宋玲鈺，劉戰(zhàn)偉，宗愛(ài)珍，賈 敏，徐志祥，徐同成，劉振華，杜方嶺，劉麗娜

(1 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100；2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271000；3 濟(jì)南誠(chéng)匯雙達(dá)化工有限公司，濟(jì)南 250101)

降膽固醇活性花生多肽制備工藝的研究

宋玲鈺1，2，劉戰(zhàn)偉3，宗愛(ài)珍1，賈 敏1，徐志祥2，徐同成1，劉振華1，杜方嶺1，劉麗娜1

(1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100；2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271000；3濟(jì)南誠(chéng)匯雙達(dá)化工有限公司，濟(jì)南 250101)

以冷榨花生粕為原料，酶解制備具有降膽固醇活性的花生多肽。以體外結(jié)合膽酸鹽的能力為指標(biāo)，考察了酶的種類、溫度、pH值、加酶量、酶解時(shí)間等因素對(duì)花生多肽降膽固醇活性的影響，確定最優(yōu)蛋白酶為木瓜蛋白酶，通過(guò)正交試驗(yàn)的方法，確定了酶解花生粕制備降膽固醇活性花生多肽的最佳工藝條件為：溫度50℃、pH 7.0、加酶量4 000 U/g底物、酶解時(shí)間4 h。

冷榨花生粕；酶解；花生多肽；降膽固醇活性

花生是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，經(jīng)冷榨技術(shù)得到的花生蛋白粕，營(yíng)養(yǎng)和功能性都能較好的保存，對(duì)花生多肽活性的研究多集中在抗氧化活性和降血壓活性[1-3]，對(duì)花生多肽的降膽固醇活性研究較少[4-6]，本試驗(yàn)以降膽固醇活性為指標(biāo)，優(yōu)化花生蛋白的酶解工藝，制備出具有降膽固醇活性的花生多肽。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

冷榨花生粕：青島長(zhǎng)壽食品有限公司；無(wú)水乙醚：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、檸檬酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、牛磺膽酸鹽、糠醛、胃蛋白酶和胰蛋白酶：生工生物工程有限公司；木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

ML104電子分析天平，梅特勒·托利多儀器有限公司；TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-92435-III電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；FD-1B-80冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；S210數(shù)字pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；HJ-6A磁力攪拌器，常州市國(guó)華電器有限公司；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵，河南省予華儀器有限公司；A-3SRJX箱式電爐，上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DK-621數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冷榨花生粕成分檢測(cè) 按如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)：蛋白質(zhì)含量測(cè)定《GB/T 5009·5-2010》；水分含量測(cè)定《GB/T 5009·3-2010》；脂肪含量測(cè)定《GB/T 5009·6-2003》；灰分含量測(cè)定《GB/T 5009·4-2010》。

1.3.2 花生多肽的制備 冷榨花生粕→堿溶(料液比1：10，50℃，3 h加3 mol/L NaOH調(diào)pH 8.5)→離心(3 500 r/min，10 min)→上層清液→酸沉(加3 mol/L檸檬酸調(diào)pH 4.5)→離心(3 500 r/min，10 min)→下層沉淀→溶解→酶解→滅酶→離心(3 500 r/min，10 min)→抽濾→調(diào)pH→冷凍干燥 →花生多肽[7]

1.3.3 花生多肽降膽固醇活性的測(cè)定 本試驗(yàn)采用糠醛顯色法[8]測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中多肽對(duì)膽酸鹽的絡(luò)合作用，以多肽對(duì)膽酸鹽、脫氧膽酸鹽以及牛磺膽酸鹽3種膽酸鹽的吸附能力為指標(biāo)，評(píng)價(jià)多肽的降膽固醇活性，以下方法以膽酸鹽為例。

(1)膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別稱取膽酸鹽0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 g置于100 mL棕色容量瓶中，用去離子水溶解至刻度，配成膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液。

采用糠醛顯色法測(cè)定膽酸鹽的含量，取膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，加入6 mL 40%硫酸溶液，振蕩，加入1%糠醛溶液 1 mL，混勻，60℃溫育40 min，待溫度降到室溫后，于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)多肽對(duì)膽酸鹽吸附能力的測(cè)定：量取4 mL 1.6 mg/mL的膽酸鹽溶液，分別加入0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL多肽溶液2 mL，37℃水浴保溫1 h，待反應(yīng)物降到室溫后，4 000 r/min離心分離10 min。吸取上清液2 mL按糠醛顯色法測(cè)其吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中膽酸鹽濃度。計(jì)算公式如式(1)：

(1)

式(1)中：p1為膽酸鹽溶液的初始質(zhì)量濃度(mg/mL)；p2為吸附后膽酸鹽溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL)。

1.3.4 花生多肽酶解工藝中酶的篩選 分別采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解花生粕以降膽固醇活性為指標(biāo)，設(shè)置不同濃度的多肽溶液，確定最優(yōu)蛋白酶。水解的條件均按照蛋白酶說(shuō)明書(shū)中推薦的最適條件(表1)。

表1 酶及水解條件

1.3.5 酶解條件的單因素試驗(yàn) 選取酶解溫度、pH值、加酶量、酶解時(shí)間等4個(gè)因素，以降膽固醇活性為指標(biāo)，探究合適的酶解條件。

(1)酶解溫度對(duì)多肽降膽固醇活性的影響：水解酶為木瓜蛋白酶、pH 6.0、加酶量3 000 U/g、酶解時(shí)間 4 h，測(cè)定酶解溫度為45、50、55、60、65℃時(shí)，不同濃度多肽溶液對(duì)3種膽酸鹽的絡(luò)合作用。

(2)pH值對(duì)多肽降膽固醇活性的影響：水解酶為木瓜蛋白酶、溫度55℃、加酶量3 000 U/g、酶解時(shí)間 4 h，測(cè)定酶解pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.5時(shí)，不同濃度多肽溶液對(duì)3種膽酸鹽的絡(luò)合作用。

(3)加酶量對(duì)多肽降膽固醇活性的影響：水解酶為木瓜蛋白酶、溫度55℃、pH為7.0、酶解時(shí)間4 h，測(cè)定加酶量為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g時(shí)，不同濃度多肽溶液對(duì)3種膽酸鹽的絡(luò)合作用。

(4)酶解時(shí)間對(duì)多肽降膽固醇活性的影響：水解酶為木瓜蛋白酶、溫度55℃、pH為7.0、加酶量為4 000 U/g，測(cè)定酶解時(shí)間為1、2、3、4、5h時(shí)，不同濃度多肽溶液對(duì)3種膽酸鹽的絡(luò)合作用。

(5)酶解條件對(duì)多肽降膽固醇活性影響的正交優(yōu)化:根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶解溫度、pH值、加酶量、酶解時(shí)間為試驗(yàn)因子，以降膽固醇活性為指標(biāo)，將多肽溶液濃度設(shè)為10 mg/mL，作L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定花生蛋白酶解的最優(yōu)工藝(表2)。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與討論

2.1 冷榨花生粕成分分析

冷榨花生餅的主要成分分析詳見(jiàn)表3。

表3 冷榨花生餅的主要成分 單位：%

2.2 膽酸鹽、脫氧膽酸鹽及?；悄懰猁}標(biāo)準(zhǔn)曲線

膽酸鹽、脫氧膽酸鹽及?；悄懰猁}標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 膽酸鹽、脫氧膽酸鹽及牛磺膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 酶的篩選

由圖2～4可見(jiàn)，木瓜蛋白酶的水解產(chǎn)物對(duì)膽酸鹽、脫氧膽酸鹽以及?；悄懰猁}3種膽酸鹽的吸附能力的抑制程度均為最高，且隨著樣品濃度即多肽濃度的增大，抑制程度也呈上升趨勢(shì)，因此，選擇木瓜蛋白酶水解較為理想。

圖2 不同蛋白酶水解產(chǎn)物對(duì)膽酸鹽 吸附能力的影響 圖3 不同蛋白酶水解產(chǎn)物對(duì)脫氧 膽酸鹽吸附能力的影響 圖4 不同蛋白酶水解產(chǎn)物對(duì)?；?膽酸鹽吸附能力的影響

2.4 酶解條件的單因素試驗(yàn)

2.4.1 酶解溫度對(duì)多肽降膽固醇活性的影響 如圖5～7可見(jiàn)，水解酶為木瓜蛋白酶、pH 6.0、加酶量 3 000 U/g、酶解時(shí)間4 h時(shí)，多肽對(duì)3種膽酸鹽的吸附能力的抑制率均為最高，且隨著多肽濃度的升高，抑制率也隨之升高；超過(guò)55℃后，隨著溫度的升高，抑制率呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)闇囟壬?，酶蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致酶活性下降[9]。因此，選擇55℃為最佳酶解溫度。

圖5 酶解溫度對(duì)膽酸鹽吸附 能力的影響 圖6 酶解溫度對(duì)脫氧膽酸鹽 吸附能力的影響 圖7 酶解溫度對(duì)?；悄懰猁} 吸附能力的影響

2.4.2 pH對(duì)多肽降膽固醇活性的影響 如圖8～10所示，水解酶為木瓜蛋白酶、酶解溫度為55℃、加酶量3 000 U/g、酶解時(shí)間4 h時(shí)，pH值從6.0到7.0，抑制率呈上升趨勢(shì)，且隨著多肽濃度的升高，抑制率也隨之升高；再增大pH值，抑制率顯著下降。這是因?yàn)樵擉w系的pH值直接影響酶和底物蛋白分子的某些解離基團(tuán)的離解狀態(tài)，只有在特定的pH值條件下，酶和底物蛋白質(zhì)的解離基團(tuán)才處于結(jié)合和轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的最佳解離狀態(tài)[10]。因此，選擇pH 7.0為最佳酶解pH。

圖8 酶解pH對(duì)膽酸鹽吸附 能力的影響圖9 酶解pH對(duì)脫氧膽酸鹽 吸附能力的影響圖10 酶解pH對(duì)?；悄懰猁} 吸附能力的影響

2.4.3 加酶量對(duì)多肽降膽固醇活性的影響 如圖11～13所示，水解酶為木瓜蛋白酶、酶解溫度為55℃、pH 7.0、酶解時(shí)間4 h時(shí)，隨著酶用量的增加，抑制率增大，且隨著多肽濃度的升高，抑制率也隨之升高。但是當(dāng)酶量高于4 000 U/g底物時(shí)，抑制率雖有所增加但趨于緩慢。考慮到經(jīng)濟(jì)性，因此，選擇 4 000 U/g底物作為最優(yōu)加酶量。

圖11 加酶量對(duì)膽酸鹽吸附 能力的影響 圖12 加酶量對(duì)脫氧膽酸鹽吸附 能力的影響 圖13 加酶量對(duì)牛磺膽酸鹽吸附 能力的影響

2.4.4 酶解時(shí)間對(duì)多肽降膽固醇活性的影響 如圖 14～16所示，水解酶為木瓜蛋白酶、酶解溫度為55℃、pH 7.0、加酶量為4 000 U/g時(shí)，在酶解的1～4 h里，抑制率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，且隨著多肽濃度的升高，抑制率也隨之升高。這主要是因?yàn)槊附忾_(kāi)始時(shí)酶活力高，產(chǎn)物抑制小。4 h后抑制率增加趨勢(shì)明顯變緩。這表明隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性逐漸降低，且游離肽的增多對(duì)產(chǎn)物的抑制增強(qiáng)[11]。

圖14 酶解時(shí)間對(duì)膽酸鹽吸附 能力的影響 圖15 酶解時(shí)間對(duì)脫氧膽酸鹽 吸附能力的影響 圖16 酶解時(shí)間對(duì)牛磺膽酸鹽吸 附能力的影響

2.5 酶解單因素的正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4～6可知，對(duì)膽酸鹽、脫氧膽酸鹽以及牛磺膽酸鹽來(lái)說(shuō)，反應(yīng)條件的主次影響因素均為：pH值>酶解溫度>酶解時(shí)間>加酶量，最佳因素組合為：溫度50℃、pH 7.0、加酶量 4 000 U/g底物、酶解時(shí)間4 h。上述條件采用此工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，RS值分別可達(dá)40.21%、71.96%、55.47%。

3 結(jié)論

木瓜蛋白酶制備降膽固醇花生多肽的最佳工藝條件：溫度50 ℃、pH 7.0、加酶量4 000 U/g底物、酶解時(shí)間4 h，此方案下花生對(duì)膽酸鹽、脫氧膽酸鹽以及牛磺膽酸鹽的抑制率即降膽固醇活性分別可達(dá)40.21%、71.96%、55.47%?！?/p>

表4 正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果——膽酸鹽

表5 正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果——脫氧膽酸鹽

表6 正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果——?；悄懰猁}

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(責(zé)任編輯 李燕妮)

Research on Preparation of Cholesterol Lowering Activity of Peanut Polypeptide

SONG Ling-yu1，2，LIU Zhan-wei3，ZONG Ai-zhen1，JIA Min1，XU Zhi-xiang2，XU Tong-cheng1，LIU Zhen-hua1，DU Fang-ling1，LIU Li-na1

(1Institute of Agro-food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Science/ Shandong Provincial Key Laboratory of Agricultural Products Deep Processing，Jinan 250100，China；2College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271000，China；3Jinan Chenghui-Shuangda Chemical Co.，Ltd.，Jinan 250101，China)

We prepared polypeptide with high cholesterol reducing activity by using cold pressed peanut meal as raw material.With its binding bile salts as an indicator in vitro，the experiment studied the effects of types of enzymes，temperature，pH value，enzyme quantity and enzyme time on the activity of the cholesterol lowering activity of peanut peptides.The results showed that the optimal protease was the papaya protease.The optimum technological parameters were temperature 50℃，pH 7.0，4 000 U/g substrate，and the hydrolysis time of 4 h.

cold pressed peanut meal；enzymatic hydrolysis；peanut polypeptide；cholesterol lowering activity

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2013AA102206)；山東省引進(jìn)泰山學(xué)者海外特聘專家項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：魯財(cái)教[2012]45號(hào))。

宋玲鈺(1990— )，女，在讀碩士研究生，主要從事花生多肽的分離純化及其活性研究。

劉麗娜(1978— )，女，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事花生多肽的分離純化及其活性研究。