樊尚榮 蔣濟陽 劉小平△ 黃榮 唐盛 龔海濤

(1.北京大學深圳醫(yī)院婦產科，深圳 518036；2.北京大學深圳醫(yī)院檢驗科，深圳 518036；3.深圳市邁科龍生物技術有限公司，深圳 518055)

免疫熒光法檢測B群鏈球菌方法的建立及性能評價*

樊尚榮1蔣濟陽2劉小平2△黃榮2唐盛3龔海濤3

(1.北京大學深圳醫(yī)院婦產科，深圳 518036；2.北京大學深圳醫(yī)院檢驗科，深圳 518036；3.深圳市邁科龍生物技術有限公司，深圳 518055)

目的：建立免疫熒光法B群鏈球菌檢測方法并評價其性能，確定免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑的最佳反應條件；了解免疫熒光法B群鏈球菌檢測方法的局限及改進措施。方法：雙盲法。采集103例產檢孕婦陰道分泌物標本，分離培養(yǎng)、鑒定，免疫熒光法對分離的疑似B群鏈球菌菌落免疫熒光法檢測；248例孕婦陰道拭子直接涂片免疫熒光檢測進行雙盲法平行檢測，以分離培養(yǎng)、鑒定結果為標準，統(tǒng)計免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑與分離培養(yǎng)鑒定法檢測結果的總符合率及陰、陽性符合率，計算一致性系數(shù)；設計干擾試驗，研究與其他細菌抗原交叉反應的可能。結果：試驗結果統(tǒng)計分析顯示，103例免疫熒光法B群鏈球菌檢測菌落涂片與分離培養(yǎng)鑒定法檢測結果的總符合率為94.17%，陰性符合率為92.41%，陽性符合率為100%，Kappa值為0.85。對248例臨床孕婦陰道分泌物涂片檢測，免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑與分離培養(yǎng)鑒定法檢測結果的總符合率為95.16%，陰性符合率為96.48%，陽性符合率為80.95%，Kappa值為0.71。結論：免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑檢測分離菌落涂片、與分離培養(yǎng)鑒定法的檢測結果無顯著性差異，陰道分泌物直接涂片的結果與分離培養(yǎng)鑒定法的檢測結果一致。免疫熒光B群鏈球菌檢測方法具有快速、簡便、準確的特性，可用于產前孕婦陰道分泌物分離的疑似B群鏈球菌菌落直接鑒定。

B群鏈球菌；免疫熒光技術免疫熒光分析；干擾試驗

B群鏈球菌(Group B strcptococcus，GBS)即無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)，以其細胞壁多糖類C物質屬于Lancefield抗原結構分類中的B群而得名。B群鏈球菌正常寄居于陰道和直腸，屬于條件致病菌。在20世紀70年代，B群鏈球菌被證實為圍產期母嬰感染的主要致病菌之一，在圍產醫(yī)學中占有重要地位，母嬰傳播是新生兒GBS感染的主要途徑，發(fā)生在分娩過程中，新生兒暴露于GBS存在的產道，可能吞進和吸入細菌，導致新生兒感染[1-5]。早發(fā)型GBS感染(生產后7天以內)主要引起肺炎和敗血癥，是新生兒死亡的主要原因之一。而晚發(fā)型GBS感染(生產后7天-3個月)主要引起腦膜炎(占新生兒腦膜炎的31%)，嚴重者致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥及聽力喪失等不可逆損害[6]。目前常用的GBS臨床實驗室診斷方法為GBS分離培養(yǎng)鑒定法，美國CDC、美國婦產科協(xié)會以及美國兒科協(xié)會推薦用選擇性培養(yǎng)基對孕產婦和新生兒進行GBS感染篩查，因其操作過程相對繁瑣、耗時長，醫(yī)療機構未能普遍開展。為尋求能夠滿足孕婦GBS快速、準確的檢測方法，研發(fā)了免疫熒光法(Immunofluorescence assay，IFA)B群鏈球菌檢測試劑并評價其性能。報道如下：

1 材料與方法

1.1 免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑及質控體系的建立

1.1.1 材料

B群鏈球菌單克隆抗體，異硫氰酸熒光素標記。分裝成0.5 mL一支。儲存溫度2-8℃。有效期6個月。Zeiss AXIOSKOP-PLUS熒光顯微鏡。陽性質控片：自制。陰性質控片：上皮細胞(Epithelial cells)：用美國ATCC CCL-2標準上皮細胞、大腸埃希菌 ATCC29213、ATCC35218、金黃色葡萄球菌ATCC25923傳代菌株。

1.1.2 免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑最佳反應條件

運用單一變量法，分別評價B群鏈球菌涂片介質類型、試劑用量、反應時間、孵育溫度、孵育濕度、沖洗用水對試驗結果的影響。質控涂片檢測采用已確定的最佳反應條件。試驗用菌株為混合B群鏈球菌菌株。

1.1.2.1 涂片介質的選擇

試驗菌株為自制陽性質控菌株，介質類型包括生理鹽水、營養(yǎng)肉湯、乙醇或丙酮。分別用生理鹽水、營養(yǎng)肉湯作為涂片介質蘸取菌落滾動制片各10張，自然干燥，加入B群鏈球菌免疫熒光試劑。

涂片介質pH值：用1M乙酸稀釋溶液、生理鹽水、1 M碳酸氫鈉溶液用于涂片介質調整試驗pH，在pH值<7.0 、pH值等于7.0和 pH值>7.0時制備GBS混合菌株涂片各10片，自然干燥，加入B群鏈球菌免疫熒光試劑。

試劑用量：制備1麥氏單位GBS混合菌株涂片30片，自然干燥分別5 μL、10 μL、20 μLB群鏈球菌免疫熒光試劑。

反應時間：制備1麥氏單位GBS混合菌株涂片30片，自然干燥加入10 μLB群鏈球菌免疫熒光試劑分別作用15 min、30 min和45 min，觀察結果。

孵育溫度和濕度：制備1麥氏單位GBS混合菌株涂片各10片，加入B群鏈球菌免疫熒光試劑后分別放置在26-30℃、37℃、干燥37℃、保濕暗盒，30 min后沖洗、晾干、觀察結果。

沖洗用水：制備1麥氏單位GBS混合菌株涂片各10片，加10 μLB群鏈球菌免疫熒光試劑后分別放置在保濕暗盒37℃，30 min后分別用自來水、去離子水和PBS+吐溫沖洗，觀察結果。

1.2 免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑性能評價

1.2.1 菌落涂片免疫熒光B群鏈球菌檢測與分離、鑒定等效性驗證

1.2.1.1 主要儀器

細菌鑒定及藥敏分析儀MicroScan walkAway40及96孔鑒定/藥敏板，Zeiss AXIOSKOP-PLUS熒光顯微鏡。

1.2.1.2 主要試劑

哥倫比亞血瓊脂平板(型號：LS0109)、麥康凱平板，廣州市迪景微生物科技有限公司生產；乳膠凝集試劑(LA)-B生物梅里埃公司生產，有效期內、自制的B群鏈球菌熒光標記抗體。

1.2.1.3 標本處置

在2013年6月至9月期間共對北京大學深圳醫(yī)院103例產前檢查孕婦陰道分泌物標本，標本在患者簽知情同意書后采集并采用無菌容器保存。編號后送至微生物室分離培養(yǎng)。

將標本接種于平板上，在37℃恒溫箱內培養(yǎng)24-48 h，觀察結果。GBS菌落在血瓊脂平板上呈灰白、透光、濕潤、光滑、凸起，選取可疑菌落涂片革蘭染色鏡檢，顯微鏡下可見革蘭染色陽性鏈球菌，觸酶實驗陰性、鏈球菌乳膠凝集試驗陽性者進一步生化鑒定。挑取血平板上疑似B群鏈球菌的菌落涂片，干燥后加5 μL B群鏈球菌免疫熒光試劑，置密閉、濕潤暗盒中，置于37℃溫箱孵育30 min，用去離子水緩緩沖洗載玻片30 sec，晾干，用熒光顯微鏡閱片，在油鏡下發(fā)現(xiàn)一個以上蘋果綠色熒光、典型空心圓球顆粒狀B群鏈球菌則為陽性，未發(fā)現(xiàn)可定義為陽性的典型特異染色時即為陰性。

1.2.1.4 檢測下限的確定

免疫熒光法B群鏈球菌檢測的靈敏度即確定試劑檢出B群鏈球菌的最低濃度(檢出陽性的菌液最低濃度下限)。

用GBS菌株配制0.5麥氏濃度菌懸液(1.5×108cfu·mL-1)，倍比稀釋至1:256，形成8個濃度的菌懸液，1.5×108、7.5×107、3.75×107、1.88×107、9.38×106、4.69×106、2.34×106、1.17×106、5.86×105。制備涂片、干燥后進行B群鏈球菌免疫熒光染色，顯微鏡觀察并記錄結果。每一稀釋濃度的菌懸液制備3張涂片。

1.2.2 陰道分泌物涂片熒光B群鏈球菌檢測與分離、鑒定的等效性評價

取248例產前檢查孕婦陰道拭子，每例2支，1支接種血平板、麥康凱平板37℃孵育24-48 h，分離、鑒定。載玻片標記標本信息，在陰道拭子直接或滴加0.1 mL生理鹽水后滾動涂片，自然干燥，免疫熒光法檢測陰道分泌物B群鏈球菌，記錄結果。

1.3 干擾試驗

用免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑對有明確鑒定結果的A群鏈球菌、肺炎鏈球菌、腸球菌、淋病奈瑟菌等18種臨床分離菌株及標準菌株菌落涂片檢測，涂片介質為生理鹽水。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件比對檢測結果進行統(tǒng)計學分析，計算免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑與分離培養(yǎng)法檢測結果的總符合率和陰、陽符合率，并計算一致性系數(shù)Kappa(K)值。規(guī)定若K值>0.8，則表明兩種檢測方法有一致性，在臨床應用中有等效性；0.75>Kappa≥0.4兩者一致性一般，Kappa<0.4兩者一致性較差[7]。

2 結果

2.1 免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑質控體系的建立

陽性質控結果：顯微鏡下清晰、易辨，B群鏈球菌單個或成鏈狀排列，熒光集中在菌體膜上，其他部位熒光強度弱鏡下可顯示中空現(xiàn)象。

上皮細胞陰性質控片 采用與細菌不同生物類型的上皮細胞制成，鏡下陰性、效果良好，大腸埃希菌標準菌株ATCC29213、ATCC35218、金黃色葡萄球菌ATCC25923制備的陰性質控片，鏡下檢測陰性效果良好。

2.2 免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑最佳反應條件的確立

用GBS混合菌株制成的內控品進行檢測，運用單一變量法，研究改變一項反應條件對檢測結果的影響，確定該方法的最佳反應條件。試驗結果如下表1，“-”代表檢測結果陰性，“±”代表檢測結果弱陽性，“+”代表檢測結果為陽性，“++”代表檢測結果強陽性。

表1 免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑最佳反應條件試驗結果

由上述實驗結果可以確定免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑的最佳反應條件為：生理鹽水作為涂片介質、 pH值7.0，試劑量10 μL，孵育時間30 min，孵育溫度37℃，孵育環(huán)境濕潤，PBS+吐溫洗劑、去離子水均可作為沖洗用水。當菌量少時選用營養(yǎng)肉湯作為涂片介質效果更好，當缺乏去離子水時選用自來水作為沖洗用水也能達到同等效果。簡要流程如圖1，整個反應過程避光。

涂片固定→5 μL熒光抗體，37℃溫箱孵育30 min→洗滌、晾干、鏡檢圖1 免疫熒光檢測原理及流程圖

2.2 免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑性能評價

2.2.1 103例樣本免疫熒光法檢測與分離培養(yǎng)法結果比較

以分離培養(yǎng)作為金標準，免疫熒光檢測疑似B群鏈球菌結果與之對比，103例樣本檢測結果見表2。

表2 免疫熒光法檢測與分離培養(yǎng)法結果對比

統(tǒng)計分析顯示，103例臨床標本分離的疑似菌落免疫熒光法B群鏈球菌檢測與鑒定結果的總符合率為95.16%，陰性符合率為96.48%，陽性符合率為80.95%，Kappa值為0.85，大于0.8。

2.2.2 248例樣本免疫熒光法與分離培養(yǎng)法檢測結果比較

采用分離培養(yǎng)鑒定法與免疫熒光法B群鏈球菌檢測法對248例臨床孕婦陰道拭子進行雙盲法平行檢測，檢測結果見表3。

表3 免疫熒光法與分離培養(yǎng)法檢測結果

248例孕婦陰道拭子直接涂片，免疫熒光法B群鏈球菌檢測與分離、培養(yǎng)、鑒定結果的總符合率為95.16%，陰性符合率為96.48%，陽性符合率為80.95%，Kappa值為0.7126，接近0.8。兩種檢測方法的檢測結果一致。

2.2.3 免疫熒光法B群鏈球菌檢測的靈敏度

用陽性菌株配制0.5麥氏濃度(相當于1.5×108cfu·mL-1)菌懸液，倍比稀釋至1:256，用滅菌拭子蘸取少量菌懸液涂片干燥后進行免疫熒光染色，顯微鏡鏡檢(100 X10)并記錄結果，見表4。

表4 免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑的靈敏度

陰性對照 用大腸埃希菌ATCC35218標準株配制0.5麥氏濃度單位細菌菌液，倍比稀釋，配制成不同濃度的菌液，用滅菌拭子蘸取涂片、晾干后免疫熒光染色，結果均為陰性。

本研究檢出陽性菌液最低可檢測下限為5.86×105cfu·mL-1，免疫熒光法敏感度較高，能夠檢出較低濃度菌液中的B群鏈球菌。陽性質控片和陰性質控片上的菌量均高于5.86×105cfu·mL-1，質控結果可信，檢出最低下限的研究為后續(xù)開展的臨床檢測提供了支持。

2.3 干擾試驗

表5 干擾試驗檢測結果

注：細菌總株數(shù)90株，檢測陽性6株，檢測陰性84株。

由上述干擾試驗檢測結果可以看出，免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑中的熒光標記抗體與6株臨床分離的金黃色葡萄球菌抗原相結合，有可能存在交叉抗原。

3 討論

3.1 B群鏈球菌目前常用檢驗方法

目前臨床實驗室常用的GBS檢測方法為分離培養(yǎng)、鑒定，美國CDC、美國婦產科協(xié)會以及美國兒科協(xié)會已推薦用選擇性培養(yǎng)基對孕產婦和新生兒進行GBS感染篩查。除此之外，還有涂片革蘭染色顯微鏡檢查、GBS分子生物學診斷、VITEK MSTM和布魯克全自動飛行時間質譜(MALDI-TOF mass spectrometry)鑒定菌種等[8-9]。

GBS顯微鏡檢查：常用的方法是通過對腦脊液或血培養(yǎng)標本濃縮涂片、革蘭染色、顯微鏡檢查，B群鏈球菌為革蘭陽性雙球菌，鏈狀排列。其診斷準確率主要取決于標本質量、顯微鏡分辨率及檢驗人員的技術水平。

GBS的分離培養(yǎng)和鑒定：對GBS的診斷主要是通過對孕產婦直腸或陰道拭子、新生兒的血液或腦脊液進行培養(yǎng)來實現(xiàn)的，但發(fā)現(xiàn)普通培養(yǎng)在檢測孕婦GBS定植方面的假陰性率。應用選擇性培養(yǎng)基可以抑制其他微生物的生長，因此美國CDC、美國婦產科協(xié)會以及美國兒科協(xié)會推薦用選擇性培養(yǎng)基對孕產婦和新生兒GBS感染進行篩查。分離培養(yǎng)、鑒定是檢測GBS的金標準。選擇性培養(yǎng)得出陰性結果要72 h，陽性結果至少也要48 h才能得出。GBS菌落在羊血平板上呈灰白、透光、濕潤、光滑、凸起?？梢删溥M行生化鑒定：GBS觸酶實驗陰性， CAMP試驗陽性，馬尿酸試驗陽性?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜檢測系統(tǒng)也有著與PCR類似的局限性，通常兩者都是批量測定，難以滿足孕婦GBS門診篩查個體化快速、準確檢測的要求。目前大陸地區(qū)使用的儀器和試劑來自法國梅里埃bioMériux、美國BD及西門子公司的產品。

3.2 疑似B群鏈球菌菌落初篩的方法

在臨床微生物室也普遍應用血清學檢測方法，如B鏈球菌乳膠凝集實驗，作為鑒定前初篩或補充、快速驗證實驗。

本研究建立的方法可用以直接檢測疑似菌落和孕婦陰道分泌物涂片，與分離培養(yǎng)鑒定等效，可以部分替代進口試劑用于GBS鑒定。

3.3 熒光素標記GBS抗體檢測GBS的方法和意義

熒光素標記GBS抗體直接檢測疑似的菌落是否是GBS，或檢測陰道分泌物樣本中是否存在GBS。在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰基(-N=C=S)與抗體上的賴氨酸的ε氨基結合，形成FITC-抗體耦合物，即熒光標記抗體。異硫氰酸熒光素(Flourescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記抗B群鏈球菌抗體可與B群鏈球菌發(fā)生特異性結合，所形成的熒光素結合物在熒光顯微鏡495納米波段激發(fā)光照射下發(fā)出亮綠色熒光。由于在反應中只有抗原、抗體兩種因子參與，判讀簡單；特異性強，與其他抗原交叉染色較少，一種標記抗體只能鑒定含有相應抗原的細菌；操作簡便、省時[10]。

通過對免疫熒光法檢測B群鏈球菌的臨床檢測效果評價，確定了該試劑的最佳反應條件并建立起質控體系。免疫熒光試劑檢測與分離培養(yǎng)法檢測的總符合率為94.17%，陽性符合率為100%，陰性符合率為92.41%，Kappa值為0.85，免疫熒光法鑒定GBS與金標準結果一致；對陰道分泌物標本進行雙盲法平行檢測，總符合率95.16%，陰性符合率為96.48%，陽性符合率為80.95%，Kappa值為0.71，接近0.8。兩種檢測方法的檢測結果一致。在臨床應用中暫不具備等效性，尚待改進。

3.4 局限及改進

干擾試驗結果顯示，免疫熒光法B群鏈球菌檢測試劑與部分臨床分離金黃色葡萄球菌菌株存在交叉抗原。B群鏈球菌免疫熒光法檢測試劑與金黃色葡萄球菌表面抗原交叉的問題將進一步研究并降低金黃色葡萄球菌對試劑的反應性。

通過建立免疫熒光法檢測B群鏈球菌的方法及性能評價，對產檢孕婦GBS篩查，為國產試劑在免疫熒光法檢測B群鏈球菌領域的應用提供了支持，部分滿足了孕婦GBS篩查個體化檢測的要求，臨床醫(yī)生對產前孕婦B群鏈球菌篩查多了一項選擇。

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Establishment and performance evaluation of groupBStrcptococcuswith immunofluorescence detection*

Fan Shang-rong1, Jiang Ji-yang2, Liu Xiao-ping2△, Huang Rong2, Tang Sheng3, Gong Hai-tao3

(1.Department of Gynaecology and Obstetrics, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036;2.Department of Clinical Laboratory, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen, 518035;3.Shenzhen Microprofit Biological Technology Co., Ltd, Shenzhen 518055)

Objective：To establish and evaluate performance of immunofluorescence detection of group B Streptococcus (GBS), to grope best reaction conditions and to understand the application value and limitations of immunofluorescence detection. Methods: One hundred and three pregnant women′s vaginal samples from the Peking University Shenzhen Hospital were identified by MicroScan walkAway 40. Furthermore, suspected colony was detected by GBS immunofluorescence. Two hundreds and forty-eight pregnant women′s vaginal swabs were identified and another vaginal swab smear was detected with GBS immunofluorescence. Above two parts of clinical trials were all used double-blind parallel controlled. The results of identification were as standard. Overall coincidence rate, negative coincidence rate, positive coincidence rate and the Kappa value of the two methods were calculated. And interference test were designed to research the cross reaction possibilities with other bacterial antigens in vaginal specimens. Results: According to the statistical analysis of the 103 vaginal samples suspected colony immunofluorescence detection compared with identification, the overall coincidence rate was 94.17%, the negative coincidence rate was 92.41%, and the positive coincidence rate was 100% and the Kappa value was 0.85. Two hundreds and forty-eight pregnant woman′s vaginal swabs smear immunofluorescence Group B strcptococcus detection compared with identification, which overall coincidence rate was 95.16%, the negative coincidence rate was 96.48%, the positive coincidence rate was 80.95% and the Kappa value was 0.71. The cross reaction possibilities can be eliminated by blocking the antibody combining to the bacterial antigen-binding site. Conclusion: There was no significant difference between suspected colony immunofluorescence detection and identification, the results of vaginal swabs smear by immunofluorescence GBS detection and isolated and identification tend to be consistent. The experimental process of GBS immunofluorescence detection is simple, the result reports are fast and accurate. That can be used for direct identification of suspected GBS colony from the vaginal secretion of pregnant women.

Group B streptococcus; Immunofluorescence; Identification; Cross reaction

深圳市科技創(chuàng)新委員會基金課題(編號：100314037)

樊尚榮，男，主任醫(yī)師/教授，主要從事婦產科臨床工作，Email：fanshangrong@21cn.com。

△通訊作者：劉小平，女，主任技師，主要從事臨床檢驗工作，Email：xpliu0101@sohu.com。

2016-10-13)