葉水送

革命性的基因編輯技術(shù)

葉水送

2016年3月24日，美國(guó)《科學(xué)》雜志發(fā)表了合成生物學(xué)領(lǐng)域一項(xiàng)里程碑式的重要研究，人類基因組研究先驅(qū)克雷格·文特爾(Craig Venter)及其團(tuán)隊(duì)耗費(fèi)20年時(shí)間，設(shè)計(jì)并制造出了一種最簡(jiǎn)單的人工合成生命體，該生命體僅有維持生命所需的473個(gè)基因，是目前已知最小的生命體基因組。據(jù)介紹，研究者利用一種叫做規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR/Cas9)的技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的篩選。該研究有望幫助科學(xué)家更好地了解細(xì)胞中每個(gè)必需基因的功能。

CRISPR/Cas9技術(shù)再次發(fā)揮重要作用。2015年年底，《科學(xué)》雜志“年度十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)”將基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9列為年度科學(xué)發(fā)現(xiàn)榜首。早在2012年和2013年，《科學(xué)》雜志就已將CRISPR納入到年度10大科學(xué)發(fā)現(xiàn)的榜單中，不過彼時(shí)它屬于陪跑的“角色”。如今這種革命性的基因編輯技術(shù)已經(jīng)走入全球各地科學(xué)家的分子生物實(shí)驗(yàn)室中，成為科研工作者探索生命奧秘以及臨床科研人員攻克疾病的有力工具。

革命性的分子生物學(xué)技術(shù)

CRISPR/Cas9技術(shù)從一開始被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在被分子生物學(xué)家廣泛應(yīng)用，并沒有經(jīng)歷很長(zhǎng)的時(shí)間。20世紀(jì)80年代，日本科學(xué)家在細(xì)菌中就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種簡(jiǎn)單重復(fù)的特殊序列。2007年，丹麥哥本哈根一家酸奶公司研究者魯?shù)婪颉ぐ腿焦?Rodolphe Barrangou)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中擁有抵御病毒的特殊防御機(jī)制，隨后細(xì)菌的防御機(jī)制與這種特殊序列即CRISPR序列之間的關(guān)聯(lián)被闡述清楚。近年來(lái)，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行的研究快速增長(zhǎng)。由于其能高效地對(duì)基因特定位點(diǎn)進(jìn)行編輯，而且簡(jiǎn)單易行，因此CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)現(xiàn)被視為分子生物學(xué)的一個(gè)奇跡。

隨著近些年來(lái)科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)現(xiàn)一系列的重要科學(xué)問題，該技術(shù)備受矚目。其中最重要的兩項(xiàng)研究是修飾不同物種的基因序列以及編輯人類胚胎細(xì)胞的基因組，它們的出現(xiàn)都給現(xiàn)有科學(xué)倫理規(guī)范提出巨大的挑戰(zhàn)。2015年年初，中山大學(xué)學(xué)者黃軍就利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)一組不能正常發(fā)育的受精卵進(jìn)行基因編輯，隨即這項(xiàng)研究引起國(guó)際社會(huì)的強(qiáng)烈議論。該研究亦成為2015年12月份在華盛頓召開的國(guó)際人類基因編輯峰會(huì)(International Summiton Human Gene Editing)的一個(gè)重要導(dǎo)火索。大會(huì)達(dá)成共識(shí)：當(dāng)前利用CRISPR技術(shù)對(duì)人類胚胎細(xì)胞基因進(jìn)行修飾的臨床應(yīng)用，是“不負(fù)責(zé)任”(irresponsible)的舉動(dòng)。2016年4月，由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院范勇領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)，完成全球第二例人類胚胎基因編輯，該研究同樣引起國(guó)際同行的高度關(guān)注。

CRISPR系統(tǒng)擁有如此強(qiáng)大的能力，以至于科學(xué)家很容易地創(chuàng)造出基因型完全不同的生命體?！蹲匀弧冯s志主編菲利普·坎貝爾(Philip Campbell)博士曾表示：“業(yè)余科學(xué)家在自家車庫(kù)中就可利用它來(lái)實(shí)現(xiàn)基因編輯?！边@些地方往往是科學(xué)倫理不能約束的空白區(qū)域，因此加強(qiáng)CRISPR/Cas9技術(shù)的倫理規(guī)范顯然很重要。

事實(shí)上，基因編輯技術(shù)并不很新鮮，此前還有鋅指核糖核酸酶(ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)等技術(shù)。相比前面兩項(xiàng)技術(shù)，CRISPR/Cas9技術(shù)要簡(jiǎn)單很多，以至于“每個(gè)分子生物實(shí)驗(yàn)室都可用CRISPR技術(shù)編輯基因”。CRISPR/Cas9技術(shù)的原理大體如下：當(dāng)病毒如噬菌體的DNA序列進(jìn)入細(xì)菌中時(shí)，細(xì)菌的前導(dǎo)序列(leader sequence)會(huì)啟動(dòng)CRISPR序列，開始合成兩種R N A：CRISPR RNA(crRNA)與反式激活crRNA(tracrRNA)，二者結(jié)合形成RNA復(fù)合體，即sgRNA(singleguide RNA)，然后再與Cas9核酸酶形成RNA-蛋白復(fù)合體。如果是人為設(shè)計(jì)，由特定序列組成的sgRNA，可指引RNA-蛋白復(fù)合體中的Cas9核酸酶對(duì)病毒或外源性DNA序列的特定位點(diǎn)進(jìn)行編輯，從而實(shí)現(xiàn)基因序列的精準(zhǔn)剪輯(圖1)。CRISPR系統(tǒng)的最早發(fā)現(xiàn)者之一、加州伯克利分校的分子生物學(xué)家詹妮弗·杜德納(Jennifer Doudna)表示：“它就像PCR技術(shù)，一個(gè)潛藏在工具箱里的工具”。

CRISPR/Cas9技術(shù)也有短板，其效率以及脫靶問題備受關(guān)注。例如，最近文特爾就表示：“如果只是對(duì)基因序列進(jìn)行簡(jiǎn)單地編輯，CRISPR/Cas9技術(shù)可以勝任，但是如果想利用它來(lái)設(shè)計(jì)新生命體，CRISPR/Cas9還遠(yuǎn)滿足不了需求?！?/p>

圖1 CRISPR/Cas9技術(shù)原理簡(jiǎn)圖。CRISPR序列廣泛存在于細(xì)菌以及古生菌中，是細(xì)菌用來(lái)抵御病毒的防御機(jī)制。步驟1、2：當(dāng)細(xì)菌發(fā)現(xiàn)有病毒入侵時(shí)，細(xì)菌的CRISPR系列會(huì)啟動(dòng)合成RNA；步驟3、4：新合成的RNA與Cas9核酸酶形成復(fù)合體；步驟5、6：復(fù)合體中的Cas9核酸酶能夠敲除或敲入特定序列的基因片段(圖片來(lái)自theglobeandmail.com)

基因編輯技術(shù)的專利糾紛

有關(guān)CRISPR技術(shù)的專利糾紛，似乎早已讓這一領(lǐng)域的數(shù)位先驅(qū)科學(xué)家——博德研究所(Broad Institute)的張鋒、加州大學(xué)伯克利分校的杜德納以及德國(guó)亥姆霍茲傳染研究中心的埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)之間的關(guān)系降到冰點(diǎn)。最近一則獲獎(jiǎng)消息，或許可以彌合他們之間長(zhǎng)久以來(lái)的嫌隙。2016年3月23日，素有“小諾貝爾獎(jiǎng)”之美譽(yù)的加拿大蓋爾德納獎(jiǎng)(Canada Gairdner Awards)公布，張鋒、杜德納以及卡彭蒂耶“因?qū)⒒蚓庉嫾夹g(shù)CRISPR-CAS應(yīng)用于真核細(xì)胞所作出的努力”(“for development of CRISPR-CAS as a genome editing tool for eukaryotic cells”)而獲得蓋爾德納國(guó)際獎(jiǎng)(Canada Gairdner International Awards)(圖2)。值得注意的是，蓋爾德納基金會(huì)謹(jǐn)慎地使用了“development”(發(fā)展)，而不是“finding”(發(fā)現(xiàn))，也許這樣避免了三人長(zhǎng)期以來(lái)因誰(shuí)最早發(fā)明CRISPR基因編輯技術(shù)而引起的糾紛。截止到2012年，曾獲得蓋爾德納獎(jiǎng)的300多名獲獎(jiǎng)?wù)咧校延?2名獲獎(jiǎng)?wù)咄瑫r(shí)也獲得諾貝爾獎(jiǎng)，因此該獎(jiǎng)項(xiàng)有“小諾貝爾獎(jiǎng)”之稱。

自2014年CRISPR技術(shù)首次獲得科學(xué)突破獎(jiǎng)(Breakthrough Prize)的認(rèn)可后，杜德納和卡彭蒂耶連連獲得包括科學(xué)突破獎(jiǎng)以及阿爾珀特獎(jiǎng)在內(nèi)的數(shù)個(gè)國(guó)際科學(xué)大獎(jiǎng)，張鋒則與之失之交臂。此次獲得蓋爾德納獎(jiǎng)，無(wú)疑增加了他的信心。他表示：“榮獲蓋爾德納獎(jiǎng)是對(duì)我整個(gè)團(tuán)隊(duì)的高度認(rèn)可，我也因能夠與CRISPR領(lǐng)域的其他幾位先鋒學(xué)者一同獲獎(jiǎng)感到非常榮幸?！痹诨蚓庉嫾夹g(shù)CRISPR早期開發(fā)上，另一位科學(xué)家哈佛大學(xué)喬治·徹奇(George Church)教授的貢獻(xiàn)可圈可點(diǎn)，但他仍與諸多國(guó)際大獎(jiǎng)無(wú)緣。

張鋒與杜德納和卡彭蒂三人共同獲獎(jiǎng)，是否意味著未來(lái)有關(guān)CRISPR專利的糾紛會(huì)到此為止？實(shí)際的情況并不妙，而且頗有愈演愈烈之勢(shì)。原本張鋒或在CRISPR專利上占據(jù)有利位置，現(xiàn)在可能會(huì)被削弱。張鋒在申請(qǐng)過程中，被競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手認(rèn)為采取了“非正當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)手段”的快速通道：晚申請(qǐng)專利，卻率先獲得CRISPR專利。目前，杜德納仍在積極地爭(zhēng)取CRISPR專利權(quán)，美國(guó)專利與商標(biāo)局已于2016年3月10日啟動(dòng)對(duì)CRISPR專利歸屬的干涉程序。除非是兩家機(jī)構(gòu)自己達(dá)成妥協(xié)，CRISPR專利之爭(zhēng)在短時(shí)間內(nèi)不會(huì)結(jié)束。

圖2 2016年蓋爾德納獎(jiǎng)獲得者張鋒(左)、杜德納(中)和卡彭蒂耶(右)(張鋒照片來(lái)自MIT大學(xué)網(wǎng)站，杜德納照片來(lái)自WIKI，卡彭蒂耶照片來(lái)自podcastscience)

CRISPR技術(shù)在科學(xué)以及商業(yè)上潛力無(wú)限

CRISPR專利之爭(zhēng)之所以難以解決，不僅在于這種革命性技術(shù)已經(jīng)成為研究者的科研利器，同時(shí)它也能源源不斷地帶來(lái)商業(yè)上的利益，任何人都希望將CRISPR專利拽在手中。由張鋒、杜德納以及徹奇創(chuàng)立的生物技術(shù)公司Editas Medicine在Google等公司的投資下，最終登陸美國(guó)納斯達(dá)克上市。緣于專利糾紛，杜德納中途選擇離開Editas Medicine公司，重新創(chuàng)立另一基因編輯公司Caribou Biosciences。

目前基于CRISPR技術(shù)的基因編輯公司，不僅能夠建立不同需求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，同時(shí)也有可能在數(shù)個(gè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)對(duì)人類相關(guān)疾病進(jìn)行治療的突破。因?yàn)樵趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)中，研究者已經(jīng)利用該技術(shù)修復(fù)了部分小鼠所患的遺傳疾病。例如研究者對(duì)患遺傳性白內(nèi)障小鼠的基因突變進(jìn)行修復(fù)，消除了小鼠的白內(nèi)障癥狀。盡管未來(lái)這一技術(shù)在人類生殖細(xì)胞上的應(yīng)用紅線仍不可能被跨越，但終有一天，該技術(shù)很有可能會(huì)突破現(xiàn)有的倫理禁忌，使用于人類體細(xì)胞的基因缺陷修復(fù)上，從而造福于人類。

注：本文部分內(nèi)容來(lái)自作者寫在《知識(shí)分子》微信公眾號(hào)的文章中。

(2016年4月7日收稿)■

(編輯：段艷芳)

CRISPR/Cas 9 gene editing technology: Will it revolutionize molecular biology

YE Shuisong

10.3969/j.issn.0253-9608.2016.02.013

?通信作者，E-mail: yeshuisong@gmail.com