李赫宇，趙 玲

(1. 天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津 300457； 2. 武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023)

HPLC法測(cè)定阿法替尼片中主藥和有關(guān)物質(zhì)的含量

李赫宇1，趙 玲2*

(1. 天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津 300457； 2. 武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023)

目的：建立以高效液相色譜法測(cè)定阿法替尼片中主藥和有關(guān)物質(zhì)含量的方法，以控制該制劑的質(zhì)量。方法：色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙酸銨水溶液(30 mmol/L)-甲醇(25∶75)，流速為1.0 ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：阿法替尼檢測(cè)濃度的線性范圍為60.13～600.45 μg/ml(r=0.999 6)；平均回收率為99.41%,RSD為0.86%。結(jié)論：建立的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于阿法替尼片的質(zhì)量控制。

阿法替尼，含量測(cè)定，高效液相色譜法，有關(guān)物質(zhì)

阿法替尼是由德國(guó)勃林格殷格翰公司研發(fā)的多靶點(diǎn)抗癌新藥，于2013年通過(guò)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的審批，用以治療非小細(xì)胞肺癌、大腸癌、乳腺癌和頭頸癌的分子靶向制劑，商品名為T(mén)ovok/Gilotrif[1]。肺癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤，且肺癌患者里約85%為非小細(xì)胞肺癌，嚴(yán)重危害人類(lèi)的生命健康，因此該藥一經(jīng)問(wèn)世很快成為晚期非小細(xì)胞肺癌的一線治療新藥[2]。阿法替尼屬于多靶點(diǎn)酪氨酸激酶(TK) 抑制劑，是TK的不可逆性抑制劑，也是人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑[包括人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)、HER4兩個(gè)亞族]。阿法替尼片劑的主藥以阿法替尼馬來(lái)酸鹽的形式存在?！睹绹?guó)藥典》中尚未收載阿法替尼的含量測(cè)定方法，為此，本文嘗試建立高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定阿法替尼馬來(lái)酸鹽和有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定的方法，為阿法替尼片的質(zhì)量控制，以及評(píng)價(jià)其質(zhì)量的一致性提供可參考的依據(jù)。

1 儀器與試藥

美國(guó)agilent1260高效液相色譜系統(tǒng)；甲醇(美國(guó)Tedia公司產(chǎn)品，色譜純)；乙酸銨(天津市天力化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純)。阿法替尼片(武漢輕工大學(xué)制劑室，批號(hào)150801、150802、150803，規(guī)格：每片含阿法替尼馬來(lái)酸鹽59.12 mg，相當(dāng)于每片含阿法替尼40 mg)；阿法替尼對(duì)照品(武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，批號(hào)150922，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.82%)； 阿法替尼合成方法參考文獻(xiàn)完成[3]。

2 方法與結(jié)果

因阿法替尼馬來(lái)酸鹽在含水溶液中解離成馬來(lái)酸和阿法替尼，馬來(lái)酸為不飽和烯酸，極性較強(qiáng)，在ODS柱上保留時(shí)間短，先出峰，阿法替尼為有機(jī)堿，極性相對(duì)較弱，后出峰。本實(shí)驗(yàn)按外標(biāo)法以阿法替尼來(lái)計(jì)算含量。

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙酸銨水溶液(30 mmol/L)-甲醇(25∶75)，體積流量1.0 ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取阿法替尼對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解,并制成阿法替尼質(zhì)量濃度為505.75 μg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取阿法替尼片劑研細(xì)為粉末適量，約相當(dāng)于阿法替尼12.643 75 mg，精密稱(chēng)定，放置于25 ml量瓶中，用流動(dòng)相乙酸銨水溶液-甲醇溶解并稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 有關(guān)物質(zhì)溶液制備 取阿法替尼片粉末適量，用流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度為20 μg/ml的溶液作為供試液。再用流動(dòng)相稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度為0.2 μg/ml的對(duì)照液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，記錄峰面積，并以流動(dòng)相溶液乙酸銨水溶液(30 mmol/L)-甲醇(25∶75)作為參照。以阿法替尼峰面積計(jì)算，理論塔板數(shù)為8 478，保留時(shí)間為11.784 min，峰形對(duì)稱(chēng)，見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系與檢測(cè)限考查 精密稱(chēng)取阿法替尼對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并稀釋成阿法替尼質(zhì)量濃度分別為60.13、149.89、300.19、451.09和600.45 μg/ml的系列溶液，精密量取各溶液20 μl分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進(jìn)樣的質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=1.018 5C+4.1315(r=0.999 6)。結(jié)果表明，阿法替尼質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，線性范圍為60.13～600.45 μg/ml。以信噪比S/N=3計(jì)算，阿法替尼檢測(cè)限為0.4 ng。

1.阿法替尼

2.5 精密度試驗(yàn) 取阿法替尼對(duì)照品適量，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，精密量取20 μl按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示峰面積積分值的RSD為0.68%，表明本方法精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批號(hào)(批號(hào)為150802)的阿法替尼樣品6份，分別按照“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，分別量取20 μl注入液相色譜儀，依“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示阿法替尼的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.18%，RSD為0.24%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取制備的供試品溶液1份，分別在0、1、2、4和8 h量取20 μl注入液相色譜儀，依“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，峰面積積分值的RSD為0.58%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)的樣品(批號(hào)150801)，按測(cè)試濃度的80%、100%和120% 3個(gè)梯度制備供試品溶液，分別加入一定質(zhì)量的阿法替尼對(duì)照品，每個(gè)濃度各取20 μl的3份樣品注入液相色譜儀，按照 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.41%，RSD為0.86%，見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.9 中間體分離試驗(yàn)及破壞性試驗(yàn) 取阿法替尼對(duì)照品及中間體6-氨基-4-[(3-氯-4-氟-苯基)氨基]-7-[(S)-(四氫呋喃-3-基)氧基]喹唑啉(中間體Ⅰ)適量，用流動(dòng)相配制成阿法替尼質(zhì)量濃度為20 μg/ml,中間體Ⅰ質(zhì)量濃度為2 μg/ml的溶液，作為中間體分離試驗(yàn)的供試溶液。另取阿法替尼片劑粉末(約相當(dāng)于阿法替尼200 μg)5份，分別放置于10 ml的量瓶中。第1份量瓶里加入1 ml物質(zhì)的量為0.1 mol/L的鹽酸溶液；第2份量瓶里加入1 ml物質(zhì)的量為0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液；第3份量瓶里加入1 ml 3%的H2O2溶液。靜置2 h后，第1份量瓶里加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液1 ml酸堿中和后，加流動(dòng)相稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為酸破壞的供試品溶液；第2份量瓶里加入0.1 mol/L的鹽酸1 ml酸堿中和后，加流動(dòng)相稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為堿破壞的供試品溶液；第3份量瓶里加流動(dòng)相稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為氧化破壞的供試品溶液；第4份量瓶置于4 000 lx的光下照射6 h；第5份量瓶置于60 ℃水浴中加熱2 h。分別量取上述各量瓶里的供試品溶液20 μl注入液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果中間體化合物Ⅰ的峰與阿法替尼峰能完全分離；5種極端條件下(酸、堿、氧化、光照和高溫破壞)均有降解產(chǎn)物產(chǎn)生，而且5種降解產(chǎn)物都能與阿法替尼峰完全完分離。中間體分離試驗(yàn)與5種極端條件破壞后的色譜見(jiàn)圖2。

1.馬來(lái)酸 2.雜質(zhì)Ⅰ 3.中間體Ⅰ 4.雜質(zhì)Ⅱ 5.阿法替尼

2.10 樣品含量測(cè)定 取阿法替尼片粉末、阿法替尼對(duì)照品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液和對(duì)照品溶液。分別精密量取20 μl注入液相色譜儀，按照 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并按外標(biāo)法以阿法替尼和阿法替尼馬來(lái)酸鹽的峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

2.11 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定 取阿法替尼片粉末適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試液和對(duì)照液，量取對(duì)照液20 μl進(jìn)樣，調(diào)節(jié)儀器檢測(cè)靈敏度，使阿法替尼峰峰高為滿(mǎn)量程的10%～30%；再量取供試液20 μl進(jìn)樣，記錄色譜至主峰保留時(shí)間的3 倍，記錄主峰和有關(guān)物質(zhì)的峰面積，按1%自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量。結(jié)果3批樣品中有關(guān)物質(zhì)含量分別為0.19%、0.21%和0.20%。

3 討論

阿法替尼是FDA繼吉非替尼、厄洛替尼和拉帕替尼批準(zhǔn)上市的第4個(gè)分子靶向EGFR抑制劑，其是可逆性ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，已經(jīng)被確認(rèn)為治療具有19和21位EGFR突變的晚期非小細(xì)胞肺癌最有效的手段，可提高腫瘤患者的生存期的生活質(zhì)量。但是，對(duì)其主藥的含量和有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法還鮮有報(bào)道。探討其主要成分的質(zhì)量控制方法，可以提高進(jìn)口藥與國(guó)產(chǎn)藥的質(zhì)量一致性，為提高制劑水平提供依據(jù)。

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 前期進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別稱(chēng)取阿法替尼對(duì)照品和阿法替尼片劑粉末適量，用流動(dòng)相乙酸銨水溶液-甲醇配制成質(zhì)量濃度約505.75 μg/ml的對(duì)照品溶液、供試品溶液，按照最新版《中國(guó)藥典》規(guī)定的紫外分光-光度法[5]操作，于200～400 nm波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示對(duì)照品溶液、供試品溶液均于254 nm處有最大吸收，且輔料溶液在此處無(wú)吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)選為254 nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇 通過(guò)反復(fù)配制不同濃度、不同pH的乙酸銨溶液，同時(shí)不斷改變甲醇與乙酸銨溶液的比例，經(jīng)過(guò)多次調(diào)整，最后發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙酸銨水溶液濃度為30 mmol/L，與甲醇的比例為25∶75時(shí)，阿法替尼的主峰保留時(shí)間合適，峰形比較對(duì)稱(chēng)，其與中間體、有關(guān)物質(zhì)和降解產(chǎn)物均能得到比較好的分離，該方法具有較強(qiáng)的專(zhuān)屬性，良好的準(zhǔn)確度和精密度，溶液在8 h內(nèi)也穩(wěn)定。因此，最終確定使用75∶25的甲醇-30 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相。

1 劉丹，欒天，袁瑩，等. 多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑阿法替尼及其類(lèi)似物的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2014，49(24)：2145-2149

2 安富榮，王淑萍，歸小龍. 晚期非小細(xì)胞肺癌一線治療新藥阿法替尼[J] .中國(guó)藥師，2015，18(1)：136-138

3 李晴晴，張慶文. 阿法替尼的合成路線圖解 [J] .中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2015，46(4)：422-425

4 Singer T, Colbatzky F, Platz S. Utilization of inhibitors of EGFR-mediated signal transduction for the treatment of benign prostatic hyperplasia (bph)/prostatic hypertrophy: WO, 2003094921A2 [P]. 2003-11-20

5 中國(guó)藥典[S]．二部.2010：附錄38

藥物與臨床

Quantitative determination of main component and related substances in afatinib tablets by HPLC

Li Heyu1, Zhao Ling2

(1.Tianjin Ubasic Health Nutrition Co Ltd，Tianjin 300457；2. College of Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023)

Objective： To establish an HPLC method for the determination of the main component and related substances in afatinib tablets．Methods： The determination was performed on Kormasil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with mobile phase composed of ammonium acetate solution(30 mmol/L)-methanol(25∶75) at a flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength was set at 254 nm at 30 ℃. The injection size was at 20 μl．Results： The calibration curve of afatinib was linear in the range of 60.13～600.45 μg/ml(n=5，r=0.999 6)，and the average recovery of afatinib was 99.41%(RSD was 0.86%)．Conclusions： This method is rapid，accurate and reliable，and applicable for the quality control of afatinib tablets．

afatinib，content determination，HPLC，related substances

2016-05-27

*通訊作者：趙玲，E-mail：zhaolingcpu@126.com。

R927.2

A

1006-5687(2016)04-0022-04