史立信，胡福廣，徐兆冰，吳景春，張文超，王傳海

辛伐他汀對大鼠顱腦外傷后彌漫性軸索損傷的實驗研究

史立信1，胡福廣2，徐兆冰3，吳景春1，張文超1，王傳海1

目的 觀察辛伐他汀對大鼠顱腦外傷后彌漫性軸索損傷的治療效果。方法 用加速-減速裝置制作大鼠彌漫性軸索損傷(DAI)模型，分為安慰劑組與辛伐他汀組，口服生理鹽水與辛伐他汀14 d，另選健康SD大鼠作為對照組。以經(jīng)修改神經(jīng)功能損傷程度評分(mNSS)來測定神經(jīng)功能恢復狀態(tài)；以淀粉樣-β陽性前體蛋白(APP)單克隆抗體進行免疫組化實驗以測定軸索損傷程度，以Bielshowshy銀染法測定神經(jīng)軸索密度。結果 與安慰劑組及對照組比較，辛伐他汀組mNSS評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；辛伐他汀組APP陽性神經(jīng)軸索密度明顯降低，而銀染陽性神經(jīng)軸索密度明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；mNSS評分與神經(jīng)軸索密度呈明顯負相關。結論 辛伐他汀能促進顱腦外傷后彌漫性周索損傷中神經(jīng)軸索損傷的修復與增長。

彌漫性軸索損傷；顱腦外傷；辛伐他汀；免疫組化；淀粉樣-β陽性前體蛋白

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury，DAI)是顱腦外傷的常見伴發(fā)疾病也是顱腦外傷后重要的致殘原因[1]，神經(jīng)軸索損傷和恢復及顱腦外傷后功能康復具有重要的作用，目前關于DAI這一病理過程的基礎和臨床研究[2]。辛伐他汀被多項研究證實在顱腦外傷中具有多重作用[3-4]，本研究通過動物實驗分析該藥在顱腦外傷后彌漫性軸索損傷中的藥物作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 DAI模型建立 選取健康成年SD大鼠40只，雌雄各半，體重250 g～360 g，用4%水合氯醛麻醉(0.2 mL/100 g～0.4 mL/100 g)后，以西安交通大學醫(yī)學院劉曉斌醫(yī)師瞬間加-減速損傷裝置制作DAI模型[5]：將已麻醉大鼠固定于旋轉(zhuǎn)裝置上，麻醉蘇醒后在其尚處于激烈掙扎間歇期按動實驗裝置扳機，使其頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)90°，并記錄大鼠生命體征及行為改變，把DAI模型大鼠隨機分為實驗組和安慰劑組(生理鹽水組)，各20只，另選20只SD大鼠作為健康對照組并正常飼養(yǎng)。安慰劑組SD大鼠給予生理鹽水口服持續(xù)14 d；實驗組SD大鼠給予辛伐他汀1 mg/(kg·d)，連續(xù)14 d。3組大鼠于實驗第15 d分別以4%水合氯醛麻醉，依次經(jīng)心臟灌注生理鹽水及4%多聚甲醛至四肢抽搐、肺及肝臟變白，而后迅速解剖分離全腦，以4%多聚甲醛固定48 h，然后以冠狀位等厚度分為7塊取材，再脫水、透明、浸蠟及包埋處理。

1.2 免疫組織化學及銀染色檢查 本實驗以淀粉樣-β陽性前體蛋白(amyloid β precursor protein，APP)單克隆抗體標記發(fā)生損傷的神經(jīng)軸索[6]，并用Bielshowshy銀染色以顯示神經(jīng)軸索。對于處理過的腦組織以生物組織切片機以5 μm厚度連續(xù)切片，脫蠟，水化，然后3%H2O2處理以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，將切片置于盛有1%檸檬酸溶液的高壓鍋中煮沸10 min以修復抗原，之后向組織切片上滴加1∶500的抗-APP一抗4 ℃孵育過夜，再滴加偶聯(lián)有生物素的二抗室溫下反應2 h，最后以DAB在光鏡下顯色。為了顯示神經(jīng)軸索形態(tài)，對腦組織切片進行Bielshowshy銀染色：先把組織切片置于20%硝酸銀中孵育，之后在氨水中返藍。

2 結 果

2.1 辛伐他汀對DAI后大鼠神經(jīng)病學行為的影響 采用mNSS損傷評分來測定SD大鼠加速-減速致DAI后的神經(jīng)病學行為改變，在DAI后第1天mNSS評分11分，從傷后第3天神經(jīng)功能即開始恢復至第14天；與安慰劑組比較，治療組辛伐他汀能明顯降低mNSS評分(第7天：辛伐他汀組6.3分±0.5分vs安慰組8.4分±0.6分；P=0.012；第14天：辛代他汀組4.8分±0.4分vs 安慰劑組7.6分±0.6分，P=0.007)。詳見圖1。

圖1 3組大鼠神經(jīng)功能損傷mNSS評分變化

2.2 辛伐他汀對軸索損傷的影響 比較辛伐他汀對軸索損傷藥物作用，對DAI安慰劑組和辛伐他汀組大鼠腦組組進行淀粉樣-β陽性前體蛋白(amyloid β precursor protein，APP)免疫組化及Bielshowshy銀染色。結果：辛伐他汀明顯降低APP陽性損傷軸索密度，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.014)；并發(fā)現(xiàn)辛伐他汀明顯升高Bielshowshy銀染陽性軸索密度，且差異有統(tǒng)計學意義(P=0.021)。詳見圖2。

注：A、D為對照組；B、E為安慰劑組組；C、F為辛伐他汀組。(圖A-C為IHC染色，×400倍；圖D-F為Bieschowshy銀染色，×400倍)

圖2 3組大鼠APPIHC染色與Bieschowshy銀染示軸索密度變化

2.3 DAI后大鼠軸索數(shù)量與神經(jīng)病學行為關系 對DAI第14天mNSS評分與銀染所示軸索密度進行Pearson相關性分析，結果：mNSS評分與軸索密度明顯負相關，相關系數(shù)r=-0.96，P=0.006。詳見圖3。

圖3 軸索數(shù)量與mNSS評分相關性分析

3 討 論

DAI約占重型顱腦損傷28%～42%，死亡病人中占29%～43%，病情危重，病死率和致殘率高，是導致顱腦損傷病人神經(jīng)功能障礙、植物狀態(tài)和死亡的主要原因[7-9]。既往對DAI治療缺乏特異性手段，隨著對其病理生理學機制研究不斷深入，一些針對DAI病變進程的藥物不斷地得到動物實驗驗證，并有些已應用于臨床中[10-15]，但是關于降脂藥辛伐他汀在DAI治療作用的基礎研究還未見報道，所以本研究通過動物實驗探討辛伐他汀對DAI的藥物作用。

他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，具有抗炎、抗氧化作用、免疫抑制、改善內(nèi)皮功能，減輕炎癥反應和再灌注損傷，有助于保持病理情況下血腦屏障的完整性和星型膠質(zhì)細胞的功能，減少神經(jīng)元的繼發(fā)性損害。辛伐他汀可明顯抑制顱腦損傷后Caspase-3的表達，阻礙其活化，阻滯由其介導的蛋白酶級聯(lián)反應導致的細胞凋亡過程，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16-17]。

通過瞬間加-減速損傷裝置制作大鼠腦外傷后彌漫性軸索損傷模型，該模型具有顱腦外傷后DAI多項特征，故可用于DAI實驗研究[18]。實驗性顱腦外傷后1 h內(nèi)大鼠即出現(xiàn)軸索損傷，在隨后數(shù)小時內(nèi)軸索損傷范圍不斷擴大，在損傷后80 h便出現(xiàn)大量軸索腫脹[19]。軸索損傷不斷加重可產(chǎn)生一系列病理生理學改變：鈣離子內(nèi)流、神經(jīng)纖維骨架解體、神經(jīng)軸索細胞膜破裂及最后軸索不可逆的斷裂，因此理論上可通過阻止該過程的某些環(huán)節(jié)而起到治療DAI作用[20]。本實驗選用APP單克隆抗體以免疫組化方法和Bielshowshy銀染顯示受損的神經(jīng)軸索，實驗結果顯示神經(jīng)軸索損傷的形態(tài)改變有：軸索增粗、串珠狀及球狀改變。

有研究報道：當與其他相關藥物合用時辛伐他汀可減輕腦血栓后神經(jīng)軸索的損傷[21]，本實驗驗證辛伐他汀單藥對神經(jīng)軸索的作用，辛伐他汀是脂溶性藥物，比其他水溶性他汀類藥物更易通過血腦屏障。本實驗結果顯示辛伐他汀明顯減少APP陽性損傷軸索密度，提示該藥能減輕顱腦外傷后彌漫性軸索損傷。辛伐他汀治療后第14天，與對照組和安慰劑組比較，Bielshowshy銀陽性神經(jīng)軸索密度明顯增高，該結果與神經(jīng)行為缺損mNSS評分相一致。但需要大樣本實驗以進一步驗證這種相關性。

本實驗辛伐他汀治療后軸索數(shù)量的增加或許是軸索損傷的減輕和(或)顱腦外傷后軸索再生增強的結果。由于實驗條件所限，沒有進行進一步實驗以明確其中機制，但Di Giovanni[22]對體外培養(yǎng)的PCN細胞株施以辛伐他汀后發(fā)現(xiàn)受損的神經(jīng)軸索很快修復增長，并且這種作用能被LY29402抑制而能被LiCL增強，認為辛伐他汀的促軸索生長作用是通過PI-3k路徑實現(xiàn)。有實驗研究表明，單純地移除抑制性因子不足以使神經(jīng)軸索成功再生[23]，而另有實驗證據(jù)提示活化內(nèi)源性途徑或許能實現(xiàn)神經(jīng)軸索的增生[24]，Park等[25]發(fā)現(xiàn)mTOR就是其中一種調(diào)節(jié)內(nèi)源性調(diào)節(jié)蛋白，這種蛋白質(zhì)在神經(jīng)元發(fā)育過程中非?；钴S，而在成熟神經(jīng)元中活性較低；若將損傷的視神經(jīng)元mTOR路徑負性調(diào)節(jié)因子PTEN基因刪除，則會觀察到軸索迅速增長，由于mTOR是PI-3K/Ak路徑下游靶向分子，結合本實驗結果，推測辛伐他汀之所以能增加軸索密度，有可能是通過激活PI-3K/Ak路徑實現(xiàn)。

綜上所述，本實驗顯示辛伐他汀單藥能夠明顯減少神經(jīng)軸索損傷并改善實驗性大鼠顱腦外傷后DAI的神經(jīng)功能。

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(本文編輯薛妮)

Efficacy of Simvastatin on Diffuse Axonal Injury after Cranial Injury in Rats

Shi Lixin,Hu Fuguang,Xu Zhaobing,Wu Jingchun,Zhang Wenchao,Wang Chuanhai

People’s Hospital of Qinghe,Qinghe 054800,Hebei,China

Shi Lixin

Objective To observe the effect of simvastatin on the treatment of diffuse axonal injury (DAI) after traumatic brain injury (TBI) in rats.Methods Adult healthy Sprague-Dawley (SD) rats DAI models after brain injury was made by accelerating and decelerating apparatus ,which were then divided by two groups.Saline and simvastatin was administrated for 14 days.A modified neurological severity scores (mNSS) test was performed to evaluate degree of neural functional recovery.Immunohistochemistry studies with amyloid β-precursor protein (APP) was performed to mark the axonal injury ,and Bielshowshy`s silver dying was processed to evaluate the axon density.Results Symvastatin decreased the mNSS score in the simvastatin group.The density of APP positive neural axons decreased obviously in the simvastatin goup ,with which of silver postive axons elevated in it.The mNSS score was negatively correlated with the density of neural axons through Pearson correlation analysis.Conclusion Simvastatin can repair axonal injury and promote axonal regeneration in DAI after TBI.

diffuse axonal injury； traumatic brain injury；simvastatin； immunohistochemistry；amyloid β precursor protein

1.河北省清河縣人民醫(yī)院(河北清河 054800)；2.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院；3.山東省聊城市第二人民醫(yī)院

史立信，E-mail：wbslx8099@163.com

R651.1 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.23.014

1672-1349(2016)23-2766-04

2016-03-28)

引用信息：史立信，胡福廣，徐兆冰，等.辛伐他汀對大鼠顱腦外傷后彌漫性軸索損傷的實驗研究[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2016，14(23)：2766-2768.