任素芳+郭立輝+李為棟+張召坤+李興光+崔寶玉+吳家強(qiáng)+張玉玉

摘 要：本研究對(duì)一個(gè)豬場(chǎng)高致病性PRRSV疑似病例進(jìn)行了病理剖檢、PRRSV N蛋白基因RT-PCR擴(kuò)增以及序列測(cè)定和分析。結(jié)果表明，N2號(hào)分離株N蛋白核苷酸序列與高致病性毒株（JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株）的一致性均為99.1%，N3/N4號(hào)與高致病性毒株的一致性均為98.9%，由此判定該豬場(chǎng)病豬感染毒株為高致病性PRRSV。該研究結(jié)果可為養(yǎng)豬生產(chǎn)中高致病性PRRSV感染的判斷提供借鑒。

關(guān)鍵詞：病理解剖；PRRS；高致病性PRRSV；RT-PCR；序列測(cè)定

中圖分類號(hào)：S858.285.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）12-0129-04

Abstract The suspected cases of highly pathogenic PRRSV from a pig farm were conducted autopsy， the gene sequence of N-protein of PRRSV was amplified by RT-PCR， and then its sequence was determined and analyzed. The identity of the nucleotide sequence of N-protein was 99.1% between the isolate N2 and the highly pathogenic strains （JXA1， HuN4， SX-1 and TJM）， and that of isolate N3/N4 was 98.9% with the highly pathogenic strains. The results showed that the infected virus was highly pathogenic PRRSV in the pig farm. This research provided a reference for the diagnosis of highly pathogenic PRRSV infection in swine production.

Keywords Pathological anatomy； PRRS； Highly pathogenic PRRSV； RT-PCR； Sequencing

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）俗稱豬藍(lán)耳病，由動(dòng)脈炎病毒科豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）引起，是一種急性病毒性傳染病[1，2]。高致病性PRRSV是我國現(xiàn)階段豬藍(lán)耳病流行的主導(dǎo)毒株，對(duì)豬呼吸系統(tǒng)、繁殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)均有強(qiáng)的致病力，有很多豬場(chǎng)因?yàn)楦腥驹摬≡獾綒缧源驌鬧3-8]。2016年6月份，某自繁自養(yǎng)的豬場(chǎng)發(fā)生疫情，該豬場(chǎng)的哺乳仔豬陸續(xù)發(fā)病，出現(xiàn)眼瞼水腫、發(fā)熱、食欲減退、皮膚發(fā)紅、呼吸急促等現(xiàn)象，有的可見咳嗽、腹瀉、震顫等癥狀，發(fā)病率達(dá)到80%，死亡率達(dá)到50%以上，使用黃芪多糖、抗生素等治療效果均不明顯。

為了對(duì)該豬場(chǎng)病情進(jìn)行確診，以便對(duì)癥治療，本研究對(duì)疑似病例進(jìn)行病理解剖、RT-PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定和分析，以期對(duì)PRRSV毒株做出準(zhǔn)確判斷， 為及時(shí)采取有效的控制措施、提高豬的成活率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

對(duì)4例病死豬進(jìn)行解剖，觀察病理變化。分別采集各病豬的腎、脾、肺、淋巴結(jié)組織各少許，-20℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 材料和試劑

PRRSV陽性對(duì)照由本實(shí)驗(yàn)室保存；RT-PCR一步法試劑盒、DL2000 DNA Marker、凝膠回收試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；PTC-2000型PCR儀購自美國MJ Research公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)PRRSV N蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列為正向引物F：5′-ATGCCAAATAACAACGG-3′；反向引物R：5′-TGCTGAGGGTGATGCTGT-3′。引物的擴(kuò)增片段大小為369 bp。

1.4 樣品處理與RNA提取

樣品RNA的提取參照文獻(xiàn)[9]，試驗(yàn)操作均在冰盒上完成，所用槍頭、離心管均為RNase-free。取約2 g病料加入適量滅菌的PBS溶液（0.01 mol/L，pH 7.4）進(jìn)行研磨，研磨后反復(fù)凍融3次，4℃、5 000 r/min離心2 min；取250 μL上清加入750 μL Trizol和200 μL氯仿，振蕩混勻，-20℃靜置5 min，4℃、12 000 r/min離心15 min；取500 μL上清加入等量的異丙醇，顛倒數(shù)次，-20℃靜置20 min，4℃、12 000 r/min離心15 min收集沉淀；75%酒精洗滌沉淀后，20 μL滅菌水溶解沉淀即為樣品RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RT-PCR擴(kuò)增

RT-PCR擴(kuò)增采用一步法。反應(yīng)體系為25 μL，其中：2× 1 Step Buffer 12.5 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，上游引物F 1 μL，下游引物R 1 μL，RNA模板3 μL，RNase-free ddH2O 6.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95℃預(yù)變性1 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)； 72℃延伸10 min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 目的基因序列測(cè)定與分析

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果與GenBank發(fā)表的JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株、NADC30株、SD1株、VR2332株的N蛋白基因序列進(jìn)行比對(duì)，使用DNASTAR軟件繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理變化

剖檢該豬場(chǎng)4例病死豬，發(fā)現(xiàn)有如下病理變化：淋巴結(jié)褐色腫大、有的出血，脾臟有梗死點(diǎn)，肺臟呈紅褐花斑狀且間質(zhì)增寬，腎臟紫紅色且表面有零星的出血點(diǎn)，喉頭及氣管充血且含有少量液體泡沫。初步診斷該豬場(chǎng)感染了豬藍(lán)耳病病毒。

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

采集的4例病料提取RNA后，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，3例病料均有一條369 bp的特異DNA片段，與目的片段大小一致（圖1），說明所檢病料有3例為PRRSV陽性（表1），且2號(hào)和4號(hào)病料為強(qiáng)陽性。

2.3 序列測(cè)定及分析

2.3.1 序列同源性比對(duì) RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，序列命名為20160805_D17_N2_.seq、 20160805_D18-N3N4-.seq。將測(cè)定結(jié)果與GenBank發(fā)表的JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株、NADC30株、SD1株、VR2332株的N蛋白基因序列進(jìn)行比對(duì)，如圖2所示。

同源性分析結(jié)果如圖3所示，N2號(hào)分離株N蛋白核苷酸序列與高致病性毒株（JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株）的一致性均為99.1%；與經(jīng)典毒株（VR2332株、SD1株）的一致性均為 93.3%；與北美強(qiáng)毒株NADC30株的一致性為90.1%。N3/N4（N3、N4號(hào)混合）號(hào)與高致病性毒株（JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株）的一致性均為98.9%；與經(jīng)典毒株（VR2332株、SD1株）的一致性均為93.3%；與北美強(qiáng)毒株NADC30株的一致性為90.2%。

2.3.2 進(jìn)化樹分析 結(jié)果如圖4所示，20160805_D17-N2- .seq、 20160805_D18-N3N4- .seq與高致病性毒株N蛋白基因序列JXA1（EF112445）.seq等處于同一分支，與其余毒株的N蛋白基因序列關(guān)系較遠(yuǎn)。說明所檢病料為高致病性PRRSV陽性。

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法是無菌采取病豬的血清或腹水或取肺、扁桃體和脾等組織數(shù)小塊， 應(yīng)用豬原代肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物或MARC-145或HS2H細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后再進(jìn)行鑒定，這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于疾病的快速診斷[10]。本研究通過病理剖檢、PRRSV N蛋白基因RT-PCR擴(kuò)增以及序列測(cè)定和分析，證明某豬場(chǎng)PRRSV分離株與高致病性毒株（JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株）遺傳距離比較近，確定該豬場(chǎng)病死豬為高致病性PRRSV感染。

采用臨床剖檢和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相結(jié)合的手段快速鑒別診斷豬的藍(lán)耳病毒株，為指導(dǎo)養(yǎng)殖場(chǎng)采取相應(yīng)的緊急防治措施提供了依據(jù)，從而減少豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失。

參 考 文 獻(xiàn)：

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