薛純 李艷 李佳 牟德華*

1（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018）2（河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

·基礎(chǔ)研究·

自選乳酸菌發(fā)酵核桃乳香氣物質(zhì)研究

薛純1*李艷1，2李佳1牟德華1**

1（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018）2（河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

核桃屬堅果類食物，營養(yǎng)價值極高。核桃仁含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、不飽和脂肪酸和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，是天然的保健食品。核桃仁具有預(yù)防高血脂、高血壓、增強記憶力、延年益壽的功能。乳酸菌是與人類生活密切相關(guān)的一類微生物，是人體和動物腸道的優(yōu)勢菌群，具有調(diào)節(jié)腸道平衡、降低膽固醇、抑制腸道腐敗菌生長及減少腸道腐敗產(chǎn)物的功能。乳酸菌發(fā)酵核桃乳除可保留核桃的營養(yǎng)功能成分外，還可賦予核桃乳特有的乳酸及其他乳酸菌代謝產(chǎn)物，使發(fā)酵核桃乳產(chǎn)生清香、醇香和脂香，且乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的多種蛋白水解酶可使蛋白水解為小分子肽和氨基酸，有利于人體的消化吸收。目前國內(nèi)發(fā)酵型核桃乳的研究和產(chǎn)品很少，主要原因是核桃乳內(nèi)可發(fā)酵性糖含量較低，缺少合適的專用菌種，且產(chǎn)品風(fēng)味存在明顯的缺陷。

本研究采用自選乳酸菌對核桃乳進行發(fā)酵，利用頂空固相微萃取和氣相色譜質(zhì)譜（HP-SPME/ GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析檢測核桃乳發(fā)酵和后熟過程中的香氣物質(zhì)變化，全面評估發(fā)酵核桃乳的香氣成分，為自選乳酸菌的工業(yè)化應(yīng)用和高品質(zhì)發(fā)酵型核桃乳的產(chǎn)品開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃仁，河北養(yǎng)元智匯飲品股份有限公司。

乳酸菌，植物乳桿菌亞種（Lactobacillus plantarum subsp.）KDLLL1-1、意大利腸球菌（Enterococcus italicus）KDLLJ3-1，由本研究室分別從羊羔美酒大曲和開菲爾粒中分離篩選得到，經(jīng)過重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（repetitive sequence-based polymerase chain reaction，Rep-PCR）技術(shù)和16SrDNA序列分析的分子鑒定，并將所得基因序列的測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進行登陸，經(jīng)過BLAST相似性比對確定屬種，登錄號分別為KC454277和KC454280。

氯化鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜-5975質(zhì)譜，HP-5色譜柱( 30.0 μm×0.25 μmm，0.25 μm)，美國Agilent公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠；20 mL頂空萃取瓶，石家莊大晉科技有限公司；手動固相微萃取手柄、磁子及二乙烯基苯-羧乙基-聚二甲基硅氧烷的萃取頭，美國Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵核桃乳的制備

去除核桃仁中的癟仁、壞仁和雜質(zhì)等，用0.5%NaOH水溶液浸泡，并煮沸5 min，棄去堿液，用高壓水槍沖去核桃仁表面的種皮，再用清水洗滌去除核桃仁表面殘留的堿液，直至洗滌水pH值呈中性。按照料液比1∶7（g∶mL）用50℃溫水磨漿12 min，將磨好的核桃漿液用紗布過濾，棄去濾渣。濾液用均質(zhì)機在20 MPa下均質(zhì)2次，85℃滅菌15 min，自然冷卻至室溫。接種經(jīng)活化和馴化后的乳酸菌，接種量為108cfu/mL，植物乳桿菌亞種和意大利腸球菌的比例為2∶1，控溫40℃，發(fā)酵12 h，降溫至4℃后熟21 d，分別檢測發(fā)酵前和發(fā)酵2 h、6 h、12 h以及后熟1 d、7 d、14 d、21 d的香氣物質(zhì)。

1.3.2 核桃乳中香氣物質(zhì)的檢測

1.3.2.1 香氣物質(zhì)萃取

采用頂空固相微萃?。℉P-SPME）法提取核桃乳中的香氣物質(zhì)。取5 mL試樣，加入2 g干燥的氯化鈉，放于20 mL頂空萃取瓶中，加磁力攪拌轉(zhuǎn)子，蓋密封墊和鋁蓋，用壓桿鉗密封，用2 cm-50/ 30 μm DVB/Carboxen/PDMS萃取頭針管穿透樣品瓶隔墊，調(diào)整插入長度，放入50℃攪拌水浴鍋中，平衡15 min，推手柄使纖維頭伸出針管萃取吸附30 min，取出手柄直接進樣，250℃下解吸3 min。

1.3.2.2 香氣物質(zhì)的測定

采用氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用檢測核桃乳中香氣物質(zhì)。氣相色譜條件：載氣為氦氣（99.999%），流速1.0 mL/min；升溫程序為40℃保持12 min，以3℃/min升至108℃保持2 min，再以5℃/min升至250℃保持5 min，進樣口溫度250℃。質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；電離方式為EI，電子能量70 ev；掃描質(zhì)量范圍為45 amu～550 amu。

1.3.2.3 香氣物質(zhì)的定性與定量

核桃乳中的香氣物質(zhì)定性采用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，并通過檢索和查閱相關(guān)文獻作為參考。香氣物質(zhì)的定量采用總香氣物質(zhì)峰面積歸一化法進行各種香氣物質(zhì)相對含量的計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個樣品均經(jīng)過6次測定，結(jié)果取平均值，并使用SPSSStatistical 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃乳中香氣物質(zhì)分析

采用HP-SPME/GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測發(fā)酵前核桃乳，以及發(fā)酵和后熟過程中香氣物質(zhì)的含量，結(jié)果見下頁表1。

由表1可知，核桃乳發(fā)酵前，共檢測到47種香氣物質(zhì)，占總揮發(fā)性物質(zhì)的56.12%，以醇類和醛類物質(zhì)為主，特別是正己醇和正己醛相對含量較高，分別占香氣物質(zhì)含量的14.52%和13.92%，這也是導(dǎo)致核桃乳中呈現(xiàn)生味和油脂味的主要原因。Kobayashi等人研究了這些生的油脂味是在打漿過程中核桃中的亞麻酸、亞油酸等在脂氧合酶及氧氣的共同作用下催化生成的，主要是醛、醇類物質(zhì)。劉志強等人在研究去除大豆生味中表示，在加工過程中脂肪氧合酶的活性增強，會形成較多的生油脂味物質(zhì)，即使加熱也不能夠去除。

發(fā)酵12 h和后熟21 d的核桃乳中，香氣物質(zhì)含量提高了28.56%，香氣物質(zhì)的種類和含量也有很大區(qū)別，醇類、酸類和酮類含量明顯增加，分別提高110.95%、158.41%和178.47%。發(fā)酵前核桃乳中的主體香氣物質(zhì)正己醇在發(fā)酵結(jié)束時含量最高，達到總香氣物質(zhì)的52.59%，而正己醛含量卻明顯降低，由13.92%減少到0.35%，可能的原因是在乳酸菌脂肪代謝過程中，正己醛在乙醇脫氫酶的作用下生成己醇。經(jīng)過乳酸菌的發(fā)酵后，醛類物質(zhì)含量以及種類降低，這與Achouri的研究結(jié)果一致，己醛只要存在就會產(chǎn)生令人不愉快的氣味，對核桃乳口感影響很大，說明乳酸菌發(fā)酵在一定程度可以改善核桃乳的生味和油脂味。

發(fā)酵核桃乳在4℃下后熟，物質(zhì)含量變化最大的是酮類，其中乙偶姻（3-羥基-2-丁酮）最為顯著，其含量由0.10%增長到18.24%，它主要是在發(fā)酵后期以及后熟過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)。在乳酸菌的代謝作用下，檸檬酸通過檸檬酸裂解酶分解為乙酸和草酰乙酸，草酰乙酸進一步轉(zhuǎn)化為二氧化碳和丙酮酸。從丙酮酸到雙乙?？赡艽嬖谝韵?種途徑：①丙酮酸與焦磷硫胺素生成活性乙醛，活性乙醛與乙酰輔酶-A縮合后經(jīng)酶的裂解生成雙乙酰；②活性乙醛與其他丙酮酸鹽分子縮合，經(jīng)酶作用形成α-乙酰乳酸，在高氧化-還原條件下，α-乙酰乳酸被氧化形成雙乙酰，而在缺氧條件下形成3-羥基丁酮，3-羥基丁酮在氧氣充足條件下又進一步氧化為雙乙酰。雙乙酰是乙偶姻的還原形式，丁酮類、2-庚酮的閾值較低，主要表現(xiàn)出清香、脂香和甜香，很可能是其發(fā)酵產(chǎn)生的特征香氣成分。發(fā)酵核桃乳中正己醇和乙偶姻成為主體香氣物質(zhì)，分別占總香氣物質(zhì)的49.08%和25.28%，使發(fā)酵核桃乳具有了芳香和奶油香氣。

2.2 核桃乳發(fā)酵前后香氣的比較

核桃乳在發(fā)酵前醇類、醛類的含量相對較高，經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后，香氣物質(zhì)種類發(fā)生明顯變化，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，醇類、酸類、酮類的含量相對較高，分別為41.81%、8.14%、18.47%，醇類中的正己醇和酮類中的乙偶姻，是乳制品發(fā)酵后的特征香氣物質(zhì)。醛類物質(zhì)含量明顯下降，由19.13%降到1.12%，這也是發(fā)酵后油脂味減少的主要原因。酯類物質(zhì)含量也減少，由5.99%降到1.61%，烯類物質(zhì)在發(fā)酵后消失。

圖1 核桃乳發(fā)酵前后香氣物質(zhì)變化

2.3 數(shù)據(jù)因子分析

根據(jù)因子分析的有關(guān)信息，在因子分析前，需要對數(shù)據(jù)是否適合做因子分析進行可行性檢驗，利用SPSS軟件處理，KMO和Bartlett的檢驗結(jié)果見表2。

表2 KMO和Bartlett的檢驗

KMO測度的值越高（接近1.0時），表明變量間的共同因子越多，研究數(shù)據(jù)適合采用因子分析。通過檢驗得知，KMO值為0.795，大于限定的0.500，表明研究數(shù)據(jù)適合做因子分析。Bartlett球形度檢驗的伴隨概率值為0.000＜0.010，達到了顯著性水平，說明發(fā)酵核桃乳香氣的變化適合做因子分析。

表1 核桃乳及發(fā)酵和后熟過程中香氣物質(zhì)測定結(jié)果

表1 核桃乳及發(fā)酵和后熟過程中香氣物質(zhì)測定結(jié)果（續(xù)）

核桃乳發(fā)酵前后香氣物質(zhì)因子方差分析結(jié)果如下頁圖2所示。從圖2可以看出，發(fā)酵前核桃乳中香氣成分和發(fā)酵2 h的香氣成分具有很高的相似性，說明在發(fā)酵2 h內(nèi)，香氣物質(zhì)的變化程度不明顯；在發(fā)酵6 h后，與未發(fā)酵核桃乳相差甚遠(yuǎn)，香氣物質(zhì)發(fā)生了很大的改變；6 h以后的基本的香氣都比較接近，尤其是在后熟階段，香氣物質(zhì)的成分基本不變。核桃乳中的香氣風(fēng)味物質(zhì)的種類比較少，蛋白質(zhì)、脂肪以及糖類在發(fā)酵過程中的降解或每一類物質(zhì)的衍生物相互作用產(chǎn)生了新的物質(zhì)，因此，發(fā)酵后核桃乳中的香氣物質(zhì)與發(fā)酵前核桃乳中的香氣物質(zhì)有很大的差異性。

圖2 發(fā)酵核桃乳香氣成分因子方差分析

3 結(jié)論

本研究采用自選的2株乳酸菌對核桃乳進行發(fā)酵，以HS-SPME/GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測核桃乳發(fā)酵前后香氣物質(zhì)的變化，試驗結(jié)果表明發(fā)酵后香氣物質(zhì)種類雖然減少，但含量增加28.56%；具有水果芳香的正己醇是發(fā)酵前核桃乳的主體香氣物質(zhì)之一，發(fā)酵后含量明顯增加，由25.87%增加到49.08%，而另一主體香氣物質(zhì)發(fā)生了重大改變，發(fā)酵前具有生乳味的正己醛，被發(fā)酵核桃乳中具有油脂香味的乙偶姻取代，兩者含量接近，分別為24.8%和25.28%，因此發(fā)酵核桃乳具有成熟的水果芳香和奶油酯香。本研究同時證明了自選乳酸菌具有工業(yè)應(yīng)用價值，可以用于高品質(zhì)發(fā)酵型核桃乳產(chǎn)品的開發(fā)。

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Study on the aroma com ponents of walnut m ilk by fermentation of lactic acid bacteria

XUE Chun1*LI Yan1，2LI Jia1MOUDehua1**

1（College ofbioscience and bioengineering，Hebei university ofscience and technology，Hebei Shijiazhuang 050018，China）2（Hebei R&D center for fermentation engineering，Hebei Shijiazhuang 050018，China）

采用自選植物乳桿菌亞種KDLLL1-1、意大利腸球菌KDLLJ3-1對核桃乳進行發(fā)酵，并在發(fā)酵和成熟過程中取樣，采用頂空固相微萃取和氣相色譜質(zhì)譜（HP-SPME/GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對香氣成分進行測定，研究發(fā)酵核桃乳在生產(chǎn)和儲藏環(huán)節(jié)香氣物質(zhì)的變化。試驗結(jié)果表明，發(fā)酵核桃乳中香氣物質(zhì)含量提高28.56%，其中醇、酸、酮類物質(zhì)分別提高110.95%、158.41%、178.47%，而酯類、醛類物質(zhì)含量下降，烯類物質(zhì)消失。發(fā)酵前的核桃乳中正己醇和正己醛含量最高，分別占總香氣物質(zhì)含量的25.87%和24.8%，而發(fā)酵核桃乳中主體香氣物質(zhì)為正己醇和乙偶姻，分別占總香氣物質(zhì)含量的49.08%和25.28%，使產(chǎn)品具有芳香氣味和強烈的奶油及油脂香氣。研究結(jié)果可為自選乳酸菌的應(yīng)用和發(fā)酵核桃乳的開發(fā)提供理論參考。

自選乳酸菌；發(fā)酵核桃乳；頂空固相微萃取與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用；香氣物質(zhì)

Walnut milk fermentation by Lactobacillus plantarum subsp KDLLL1-1、Enterococcus italicus KDLLJ3-1,and in the fermentation and maturation process sampling.The aroma components were determined by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry(HP-SPME/GC-MS)to study the changes of aroma substances in the production and storage of fermented walnut milk.The results show:The contents of aroma components in fermented walnut milk increased by 28.56%,alcohols,acids and ketones were increased by 110.95%,158.41%and 178.47%;while the content ofesters and aldehydes decreased,and the alkenes disappeared.The content ofn-hexanol and n-hexylaldehyde in walnut milk before fermentation was the highest,the total aroma content of 49.08%and 25.28%respectively,while the main aroma substances in fermented walnut milk were n-hexanol and acetoin,accounting for 49.08%and 25.28%respectively,so that the product has a fragrant smell and a strong aroma of butter and grease.The results of this study can provide theoretical reference for the application of lactic acid bacteria and the development of fermented walnut milk.

optional lactic acid bacteria；fermented walnut milk；headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry；aroma substances

TS252.54

A

1673-6044（2016）04-0011-06

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.04.005

*薛純，女，1993年出生，河北科技大學(xué)在讀本科。

**牟德華，通訊作者，E-mail：dh_mou@163.com.

2016-10-06