劉 勇，蘇銘吉，紀(jì) 萍，程珍琪，何培新

（有機(jī)化工新材料湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，有機(jī)功能分子合成與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖北 武漢 430062）

酶催化聚合及酶固定化技術(shù)的研究進(jìn)展

劉 勇，蘇銘吉，紀(jì) 萍，程珍琪，何培新

（有機(jī)化工新材料湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，有機(jī)功能分子合成與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖北 武漢 430062）

綜述了酶體外催化聚合的反應(yīng)機(jī)理, 歸納了參與催化高分子聚合反應(yīng)酶的種類以及目前關(guān)于酶的固定化技術(shù)的研究進(jìn)展，并對(duì)固定化酶催化聚合的研究進(jìn)行了展望。

聚合；酶；固定化技術(shù)；研究進(jìn)展；展望

隨著科學(xué)的發(fā)展，高分子化合物在整個(gè)社會(huì)中占據(jù)著不可替代的經(jīng)濟(jì)地位。然而，常見的高分子合成反應(yīng)都要用精密的設(shè)備控制好溫度和壓力，這對(duì)控制工業(yè)化生產(chǎn)成本來(lái)說(shuō)是個(gè)巨大的難題。于是，各種各樣的催化劑被用于高分子反應(yīng)，增加反應(yīng)體系的活性，以提高工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)率，降低成本。

合成高分子化合物的催化劑一般有酸、堿、自由基（第1類催化劑）和過渡金屬及稀有金屬（第2類催化劑）。而能體外催化聚合物合成的酶作為最新的第3類催化劑[1]。相較于前2類催化劑，允許體外催化聚合的酶包含明確定義的受控立體化學(xué)、區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性結(jié)構(gòu)的各種天然和非天然聚合物。酶催化能給出比傳統(tǒng)化學(xué)催化更精確的結(jié)構(gòu)，反應(yīng)在溫和的條件下進(jìn)行且不使用有毒試劑，通過化學(xué)可再生（生物質(zhì)）起始底物，可減少重要化石資源的使用。本文總結(jié)了酶作為催化劑催化高分子聚合的機(jī)理、酶的種類以及酶的固定化技術(shù)，并對(duì)其未來(lái)發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 酶體外催化聚合的反應(yīng)機(jī)理

目前，酶和底物之間的關(guān)系通常被認(rèn)為是分子識(shí)別關(guān)系。對(duì)于體內(nèi)反應(yīng)，天然底物被酶特異性識(shí)別以形成酶-底物復(fù)合物[2，3]。復(fù)合物是由超分子之間的相互作用并激活底物所形成的，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物具有優(yōu)異的選擇控制性。也就是說(shuō)，復(fù)合物的形成對(duì)于發(fā)生反應(yīng)是必要的，其中，基底必須被識(shí)別。對(duì)于酶催化的體外反應(yīng)，人工基底也必須被識(shí)別，形成酶-人工底物復(fù)合物，然后活化人工底物以進(jìn)行反應(yīng)，生成可控選擇性的產(chǎn)物。這種復(fù)合物對(duì)于反應(yīng)是必不可少。因此，體外反應(yīng)人工基底將被設(shè)計(jì)成可以被酶識(shí)別的單體。另外，L.Pauling[4]在1946年提出酶在溫和的反應(yīng)條件下引起催化聚合的具體原理是：酶和底物通過一個(gè)鍵和鎖的化學(xué)交互形成復(fù)合物，激活基底以形成過渡狀態(tài)，促使反應(yīng)進(jìn)行，其中活化能因?yàn)橥ㄟ^酶的穩(wěn)定作用與沒有酶作用的反應(yīng)活化能相比而大大降低，使更多反應(yīng)粒子能擁有不少于活化能的動(dòng)能，從而加快反應(yīng)速率。

催化聚合高分子反應(yīng)的酶的種類主要有氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶3種[5]。

2 催化聚合酶的種類及應(yīng)用

2.1 氧化還原酶

聚芳香族功能高分子在微電子技術(shù)、傳感器、電磁干擾屏蔽和非線性光學(xué)材料等方面有巨大的潛在應(yīng)用前景。近年來(lái)有關(guān)氧化還原酶催化合成芳香族功能聚合物的研究越來(lái)越多[6]，比如大豆過氧化物酶（SBP）和辣根過氧化物酶（HRP）等作為催化劑的投入使用。

Asuri P等[7]首次用辣根過氧化物酶在醋酸鹽緩沖液和水溶性有機(jī)溶劑如1,4-二氧六環(huán)、丙酮或N，N -二甲基甲酰胺（DMF）的混合液中催化苯酚的聚合，該聚合按自由基反應(yīng)進(jìn)行，在H2O2氧化下，單體經(jīng)酶催化生成酚氧自由基，再經(jīng)過重排、偶聯(lián)等反應(yīng)形成聚合物。通過這種方式得到聚合物的過程要比用其他金屬催化劑的催化反應(yīng)環(huán)保且產(chǎn)率高。

M Shinkai等[8]用酶/化學(xué)法也合成了聚氫醌。他們分別以大豆過氧化物酶（SBP）和辣根過氧化物酶（HRP）催化劑、過氧化氫為氧化劑，在1,4-二六氧環(huán)和磷酸鹽緩沖液中催化氧化4-羥基苯基苯甲酸酯，并在堿性條件下水解，脫去苯甲酸酯得到聚氫醌，得到的聚氫醌結(jié)構(gòu)不同于用其他方法合成得到的產(chǎn)物。這說(shuō)明酶催化的聚合物結(jié)構(gòu)具有選擇性。

2.2 轉(zhuǎn)移酶

天然多糖存在于各種來(lái)源，如植物，動(dòng)物，海藻和微生物界中，其具有特定的和非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，這不僅是由于單糖殘基的結(jié)構(gòu)多樣性，還與糖苷鍵的立體和區(qū)域構(gòu)型差異相關(guān)[9]。結(jié)構(gòu)多樣性的多糖作為宿主生物體中的一系列重要體內(nèi)功能材料，能提供能量，充當(dāng)結(jié)構(gòu)材料，賦予材料特定的生物學(xué)性質(zhì)，其中化學(xué)結(jié)構(gòu)的微妙變化對(duì)多糖的性質(zhì)和功能具有很大影響。由于多糖在醫(yī)學(xué)，制藥，化妝品和食品工業(yè)相關(guān)領(lǐng)域中的潛在應(yīng)用前景，人工多糖的制備越來(lái)越受關(guān)注。而酶作為新型高效綠色催化劑在體外合成這種天然多糖高分子中也起到積極作用。

Kadokawa J等[10]用磷酸化轉(zhuǎn)移酶催化α-D-葡萄糖-1-磷酸聚合，在各種疏水性聚合物如聚醚、聚酯、聚（酯-醚）和聚碳酸酯客體聚合物的存在下，以藤蔓的形式在客體分子上合成聚合物淀粉，組裝成直鏈淀粉——聚合物包合絡(luò)合物的多糖超分子。也體現(xiàn)了體外酶對(duì)合成非天然聚合物結(jié)構(gòu)的良好選擇性。

2.3 水解酶

在聚酯和聚酰胺等的合成中，脂肪酶是常用的水解酶類催化劑[11]。聚酯材料具有優(yōu)異的力學(xué)性能，其中脂肪族聚酯及其共聚物具有良好的生物相容性和可降解性，這些特點(diǎn)使得聚酯材料成為高分子材料的重要組成部分。聚酰胺是用于汽車、電氣和電子以及消費(fèi)品行業(yè)中最大的工程聚合物家族之一；因此聚酰胺的酶促合成過程將對(duì)環(huán)境問題產(chǎn)生巨大的影響[12]。

Stavila E等[13]以南極假絲酵母脂肪酶B（CAL-B）為催化劑，通過三階段方法，通過2,5-二羥甲基呋喃這種類似于芳族單體的生物基剛性二醇，合成了一系列具有約2 000 g/mol的數(shù)均分子質(zhì)量（Mn）的新型生物基呋喃聚酯。

Schmidt S等[14]報(bào)道了以南極假絲酵母脂肪酶A（CAL-A），直接通過一鍋兩步酶法，產(chǎn)生的ε-CL進(jìn)行原位開環(huán)合成寡聚-ε-CL。這種方法解決了ε-CL在更高濃度下酶抑制和失活的問題。形成的寡聚-ε-CL是疏水的，方便提取或沉淀分離。盡管聚合物的酶促合成，特別是酶開環(huán)聚合方法，已被充分運(yùn)用，但聚酯的形成需要大量的有機(jī)溶劑，且在有水的情況下聚酯會(huì)發(fā)生水解，大大限制了聚酯的運(yùn)用。但是，脂肪酶CAL-A具有獨(dú)特的?；D(zhuǎn)移酶，盡管存在大量的水，仍能使其有效形成聚酯產(chǎn)物。

3 酶的固定化技術(shù)

酶作為工業(yè)生產(chǎn)過程中的催化劑時(shí)，在溫和的環(huán)境下仍具有高活性，高選擇性和高特異性[15]。然而，游離酶在水溶液中穩(wěn)定性差、易流失、不可回收，導(dǎo)致處理成本過高，限制了其應(yīng)用。因此對(duì)游離酶用固定化技術(shù)將其固定化，使酶在保持其高效、專一及反應(yīng)條件溫和等酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，還具有易操作、高貯存穩(wěn)定性，以及可多次重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，使得酶的使用效率提高，解決酶成本過高的問題，從而使酶催化聚合方法有更廣闊的發(fā)展前景。固定化酶的性能主要取決于固定化方法和所使用的酶固定化載體[16]。常用的酶固定方法主要有物理方法和化學(xué)方法。

3.1 化學(xué)固定化技術(shù)

化學(xué)方法中，常通過醚，硫醚，酰胺或氨基甲酸酯鍵形成共價(jià)鍵。共價(jià)鍵是酶不可逆固定化方法中使用最為廣泛的方法之一[17]。參與酶結(jié)合的官能團(tuán)通常包括通過賴氨酸（ε-氨基），半胱氨酸（硫醇基）和天冬氨酸和谷氨酸的側(cè)鏈，而對(duì)于酶和支持物之間的共價(jià)連接，酶結(jié)合的方向是決定其穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。

Damnjanovíc[18]報(bào)道了共價(jià)結(jié)合的念珠菌脂肪酶是用于流化床反應(yīng)器中產(chǎn)生芳香酯的強(qiáng)大且多功能的生物催化劑，共價(jià)固定的脂肪酶可以催化優(yōu)化的丁酸二牛兒酯的合成，且酶因被固定化而使其使用率大大提高，成本也因此大幅度降低。

Dandavate V等[19]報(bào)道了當(dāng)活性中心氨基酸不參與支持物的結(jié)合時(shí)，酶活性達(dá)到最高水平。與支持物的偶聯(lián)可以2種方式進(jìn)行，且偶聯(lián)速度取決于待固定的分子中存在的活性基團(tuán)的活性大小。這兩種偶聯(lián)方式分別為將反應(yīng)性官能團(tuán)加入到載體中而不進(jìn)行改性，和將載體基質(zhì)改性以產(chǎn)生活化基團(tuán)。在這2種情況下，預(yù)期在載體上產(chǎn)生的親電子基團(tuán)將與蛋白質(zhì)上的強(qiáng)親核試劑反應(yīng)。這種相互作用選擇的矩陣通常包括瓊脂糖，纖維素，聚氯乙烯，離子交換樹脂和多孔玻璃。

3.2 物理固定化技術(shù)

物理方法的特征在于較弱的分子間相互作用，例如氫鍵、疏水相互作用、范德華力、親和力結(jié)合，酶與載體材料的離子結(jié)合，或酶在載體內(nèi)的機(jī)械容納。Flickinger MC等[20]提出物理吸附方法可以被定義為可逆固定的直接方法之一，其涉及的酶被物理吸附或附著到載體材料上。其中吸附可通過弱的非特異性力如范德華力，疏水相互作用和氫鍵發(fā)生。

Brena BM等[21]在離子鍵合中，通過鹽鍵結(jié)合酶。可以在溫和的條件下從載體上除去可逆固定化的酶，如當(dāng)酶活性已經(jīng)衰變時(shí)，載體可被再生和重新裝載新鮮的酶。通過這種方式在一定程度上解決了酶固定化造成的成本流失問題。

Chiou S H等[22]采用物理親和方法成功開發(fā)了使用碳二亞胺偶聯(lián)劑活化殼聚糖的羥基來(lái)將假絲酵母脂肪酶固定化，合成2種類型的殼聚糖珠。并使用化學(xué)分析電子光譜（ESCA）技術(shù)證實(shí)碳二亞胺活化殼聚糖羥基的能力。還研究比較了使用干和濕殼聚糖珠固定的脂肪酶性質(zhì)。其中固定化增強(qiáng)了酶對(duì)pH和溫度變化的穩(wěn)定性，并在濕的固定化脂肪酶中觀察到30 d的高貯存穩(wěn)定性和高活性。

4 展望

酶作為新型催化劑應(yīng)用于高分子聚合反應(yīng)的研究目前還處于初期階段，酶催化合成的生物醫(yī)用、導(dǎo)電功能高分子材料已受到廣泛關(guān)注。它們?cè)谏镝t(yī)學(xué)、光電材料方面顯示了極強(qiáng)的應(yīng)用潛力。但是目前酶的資源有限、價(jià)格昂貴。所以利用固定化酶作為生物催化劑將引起來(lái)自工業(yè)的顯著關(guān)注。固定化技術(shù)可在進(jìn)一步研究酶催化聚合時(shí)節(jié)省成本，并從化學(xué)和分子生物學(xué)角度出發(fā)以現(xiàn)代技術(shù)聯(lián)合工具為手段，將使其得到更廣闊的發(fā)展，從而幫助改善酶固定策略和擴(kuò)大催化庫(kù)。

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Development of catalytic polymerization and lmmobilization technology of enzymes

LIU Yong, SU Ming-ji, JI Ping, CHEN Zhen-qi, HE Pei-xin
(Hubei Collaborative Innovation Center for Advanced Organic Chemical Materials, Key Laboratory for the Synthesis and Application of Organic Functional Molecules of Ministry of Education, College of Chemistry and Chemical Engineering, Hubei University, Wuhan, Hubei 430062, China)

In this paper, the mechanism of enzyme catalyzed polymerization in vitro, the related enzymes that can participate in the catalysis of polymer polymerization and the current research progress on the immobilization technology of enzymes were reviewed. Finally, the research on immobilized enzyme catalyzed polymerization was prospected.

polymerization; enzyme; immobilization technology; research progress; prospect

O643.36

A

1001-5922（2017）12-0062-04

2017-05-18

劉勇（1993-），男，碩士研究生，主要從事高分子材料的合成與性能研究。E-mail：1320398202@qq.com。通訊聯(lián)系人：何培新（1957-），男，教授，博士研究生導(dǎo)師。主要從事功能高分子的制備與性能研究。E-mail：qpxhe@hubu.edu.cn。