徐 濤，劉吉華

(江蘇省中藥評價與轉(zhuǎn)化重點實驗室，中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198)

芐基四氫異喹啉類生物堿的微生物轉(zhuǎn)化

徐 濤，劉吉華*

(江蘇省中藥評價與轉(zhuǎn)化重點實驗室，中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198)

芐基四氫異喹啉類生物堿廣泛分布于木蘭科、防己科、番荔枝科、罌粟科、蕓香科、樟科、小檗科等植物中，具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、止咳、降壓、抗菌、抗炎、免疫抑制等多種生理活性，嗎啡、羅通定、可待因、青藤堿、罌粟堿等多種藥物已應(yīng)用于臨床。鑒于其廣泛的臨床應(yīng)用，芐基四氫異喹啉類生物堿的結(jié)構(gòu)修飾成為研究的熱點，微生物轉(zhuǎn)化由于效率高、手性及立體選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、成本低、反應(yīng)過程綠色環(huán)保等特點，在天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)修飾中應(yīng)用越來越廣泛。本文綜述了微生物轉(zhuǎn)化在芐基四氫異喹啉類生物堿結(jié)構(gòu)修飾中的應(yīng)用，為更深入的研究芐基四氫異喹啉類生物堿提供一定的依據(jù)。

芐基四氫異喹啉類生物堿；微生物轉(zhuǎn)化；綜述

芐基四氫異喹啉類生物堿廣泛分布于木蘭科、防己科、番荔枝科、罌粟科、蕓香科、樟科、小檗科等植物中[1]，具有多種生理活性，如烏頭中的烏藥堿(coclaurine)及去甲烏藥堿(demethylcoclaurine)具有抗艾滋病病毒的作用[2]，防己中的粉防己堿(tetrandrine)具有抗腫瘤作用[3]，黃連、黃柏中的小檗堿(berbine)及其衍生物具有抗菌[4]、抗炎及抗血管生成[5]的作用，阿片中的嗎啡(morphine)具有強(qiáng)烈的鎮(zhèn)痛作用[6]等。根據(jù)其骨架類型不同可分為7類[7]：芐基四氫異喹啉類、雙芐基四氫異喹啉類、阿樸啡類、嗎啡烷類、原小檗堿和小檗堿類、普羅托品類、菲啶類。鑒于其廣泛的藥理活性及臨床應(yīng)用，對芐基四氫異喹啉類生物堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，尋找新的先導(dǎo)化合物，成為當(dāng)今研究的熱點。

微生物轉(zhuǎn)化是以細(xì)菌、霉菌等微生物及其產(chǎn)生的酶對外源化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而獲得有價值產(chǎn)物的生理生化反應(yīng)，其本質(zhì)是酶促催化反應(yīng)[8]。微生物轉(zhuǎn)化具有效率高、手性及立體選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、成本低、反應(yīng)過程綠色環(huán)保等特點，其常見反應(yīng)類型有：氧化還原反應(yīng)、水解反應(yīng)、糖基化反應(yīng)、縮合反應(yīng)、胺化反應(yīng)、?；磻?yīng)、脫水反應(yīng)等[9]。1952年P(guān)eterson和Murray首先發(fā)現(xiàn)菌株RhizopusnigicansATCC6627b 可以將黃體酮轉(zhuǎn)化為11-α-羥基黃體酮，解決了合成可的松等皮質(zhì)激素中的最大難題，自此，微生物轉(zhuǎn)化為藥物的合成及結(jié)構(gòu)修飾開辟了一條新的途徑。

1 微生物轉(zhuǎn)化在芐基四氫異喹啉類生物堿研究中的應(yīng)用

近年來，微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)被廣泛用于天然化合物的合成、結(jié)構(gòu)修飾和改造、藥物前體化合物的轉(zhuǎn)化及藥物代謝機(jī)制研究等，是獲得結(jié)構(gòu)新穎、獨特、低成本、低毒性和高活性藥物的重要途徑[10]?；谖⑸镛D(zhuǎn)化在天然產(chǎn)物中的廣泛應(yīng)用，本文總結(jié)其在芐基四氫異喹啉類生物堿結(jié)構(gòu)修飾中的應(yīng)用主要有以下幾個方面。

1.1 新天然活性先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)

利用微生物轉(zhuǎn)化的方法對芐基四氫異喹啉類生物堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，產(chǎn)生新的天然活性物質(zhì)，結(jié)合藥理活性的篩選方法，可以增加天然活性先導(dǎo)化合物的來源。Stabler等[11]利用雙生柱孢菌Cylindrocarpondidymum轉(zhuǎn)化2,2’-二聚嗎啡(2-2’-dimorphine)產(chǎn)生新的嗎啡生物堿衍生物10-α-S-羥基-2,2’二聚嗎啡和10,10’-α,α’-S,S’-二羥基-2,2’-二聚嗎啡。Agusta等[12]用植物內(nèi)生菌CoelomycetesAFKR-3對小檗堿(berberine)和巴馬汀(palmatine)進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌CoelomycetesAFKR-3具有轉(zhuǎn)化小檗堿和巴馬汀(palmatine)的能力，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別為小檗堿7-N-oxide和巴馬汀7-N-oxide，且7-N-oxide具有和小檗堿相同的抗菌活性。

1.2 制備微量天然活性物質(zhì)

天然活性物質(zhì)在植物中往往含量極微，利用傳統(tǒng)的藥材提取方法進(jìn)行分離制備會消耗大量的植物資源，導(dǎo)致植物資源匱乏，化學(xué)合成法制備時反應(yīng)復(fù)雜且成本高，利用微生物及其產(chǎn)生的酶對活性物質(zhì)前體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，可獲得產(chǎn)物結(jié)構(gòu)單一，立體選擇性強(qiáng)的產(chǎn)物，例如左旋紫堇達(dá)明(l-CDL)是中藥元胡中的痕量成分，是左旋四氫巴馬汀(l-THP)的10位羥基化產(chǎn)物，與l-THP相比其鎮(zhèn)痛活性更強(qiáng)且鎮(zhèn)靜催眠等副作用較弱[13]，徐田等[14]研究發(fā)現(xiàn)灰色鏈霉菌StreptomycesgriseusATCC 13273具有轉(zhuǎn)化l-THP生成l-CDL的能力，并通過紫外誘變法對原始菌株進(jìn)行誘變處理，經(jīng)篩選獲得有較高轉(zhuǎn)化率的菌株，并對其生物轉(zhuǎn)化過程進(jìn)行優(yōu)化，該轉(zhuǎn)化反應(yīng)具有高度的立體選擇性，且轉(zhuǎn)化效率高。

1.3 增強(qiáng)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物活性

青藤堿(sinomenine)具有抗炎、免疫抑制作用，臨床上主要用于輔助治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[15]，但是青藤堿生物利用率很低，且有抑制胃腸功能的副作用，因此青藤堿的臨床應(yīng)用受到限制。為了改善其生物利用度，增強(qiáng)活性，鄧張雙等[16]研究了微生物催化青藤堿和芳基小分子的碳碳交叉偶聯(lián)反應(yīng)，將青藤堿、鄰苯二酚與真菌單色云芝Coriolusunicolor進(jìn)行共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)生一種青藤堿1位與鄰苯二酚4位碳碳偶聯(lián)的產(chǎn)物，該轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在SW982細(xì)胞中表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制白介素-6的活性，其抑制率高達(dá)96%，而青藤堿對白介素-6的抑制率只有12%。

嗎啡烷類生物堿具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性，14位碳原子引入羥基可以極大的增強(qiáng)其鎮(zhèn)痛活性，但是，化學(xué)方法很難進(jìn)行14位碳原子的羥基化。Lister等[17]從罌粟種植的土樣中分離得到一株放射型根瘤菌RhizobiumradiobacterR89-1，該菌株能轉(zhuǎn)化可待因(codeine)生成14-羥基可待因，為了提高其生物轉(zhuǎn)化率，對微生物轉(zhuǎn)化條件及菌株的耐受性進(jìn)行了優(yōu)化，最終篩選得到高性能的轉(zhuǎn)化菌株，該菌株在底物添加濃度為6.0 g/L時，可待因仍能完全轉(zhuǎn)化為14-羥基可待因。

1.4 降低毒性

微生物受到外源物質(zhì)刺激時，可將其轉(zhuǎn)化為水溶性更高、毒性更低的物質(zhì)，加速外源物質(zhì)的代謝。Vacek等[18]建立了人肝臟細(xì)胞轉(zhuǎn)化白屈菜紅堿(chelerythrine)和二氫白屈菜紅堿(dihydrochelerythrine)的生物轉(zhuǎn)化模型，并用HPLC-MS技術(shù)對白屈菜紅堿和二氫白屈菜紅堿的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)白屈菜紅堿的主要代謝產(chǎn)物為二氫白屈菜紅堿，二氫白屈菜紅堿的代謝產(chǎn)物主要是氧位去甲基化產(chǎn)物，對兩種代謝產(chǎn)物進(jìn)行毒理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)在添加濃度為50 μmol/L時兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物仍未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，說明白屈菜紅堿的生物轉(zhuǎn)化過程其實是減毒的過程，因此，微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物安全性更高。

1.5 增加水溶性，提高生物利用度

有些芐基四氫異喹啉類生物堿的水溶性差，利用微生物轉(zhuǎn)化在其結(jié)構(gòu)中引入親水性基團(tuán)，可增加其水溶性，提高生物利用度。荷苞牡丹堿(dicentrine)具有較強(qiáng)的抑制乙酰膽堿酯酶作用[19]，Ding等[20]利用羅杰斯無性穗霉菌Clonostachysrogersoniana828H2對地不容中荷苞牡丹堿進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，該轉(zhuǎn)化反應(yīng)具有高度的立體選擇性，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為4R-羥基荷苞牡丹堿，對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與底物的藥理活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和底物都有較強(qiáng)的抑制乙酰膽堿酯酶活性，4位碳原子的羥基化對藥理活性影響不大，但是轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的水溶性提高了近30倍，這為水溶性乙酰膽堿酯酶抑制劑的研發(fā)提供了新的思路。

1.6 利用微生物轉(zhuǎn)化模擬體內(nèi)代謝過程

許多藥物在哺乳動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物與微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物相似，因此在一定程度上可以利用微生物轉(zhuǎn)化模擬藥物在哺乳動物體內(nèi)的代謝。Li等[21]用微紫青霉菌PenicilliumjanthinellumAS 3.510對左旋四氫巴馬汀(l-THP)進(jìn)行微生物化轉(zhuǎn)化，并將微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與l-THP在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行對比，期望建立一個微生物轉(zhuǎn)化模型用來表征l-THP在大鼠體內(nèi)代謝的過程。發(fā)現(xiàn)微生物轉(zhuǎn)化l-THP生成左旋紫堇達(dá)明(l-CDL)、左旋紫堇杷明堿(l-corypalmine)、9-O-desmethyl-l-THP三種去甲基化產(chǎn)物。三種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與l-THP在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相同，說明l-THP的去甲基化反應(yīng)在微生物細(xì)胞內(nèi)和大鼠體內(nèi)有相同的代謝途徑，在一定程度上可以利用微生物轉(zhuǎn)化模型進(jìn)行l(wèi)-THP的體內(nèi)代謝研究。

Vrba等[22]利用重組細(xì)胞色素P450酶和人肝細(xì)胞對巴馬汀(palmatine)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，期望通過巴馬汀的體外轉(zhuǎn)化來表征其體內(nèi)代謝過程，利用LC-MS技術(shù)對其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明巴馬汀在人肝細(xì)胞內(nèi)的代謝反應(yīng)類型主要是氧位去甲基化，而重組酶CYP2D6及CYP1A2可以體外催化巴馬汀的氧位去甲基化反應(yīng)。因此在一定程度上，可以利用微生物轉(zhuǎn)化研究藥物在肝細(xì)胞內(nèi)的代謝過程。

2 小結(jié)及展望

微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)一般是對原化合物某個位點的修飾，不會破壞底物的基本母核，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為底物的類似物，但是結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化可能會導(dǎo)致其生物活性或理化性質(zhì)發(fā)生較大的變化，例如羥基化產(chǎn)物可以增強(qiáng)原化合物的生物活性或增加其水溶性，氮氧化物也可增強(qiáng)原化合物的生物活性，去甲基化反應(yīng)或脫氫還原反應(yīng)可以降低原化合物的毒副作用等。但是，微生物轉(zhuǎn)化在天然活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾中的應(yīng)用仍存在一些問題，比如微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)率較低，存在底物抑制或產(chǎn)物抑制作用等。隨著基因組學(xué)的發(fā)展及基因工程技術(shù)的改進(jìn)，通過新的方式誘變菌種或改建高效的基因工程菌，深入研究微生物轉(zhuǎn)化的機(jī)制，將使微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在越來越多的領(lǐng)域得到應(yīng)用。

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TheMicrobialTransformationofBenzyltetrahydroisoquinolinesAlkaloids

Xu Tao, Liu Jihua*

(Jiangsu Key Laboratory of TCM Evaluation and Translational Research,China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China)

Benzyltetrahydroisoquinolines alkaloids are widely distributed in Magnoliaceae, Menispermaceae, Annonaceae, Papaveraceae, Rutaceae, Lauraceae, Berberidaceae plants. which have varieties of physiological activities, such as anti-tumor, anti-HIV, analgesic, antitussive hypotensive, antibacterial, anti-inflammatory, immunosuppressive and so on. Some of them are widely used in clinical practice, such as morphine, rotundine, codeine, sinomenine, papaverine, etc. In view of its extensive clinical application, the structural modification of benzyltetrahydroisoquinolines alkaloids is a research hotspot. Recently, microbial transformation is more and more widely used in structural modification of natural products. Due to its high efficiency, strong chirality and stereoselectivity, mild reaction conditions, low cost and green environmental protection. In this paper, we have reviewed the application of microbial transformation in the structural modification of benzyltetrahydroisoquinolines alkaloids, which could provide a basis for the further study of benzyltetrahydroisoquinolines alkaloids.

benzyltetrahydroisoquinolines alkaloids; microbial transformation; review

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.06.011

2017-03-17

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(PAPD)。

徐濤，男，碩士研究生，主要從事生物堿的微生物轉(zhuǎn)化研究。E-mail:xt6111116@163.com

*通訊作者：劉吉華。E-mail: liujihua@cpu.edu.cn

Q819

A

1006-9690(2017)06-0050-03