袁海霞，湯 陽，汪瀚韜，孔文韜，王文平. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院超聲科，上海 0003；. 江蘇省南京鼓樓醫(yī)院超聲科，江蘇 南京 0008

靶向血管內(nèi)皮生長因子受體2超聲造影劑的制備及其體外尋靶能力實(shí)驗(yàn)研究

袁海霞1，湯 陽1，汪瀚韜1，孔文韜2，王文平1
1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院超聲科，上海 200032；
2. 江蘇省南京鼓樓醫(yī)院超聲科，江蘇 南京 210008

目的：制備靶向血管內(nèi)皮生長因子受體2 (vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)超聲造影劑，評價(jià)其物理性質(zhì)及對腫瘤細(xì)胞的尋靶能力。方法：利用生物素-親和素橋接法將微米級超聲造影劑USphere與VEGFR2抗體結(jié)合，制備靶向VEGFR2超聲造影劑，檢測其粒徑分布；用免疫熒光法檢測不同細(xì)胞株(高轉(zhuǎn)移肝腫瘤細(xì)胞MHCC-97H及正常肝細(xì)胞LO2)中VEGFR2表達(dá)強(qiáng)度，以及靶向與非靶向VEGFR2超聲造影劑對MHCC-97H和LO2細(xì)胞的結(jié)合能力。結(jié)果：靶向VEGFR2超聲造影劑微泡分布均勻，平均粒徑(1 012.67±78.59) nm，免疫熒光法顯示VEGFR2抗體可特異性連接于微泡表面。標(biāo)記熒光的VEGFR2抗體在MHCC-97H細(xì)胞高表達(dá)，在LO2細(xì)胞低表達(dá)。免疫熒光定量顯示靶向VEGFR2造影劑在MHCC-97H細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度比值(微泡熒光強(qiáng)度/細(xì)胞熒光強(qiáng)度)為0.75±0.32，顯著高于其他3組(P＜0.01)。結(jié)論：本研究成功制備靶向VEGFR2超聲造影劑，其大小穩(wěn)定均一，可與高表達(dá)VEGFR2的MHCC-97H細(xì)胞特異性結(jié)合。

靶向超聲造影劑；生物素-親和素；血管內(nèi)皮生長因子受體2；超聲分子成像；腫瘤血管生成

腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)起重要作用。血管內(nèi)皮生長因子受體2 (vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)在多種腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高度表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)[1-4]。以VEGFR2為靶點(diǎn)，旨在減少腫瘤內(nèi)血管生成，從而抑制腫瘤生長的靶向藥物已進(jìn)入臨床使用階段[5-6]。目前，臨床上實(shí)體腫瘤療效的評價(jià)體系采用實(shí)體瘤療效評價(jià)新標(biāo)準(zhǔn)(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)及改良實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(modified Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，mRECIST)。這些評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)仍是基于腫瘤最大平面的長徑變化及腫瘤數(shù)目的多少來反映靶向治療對腫瘤是否有效，但在早期反映腫瘤病灶內(nèi)血管生成改變方面有欠缺[7-9]。因此，臨床上迫切需要找到一種能早期、準(zhǔn)確、無創(chuàng)反映腫瘤內(nèi)微血管灌注變化的評價(jià)手段，從而更早發(fā)現(xiàn)腫瘤對治療是否應(yīng)答。

Baetke等[10]將靶向VEGFR2微泡造影劑(BR55，Bracco公司)用于裸鼠皮下移植瘤模型顯像中，發(fā)現(xiàn)其可特異性顯示瘤內(nèi)血流灌注改變。然而，這種商品化的靶向造影劑不利于轉(zhuǎn)換其他靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究。因此，本研究嘗試?yán)蒙锼?親和素法，將微米級超聲造影劑USphere與VEGFR2抗體結(jié)合，以期獲得一種制作簡便的靶向VEGFR2微泡造影劑，并對其粒徑分布及體外肝腫瘤細(xì)胞尋靶能力進(jìn)行探討，為后續(xù)腫瘤治療監(jiān)測提供研究基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

超聲造影劑USphere? Labeler購自臺(tái)灣博信生物科技公司，生物素化大鼠抗小鼠CD309 單抗、VEGFR2抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記小鼠抗大鼠IgG2a購自美國BioLegend公司，磷酸鹽緩沖液(phosphate bufered saline，PBS)購自ThermoFisher Scientifc公司，Alexa fluor555購自美國Life Technology公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司，青/鏈霉素溶液購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株MHCC-97H、正常肝細(xì)胞株LO2來自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝病研究所。AM-1高速振蕩器為臺(tái)灣Monitex公司產(chǎn)品，低速離心機(jī)(3-18KS)為德國Sigma公司產(chǎn)品，納米粒度電位分析儀Nano ZS90為英國馬爾文儀器有限公司產(chǎn)品，激光共聚焦顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 靶向VEGFR2微泡造影劑的制備及理化性質(zhì)測定

按USphere? Labeler說明書，將微泡溶液室溫下置于專用高速振蕩器內(nèi)振蕩40 s活化。將活化后的微泡與生物素化VEGFR2單抗在室溫下混合15 min，混合比例根據(jù)產(chǎn)品說明書(0.7 nmol抗體/mL USphere? Labeler微泡)，1 000 r/min離心3 min，棄下清，PBS洗3次，獲得制備完成的靶向微泡。非靶向及靶向微泡懸液分別用PBS稀釋1 000倍，粒度分析儀測定微泡粒徑分布。VEGFR2抗體與FITC標(biāo)記的熒光二抗4 ℃避光反應(yīng)10 min，1 000 r/min離心3 min，棄上清，獲得熒光標(biāo)記VEGFR2抗體。將該抗體與USphere微泡接靶并離心洗滌，棄下清，獲得熒光標(biāo)記的靶向微泡。用PBS稀釋100倍后，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察微泡形態(tài)。

1.3 免疫熒光測定不同細(xì)胞株中VEGFR2的表達(dá)

在37 ℃、5% CO2孵箱中，用含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株MHCC-97H和正常肝細(xì)胞株LO2，每 2～3 d傳代1次。收集對數(shù)生長期MHCC-97H、LO2細(xì)胞，消化離心，取200 uL 細(xì)胞懸液(1×105/mL細(xì)胞密度)接種于鋪有蓋玻片的12孔板中，加入DMEM培養(yǎng)液，于孵箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。第2天加入標(biāo)記Alexa fuor555的VEGFR2單抗(1∶50稀釋)共孵育30 min，PBS洗3次，多聚甲醛固定，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，共聚焦顯微鏡下觀察不同細(xì)胞表達(dá)VEGFR2的熒光強(qiáng)度。

1.4 靶向造影劑體外尋靶能力

同1.3方法培養(yǎng)上述兩種細(xì)胞，接種于12孔板中，每種細(xì)胞接種4孔。分別加入標(biāo)記FITC的靶向造影劑和非靶向造影劑(1∶20稀釋)，于培養(yǎng)箱中共孵育30 min，多聚甲醛固定，PBS洗3次，DAPI染色。共聚焦顯微鏡下觀察不同細(xì)胞表達(dá)FITC的熒光強(qiáng)度，20倍鏡下每孔于左上、左下、中央、右上、右下掃描拍片，ImageJ軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 靶向造影劑的理化性質(zhì)

熒光顯微鏡下放大400倍，顯示FITC標(biāo)記的靶向VEGFR2微泡呈彼此分散、較均勻的綠色透亮圓形空泡(圖1B)。粒徑分析結(jié)果顯示，新鮮配制的靶向微泡平均粒徑為(1 012.67±78.59 ) nm (n=3)。粒徑分布圖顯示，粒徑大小均一，離散度小(圖1 A) 。

圖1 靶向VEGFR2微泡粒徑分布圖及熒光顯微鏡下FITC標(biāo)記的靶向VEGFR2微泡形態(tài)(×400)

2.2 免疫熒光檢測MHCC-97H和LO2細(xì)胞中VEGFR2表達(dá)強(qiáng)度

激光共聚焦熒光顯微鏡下放大400倍，顯示Alexa fuor555標(biāo)記的紅色VEGFR2單抗與MHCC-97H細(xì)胞結(jié)合強(qiáng)度(圖2 A)明顯高于LO2細(xì)胞(圖2 B)(藍(lán)色部分為DAPI染色的細(xì)胞核)。表明VEGFR2在MHCC-97H細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常肝細(xì)胞中低表達(dá)。

圖2 標(biāo)記Alexa fluor555的VEGFR2抗體與MHCC-97H、LO2細(xì)胞結(jié)合的熒光照片(×400)

2.3 靶向造影劑對腫瘤細(xì)胞的尋靶能力

激光共聚焦熒光顯微鏡下，放大200倍，MHCC-97H細(xì)胞加靶向VEGFR2微泡組中，F(xiàn)ITC標(biāo)記的靶向微泡與DAPI染色的細(xì)胞核熒光比值(圖3 A)明顯高于其余3組(圖3 B、3 C、3 D)。熒光顯微鏡照片顯示，靶向VEGFR2微泡與MHCC-97H細(xì)胞共孵育后，MHCC-97H細(xì)胞周圍綠色熒光明顯多于其余3組，表明靶向VEGFR2微泡可特異性結(jié)合于高表達(dá)VEGFR2的MHCC-97H細(xì)胞表面。

圖3 MHCC-97H和LO2細(xì)胞與靶向、非靶向微泡結(jié)合熒光照片(熒光顯微鏡，×200)

用ImageJ軟件對靶向與非靶向VEGFR2微泡分別作用于MHCC-97H細(xì)胞及LO2細(xì)胞的圖像進(jìn)行分析，計(jì)算FITC標(biāo)記的靶向微泡熒光與DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核熒光的比值。結(jié)果顯示，靶向VEGFR2微泡與MHCC-97H細(xì)胞共孵育組中微泡與細(xì)胞核的熒光比值為0.75±0.32，與其余3組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01) (圖4) 。

圖4 ImageJ軟件計(jì)算各組微泡熒光與細(xì)胞核熒光的比值

3 討 論

腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中有多種機(jī)制參與。近年來，針對腫瘤治療的方法中，以抑制腫瘤血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的靶向治療發(fā)展迅速。由于腫瘤的耐藥性及個(gè)體差異，臨床需一種能早期發(fā)現(xiàn)治療有效性的評估手段。影像學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)RECIST 及mRECIST根據(jù)腫瘤體積或病灶數(shù)量的變化來監(jiān)測實(shí)體腫瘤治療的療效，缺點(diǎn)是無法在腫瘤大小發(fā)生變化之前反映腫瘤內(nèi)血流灌注強(qiáng)度的改變。本研究探討了一種靶向VEGFR2的微米級超聲微泡在評估腫瘤血管生成中的作用。微米級超聲造影劑因大小限制，不能通過腫瘤血管內(nèi)皮間隙，可通過血液循環(huán)主動(dòng)靶向于腫瘤血管內(nèi)皮VEGFR2，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的特異顯像或藥物的定向釋放功能。

超聲造影劑結(jié)合配體的方法主要有吸附法、摻入法、交聯(lián)法和抗體衍生法[11-12]。生物素-親和素橋接法作為最常用的制作靶向微泡造影劑的方法之一，具有簡便、穩(wěn)定、敏感、多靶點(diǎn)、結(jié)合率高等優(yōu)勢[13-14]。本研究采用這一方法，將商品化的USphere超聲造影劑與VEGFR2單抗結(jié)合，成功制備了以腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGFR2為靶點(diǎn)的超聲造影劑，熒光顯微鏡顯示微泡大小均一，均值在1 012.67 nm，無聚集，可用于后續(xù)超聲特異顯像。USphere超聲造影劑活化簡便，活化前可長期存儲(chǔ)，親和素化的結(jié)構(gòu)使其外接VEGFR2抗體簡單易行，且可重復(fù)性和穩(wěn)定性強(qiáng)。這些均為后續(xù)動(dòng)物體內(nèi)顯像研究及靶向其他特異腫瘤靶點(diǎn)提供了良好的材料學(xué)基礎(chǔ)。

肝癌靶向治療以索拉菲尼和貝伐單抗為代表[15-17]。腫瘤細(xì)胞中VEGFR2表達(dá)高于正常肝細(xì)胞。本研究選擇人高轉(zhuǎn)移肝腫瘤細(xì)胞株MHCC-97H和正常肝細(xì)胞株LO2進(jìn)行對照，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符，證實(shí)MHCC-97H細(xì)胞內(nèi)VEGFR2表達(dá)顯著高于正常肝細(xì)胞LO2[18]。進(jìn)一步的靶向微泡實(shí)驗(yàn)顯示，靶向VEGFR2微泡與高表達(dá)VEGFR2的MHCC-97H細(xì)胞結(jié)合能力顯著強(qiáng)于非靶向造影劑組及正常肝細(xì)胞LO2組。超聲造影是通過接收微泡造影劑的背向散射信號進(jìn)行顯像，配合定量分析技術(shù)，可嘗試在動(dòng)物體內(nèi)檢測腫瘤內(nèi)與正常肝實(shí)質(zhì)內(nèi)超聲強(qiáng)度及定量指標(biāo)的差異，來反映腫瘤內(nèi)血流灌注的改變。針對細(xì)胞的靶向微泡結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作為動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)。

本研究存在一定的局限性。如靶向造影劑的內(nèi)徑約1 μm，在正常情況下無法穿過腫瘤血管內(nèi)皮間隙，因此仍屬于血池造影劑，無法對直接靶向腫瘤細(xì)胞進(jìn)行顯像或載藥治療[19-20]。然而，本研究旨在評估腫瘤血管灌注，用該靶向造影劑特異反映腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長狀態(tài)改變的目的是可以達(dá)到的。本研究結(jié)果可作為靶向腫瘤血管內(nèi)皮的特異性顯像及治療的研究基礎(chǔ)，早期反映腫瘤血管內(nèi)皮生成變化，從而建立一種新的超聲造影定量評價(jià)靶向治療的體系。此外，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中也可考慮將這種造影劑外接其他單抗，用于不同腫瘤的特異顯像。

綜上所述，本研究成功制備了一種靶向VEGFR2微泡造影劑，方法簡便，微泡大小均一穩(wěn)定，能特異性地與高表達(dá)VEGFR2的MHCC-97H細(xì)胞高度結(jié)合，可作為一種較可靠的監(jiān)測腫瘤血管內(nèi)皮VEGFR2表達(dá)的分子影像學(xué)探針。

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Preparation of vascular endothelial growth factor receptor 2-targeted ultrasonic contrast agent and its ability of targeting tumor cells in vitro

YUAN Haixia1, TANG Yang1, WANG Hantao1, KONG Wentao2, WANG Wenping1
(1. Department of Ultrasound, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2. Department of Ultrasound, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China)

WANG Wenping E-mail: puguang61@126.com

Objective:To evaluate the targeting ability of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2)-targeted microbubbles to tumor cells and its preparation process.Methods:VEGFR2-targeted microbubbles were accomplished by biotinavidin linkage of VEGFR2 antibody and USphere ultrasonic contrast agent. The features were detected by dynamic light scattering (DLS) and laser scanning confocal microscope (LSCM). The VEGFR2 expression intensities in MHCC-97H cells (high metastatic human hepatic carcinoma cells) and LO2 cells (human liver cells) were compared by immunofuorescence method. The combination rates of VEGFR2-targeted microbubbles and non-targeted micro bubbles with both cell lines were documented by quantitative immunofluorescence technique.Results:VEGFR2-targeted microbubbles were distributed evenly with average particle size of (1 012.67±78.59) nm. Immunofuorescence assay showed green fuorescence visible on the surface of the targeted micro bubbles. The immunofuorescence signal was higher in MHCC-97H cells than that in LO2 cells. The fuorescence signal ratio of VEGFR2-targeted microbubbles was (0.75±0.32) in MHCC-97H cells, which was signifcantly higher than that in other three groups (P＜0.01).Conclusion:VEGFR2-targeted microbubbles with a stable average size are successfully prepared. The micro bubbles could specifcally combind with VEGFR2-high-expressing MHCC-97H cells.

Targeted ultrasonic contrast agent; Biotin-advidin; Vascular endothelial growth factor receptor 2; Molecular ultrasound imaging; Tumor angiogenesis

R445.1

A

1008-617X(2016)04-0322-05

2016-11-17

2016-12-11）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No：81371577；81571676)

王文平 E-mail：puguang61@126.com