張科軍

(廣東華生司法鑒定中心，廣東 廣州 510610)

?

SPE/GC-MS法檢測全血中的杜冷丁

張科軍

(廣東華生司法鑒定中心，廣東 廣州 510610)

建立SPE/GC-MS方法測定全血中杜冷丁的含量。采用MCX 3 mL(60 mg)固相萃取小柱萃取血中杜冷丁，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，結(jié)合保留時間和特征離子及數(shù)據(jù)庫進行定性和定量分析。杜冷丁在1～20 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，儀器方法的檢出限為0.01 μg/mL(S/N≥3)，平均萃取回收率為83.81%，精密度為3.8%，前處理pH值在2～9范圍內(nèi)都能取得良好的萃取效果，C18和HLB固相萃取小柱的對杜冷丁萃取回收率均能達到80%。固相萃取方法適用于全血中杜冷丁的定性定量分析。

杜冷?。还滔噍腿?；氣相色譜質(zhì)譜；全血

杜冷丁又名哌替啶，化學(xué)名是1-甲基-4-苯基-4-哌啶甲酸乙酯，是一種臨床應(yīng)用的人工合成麻醉鎮(zhèn)痛藥，杜冷丁的藥理作用與嗎啡相似，同為阿片受體激動劑，效力約為嗎啡的1/10～1/8，長期使用會產(chǎn)生依耐性，其依賴性程度介于嗎啡和可待因之間，屬違禁藥品[1-2]。

人血中杜冷丁的萃取可用有機溶劑乙酸乙酯[1]、環(huán)己烷[3]和乙醚[4-5]，杜冷丁的檢測可采用GC-NPD、GC-MS和LC-MSMS[1,3-5]。但未見固相萃取血液中杜冷丁方法，固相萃取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、臨床血中藥物濃度檢測、刑事化驗等領(lǐng)域的樣品前處理，本文選用MCX建立提取血中杜冷丁的方法，MCX為混合型強陽離子交換反相吸附劑，它提供了雙重保留模式：離子交換和反相，離子交換通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換柱中可交換離子進行交換而達到分離純化的方法。目前自動化固相萃取儀也越來越被廣泛使用，本文所用的自動萃取儀為吉爾森公司的單通道GX-241。

1 實 驗

1.1 主要儀器與試劑

杜冷丁(1 mg/mL)，Cerilliant；甲醇(色譜純)，超純水，濃鹽酸(分析純)，pH=6緩沖液(色譜純)，十六水四硼酸鈉(分析純)，二氯甲烷(分析純)，異丙醇(分析純)，氫氧化銨(分析純)。

GX-241單通道全自動固相萃取儀，美國Gilson公司；GC 2010 plus -QP2010 plus氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本島津公司。

1.2 樣品預(yù)處理

取空白人全血2 mL于塑料離心管中，加4 mL pH=6緩沖液混勻，超聲振蕩20 min，2500 r/min渦旋2 min，10000 r/min離心20 min，取上清液3 mL供萃取。

采用Waters公司MCX 3 mL 60 mg固相萃取小柱，萃取步驟為：①分別用2 mL甲醇，超純水，pH=6緩沖液以1 mL/min流速淋洗活化柱子；②取上述處理好的液體3 mL以0.5 mL/min流速上樣；③分別用3 mL超純水，3 mL pH=4緩沖液，4 mL甲醇以1 mL/min流速過柱洗脫雜質(zhì)；④用4 mL洗脫液(二氯甲烷:異丙醇:氨水=8:2:0.2)以0.5 mL/min流速洗脫目標(biāo)物，用2 mL空氣吹萃取柱，收集洗脫液于試管中；⑤洗脫液在40 ℃下用氮氣吹干，殘渣用100 μL甲醇溶解，取1 μL進樣。

1.3 儀器分析條件

色譜柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm DB-5 MS，初始溫度120 ℃保持1 min，以5 ℃/min升溫到130 ℃，再以45 ℃/min升溫到210 ℃，最后以15 ℃/min升溫到280 ℃保持8 min；進樣口溫度為280 ℃，氦氣流速1 mL/min，接口溫度280 ℃；EI源為70 eV 、溫度為230 ℃。選擇杜冷丁的特征離子為172、274、218，其中定量離子為274。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取分析結(jié)果

添加1 μg杜冷丁標(biāo)準(zhǔn)品到空白全血中，用上述固相萃取方法和儀器條件進行分析，結(jié)合保留時間和質(zhì)譜圖及NIST數(shù)據(jù)庫進行杜冷丁識別，分離效果好、質(zhì)譜匹配度高，如圖1所示。

圖1 1 μg杜冷丁血樣萃取后的特征離子圖和質(zhì)譜圖

應(yīng)用本文1.2方法對2016年4月佛山交警送檢的血液樣本進行分析，結(jié)果顯示送檢血液樣本中檢出杜冷丁成分，含量為20.2 μg/mL，如圖2所示。

圖2 送檢血液樣本中杜冷丁檢出色譜圖和質(zhì)譜圖

2.2 線性范圍和檢出限

用1 mg/mL杜冷丁標(biāo)準(zhǔn)品配置成1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL五個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3方法處理，以測得的峰面積Y與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X進行線性回歸，線性方程為y=1288.81x-131.52，相關(guān)系數(shù)r2=0.9992，如圖3所示。杜冷丁在1～20 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性。

配置0.1 μg/mL杜冷丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3方法以SIM 247模式進行分析，計算性噪比，以S/N≥3得杜冷丁最低檢出限為0.01 μg/mL。

2.3 回收率和精密度

添加杜冷丁空白全血中使?jié)舛葹?.5 μg/mL，用外標(biāo)法計算杜冷丁的回收率(n=3)，同時用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差公式計算精密度，測得其回收率高于80%，精密度為3.76%，如表1所示。

表1 不同pH值的回收率和精密度

2.4 用不同pH值緩沖液的萃取效果

添加杜冷丁空白全血中使?jié)舛葹?.5 μg/mL，分別用pH=3和pH=9的緩沖液加入到血液中，按照1.2方法萃取，計算杜冷丁的回收率(n=3)及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，如表1所示；在酸性和堿性條件下，回收率效果良好超過90%，說明MCX固相萃取小柱對杜冷丁在酸性和堿性較強的條件下也能有很好的保留效果。

2.5 固相萃取柱比較

分別用HLB、C18固相萃取小柱對0.5 μg/mL杜冷丁加標(biāo)血液進行萃取分析，waters公司HLB 3 mL 60 mg固相萃取小柱的萃取條件：①分別用4 mL甲醇、超純水、pH=6緩沖液以2 mL/min流速淋洗活化柱子；②取按照1.2處理好的上清液以0.5 mL/min的流速上樣；③分別用3 mL pH=6緩沖液、超純水以1 mL/min流速過柱洗脫雜質(zhì)；④用4 mL洗脫液二氯甲烷以0.5 mL/min流速洗脫目標(biāo)物，用2 mL空氣吹萃取柱，收集洗脫液于試管中；⑤洗脫液在40 ℃下用氮氣吹干，殘渣用100 μL甲醇溶解，取1 μL進樣。Agela ODS C183 mL 200 mg固相萃取小柱的萃取條件：

①分別用4 mL甲醇、超純水以2 mL/min流速淋洗活化柱子；②取按照1.2處理好的上清液以0.5 mL/min的流速上樣；③用3 mL超純水以1 mL/min流速過柱洗脫雜質(zhì)；④用4 mL洗脫液甲醇以0.5 mL/min流速洗脫目標(biāo)物，用2 mL空氣吹萃取柱，收集洗脫液于試管中；⑤洗脫液在40 ℃下用氮氣吹干，殘渣用100 μL甲醇溶解，取1 μL進樣。計算杜冷丁的回收率(n=3)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，如表2所示， 杜冷丁的回收率均高于80%，說明HLB和C18固相萃取小柱對杜冷丁都有較好的保留效果。

表2 不同種類SPE小柱的回收率和精密度

3 結(jié) 論

本文建立用SPE/GC-MS法對全血中杜冷丁進行萃取和檢測，pH值對MCX小柱的萃取效果沒有影響，且HLB和C18小柱也對杜冷丁的萃取效果良好，杜冷丁氣質(zhì)檢出限為0.01 μg/mL。本實驗還用二氯甲烷洗脫C18小柱上的杜冷丁，結(jié)果杜冷丁并沒有被洗脫下來，所以選用甲醇作為C18小柱的洗脫液。

[1] 彭安林,張俊萍.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中杜冷丁的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2013,33(08):668-669.

[2] 廖林川,王玉瑾,馬麗霞,等.法醫(yī)毒物分析[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:159-160.

[3] 孟品佳,姚麗娟,王景翰,等.生物檢材中杜冷丁、美沙酮的萃取與檢測[J].中國人民公安大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2004(4):7-9.

[4] 薛月華,沈敏,沈保華,等.全血中杜冷丁的氣-質(zhì)聯(lián)用法測定及代謝動力學(xué)的研究[J].法醫(yī)學(xué)雜志,1996,12(3):139-141.

[5] 黃愛芳,李建波,馮露敏,等.LS-MS法同時檢測人血漿中杜冷丁、曲馬多和美沙酮[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2010,20(12):3191-9192.

Determination of Dolantin in Whole Blood by SPE/GC-MS

ZHANGKe-jun

(Center for Forensic Science Waston Guangdong, Guangdong Guangzhou 510610, China)

An analytical method based on SPE/GC-MS was established for the quantitation of dolantin in whole blood. Dolantin was extracted from blood with solic phase extraction column MCX 3 mL (60 mg), detected by gas chromatography mass spectrometry, and confirmed by retention time, characteristic ions and NIST database. The extraction was quantified by external standard method. There was good linearity between 1～20 μg/mL. The MDL of dolantin was 0.01 μg/mL(S/N≥3).The recovery of the extraction was about 83.8% and RSD was about 3.8%. When the pH value of buffer solution was between 2～9, the extraction effect was good as well. The effect of C18and HLB SPE columns were above 80%. The method of SPE is applicative to confirm and quantify dolantin in whole blood.

dolantin; SPE; GC-MS; whole blood

張科軍(1985-)，男，應(yīng)用化學(xué)專業(yè)碩士，法醫(yī)毒物化學(xué)助理。

O657

A

1001-9677(2016)023-0100-03