原學(xué)調(diào)查提供了一種檢測技術(shù)。

2.2 多重PCR方法

多重PCR方法是在常規(guī)PCR反應(yīng)體系中加入多對引物，實現(xiàn)多種病原核酸的同時鑒別檢測，可應(yīng)用于PBoV與其它致病原的鑒別診斷以及PBoV不同基因型的分型檢測。付朋飛等[13]根據(jù)GenBank中登錄的PBoV不同基因型序列和PCV2全基因組序列分別設(shè)計2對特異性引物，通過對擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了能夠同時檢測PBoV和PCV2的雙重PCR方法，該方法可以同時擴(kuò)增出PBoV（209 bp）和PCV2（476 bp）的特異性片段，而對PRV、PPV、沙門氏菌、大腸埃希氏菌DNA模板擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，對PBoV和PCV2的最低檢出量均為100拷貝/μL，該雙重PCR與單重PCR的檢測符合率為100%。該雙重PCR特異性強、重復(fù)性好、敏感性高，為PBoV和PCV2的快速鑒別診斷提供了有效的技術(shù)支持。焦洋等[14]根據(jù)GenBank登錄的TGEV S基因序列、PEDV M基因和PBoV NP1基因序列，設(shè)計合成3對引物，對TGEV、PEDV RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA模板和PBoV的DNA模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了同時檢測TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法，該方法檢測豬A群輪狀病毒（GAR）、PRRSV、PRV、PCV2均為陰性，對TGEV、 PEDV、PBoV核酸的最低檢測限分別為35、20、10 pg。該方法可以在同一體系中同時檢測3種病毒，大幅降低了檢測成本，為TGEV、PEDV、PBoV感染的鑒別診斷提供了簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測方法。宏春慧等[15]分別根據(jù)PBoV-1型、PBoV-2型、PBoV-3型基因序列保守區(qū)域設(shè)計3對引物，通過引物濃度和退火溫度等條件優(yōu)化，建立了同時檢測PBoV 3種基因型的三重PCR方法。該方法可以同時擴(kuò)增出645 bp（PBoV-1型）、352 bp（PBoV-2型）和259 bp（PBoV-3型）的特異性片段，而對PEDV、TGEV、GAR、豬庫布病毒（PKoV）、PCV2、CSFV、大腸埃希氏菌的檢測均為陰性，最低檢測限為8×10-7ng/μL，對臨床樣品進(jìn)行三重PCR和單項PCR檢測，二者符合率為100%，該方法的建立為PBoV 3種不同基因型的鑒別檢測提供了有效手段。

2.3 熒光定量PCR方法

熒光定量PCR方法是指采用SYBR GreenⅠ熒光染料或熒光探針通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號的強弱變化來定量分析擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量，進(jìn)而實現(xiàn)對起始模板的準(zhǔn)確定量。與常規(guī)PCR方法相比具有敏感性更高、適時定量、自動化程度高等優(yōu)點。陳鵬強等[16]根據(jù)PBoV-5型NS1基因序列設(shè)計引物，建立了基于SYBR GreenⅠ檢測PBoV-5的實時熒光定量PCR，該方法在3.64×102～3.64×107拷貝/μL范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，檢測豬圓環(huán)病毒（PCV1和PCV2）、PPV、豬輸血傳播病毒（TTV-1和TTV-2）的核酸均無陽性信號擴(kuò)增，組內(nèi)變異系數(shù)為0.35%～1.24%，組間變異系數(shù)為0.43%～1.46%。鄧波等[17]根據(jù)PBoV序列，通過VP1和VP2基因設(shè)計引物和TaqMan探針，建立了檢測PBoV的實時熒光定量PCR方法，該方法檢測PPV、PRRSV、PCV2均為陰性，最低可檢測到101拷貝/mL的陽性質(zhì)粒，具有靈敏度高、特異性好和精確性高等優(yōu)點，在PBoV的臨床診斷、大規(guī)模臨床樣本檢測中將具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

2.4 LAMP方法

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一種新興的分子生物學(xué)檢測方法，具有不需要特殊儀器設(shè)備、操作簡單、檢測快速等優(yōu)點，但該方法的敏感性太高，已導(dǎo)致臨床假陽性的檢測結(jié)果。李彬等[18]從基因數(shù)據(jù)庫中檢索獲得PBoV基因序列，通過DNAStar軟件進(jìn)行序列比對，獲得PBoV特異性保守序列，通過LAMP引物設(shè)計軟件（Primer Explorer software version 4.0）對該保守序列進(jìn)行LAMP引物設(shè)計，獲得4條特異性引物，經(jīng)Mg2+濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間3個參數(shù)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測PBoV的LAMP方法，該方法的靈敏度可達(dá)到檢測10個拷貝的PBoV核酸，檢測CSFV、PRRSV、PCV2、PRV均為陰性。該LAMP檢測方法敏感性高、特異性強、操作簡單、檢測快速，已經(jīng)組裝了試劑盒并申請了國家專利，能夠較好的滿足PBoV現(xiàn)地檢測的需要。

2.5 血清學(xué)方法

血清學(xué)檢測技術(shù)或稱免疫學(xué)檢測技術(shù)是一種基于抗原抗體特異性反應(yīng)原理，通過在抗原抗體上標(biāo)記的放射線、熒光、酶等特殊物質(zhì)作為探針來檢測抗原抗體的體外免疫反應(yīng)技術(shù)。張晶等[19]為研究PBoV VP1蛋白在血清學(xué)診斷中的作用，用DNAStar軟件預(yù)測了PBoV NP08株VP1蛋白的主要抗原表位，確定1～34個氨基酸為優(yōu)勢抗原表位區(qū)，將其定向克隆至pET32a原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了分子量為56.7 ku的重組蛋白VP1，Western blot鑒定表明，純化后的VP1蛋白與PBoV陽性血清具有良好的反應(yīng)性，用該蛋白包被ELISA反應(yīng)板，檢測10份臨床感染PBoV的豬血清樣品和3份未感染豬血清樣品，結(jié)果表明其具有很好的特異性，不與未感染豬的血清發(fā)生反應(yīng)，為進(jìn)一步建立檢測PBoV的血清學(xué)抗體診斷方法奠定了基礎(chǔ)。李彬等[20-21]利用原核表達(dá)系統(tǒng)先后分別成功表達(dá)了PBoV NP1和VP2蛋白，利用鎳離子蛋白純化柱分別成功純化了2個重組蛋白，Western blot結(jié)果顯示，表達(dá)的VP2蛋白和NP1蛋白均能與His抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，重組VP2蛋白和重組NP1蛋白均可以作為PBoV診斷抗原的候選蛋白，分別為建立檢測PBoV NP1抗體和VP2抗體的血清學(xué)診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)語

現(xiàn)階段的流行病學(xué)調(diào)查證明，PBoV自2010年在我國被首次發(fā)現(xiàn)以來，其在國內(nèi)豬群中感染率一直較高，且存在PBoV多種基因型的感染以及PBoV與PRRSV、PCV2等疫病的混合感染，感染情況比較嚴(yán)峻，應(yīng)加強重視。對于PBoV的各種檢測方法，PCR和多重PCR方法雖然操作簡單、快速，但不能定量，且敏感性有限，容易漏檢。LAMP方法雖然對儀器、試劑、操作人員的要求較低，更適合基層應(yīng)用，但敏感性太高，易污染。熒光定量PCR方法彌補了常規(guī)PCR方法的缺點，但該方法對儀器、試劑、操作人員的要求均較高，有條件的實驗室可選擇使用。血清學(xué)方法操作簡單、檢測快速、高通量，適合大規(guī)模樣品檢測，雖然國內(nèi)還沒有商品化的血清學(xué)檢測試劑盒，但其將具有廣闊的開發(fā)與應(yīng)用前景。綜合判斷，各種檢測方法均具有各自的優(yōu)缺點，不同單位可根據(jù)自身的情況選擇適合自己的方法。相信隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以及PBoV基礎(chǔ)性研究的不斷深入，PBoV的各種檢測方法將會得到進(jìn)一步發(fā)展與完善，從而為PBoV的臨床診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)保障。

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（編輯：郭玉翠）

S858.28

A

1002-1957(2017)02-0118-03

2016-10-14

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊項目（SDAIT-08-17）

李 嬌（1981-），女，滿族，遼寧鐵嶺人，助理研究員，碩士，主要從事動物疫病診斷技術(shù)研究工作.E-mail：lijiao_zone@163.com