吳昕怡 劉小莉

云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明 650500

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環(huán)烯醚萜類成分生物合成途徑及關(guān)鍵酶基因研究進(jìn)展

吳昕怡 劉小莉*

云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明 650500

環(huán)烯醚萜類化合物是廣泛存在于雙子葉植物中的一類化合物，具有廣泛的生物活性，如神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用。文章對(duì)藥用植物環(huán)烯醚萜類化合物生物合成途徑及三個(gè)可能的關(guān)鍵酶基因的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步解析環(huán)烯醚萜生物合成途徑以及挖掘功能基因奠定基礎(chǔ)。

藥用植物；環(huán)烯醚萜類化合物；生物合成途徑；關(guān)鍵酶基因

環(huán)烯醚萜類化合物(Iridoids) 是一類環(huán)戊烷結(jié)構(gòu)單元的環(huán)狀單萜衍生物。具有環(huán)戊烷環(huán)烯醚萜(iridoid)和環(huán)戊烷在C7、C8處開環(huán)的裂環(huán)環(huán)烯醚萜(secoiridoid)兩種基本骨架。此類化合物最基本的母核是環(huán)烯醚萜醇，具有環(huán)狀烯醚及醇羥基，由于醇羥基屬于半縮醛羥基，性質(zhì)活潑，故此類化合物多以苷類存在。

雖然環(huán)烯醚萜首次從螞蟻的分泌腺作為防御物質(zhì)分離到, 但目前已知的此類化合物多來自于植物,多見于木犀科、馬鞭科、茜草科、龍膽科、玄參科、唇形科、山茱萸科等雙子葉植物中，具有廣泛的生物活性。如山茱萸科山茱萸環(huán)烯醚苷對(duì)糖尿病引發(fā)的心臟病變、腎功能與結(jié)構(gòu)的改變以及血管并發(fā)癥等多種并發(fā)癥具有較好的防治作用[1]；茜草科巴戟天中的水晶蘭苷，具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用，與巴戟天的祛風(fēng)濕作用密切相關(guān)[2]；海巴戟中得到的citrifolinoside和citrifolinin A對(duì)紫外線誘導(dǎo)的、在腫瘤誘發(fā)和生長(zhǎng)中起重要作用的蛋白活化劑AP-1有顯著的抑制作用，是目前為止發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)具有此活性的環(huán)烯醚萜化合物[3]；海巴戟中的車葉草苷對(duì)銅綠假單胞菌、摩氏變形桿菌的抑制作用，與海巴戟用于治療皮膚病、感冒、發(fā)燒等疾病有關(guān)[4]。環(huán)烯醚萜還是玄參科胡黃連屬植物中主要的化學(xué)成分，胡黃連屬含有二十多種環(huán)烯醚萜類成分，胡黃連苷-Ⅰ和胡黃連苷-Ⅱ是胡黃連環(huán)烯醚萜苷類成分中的主要活性物質(zhì)[5]；玄參中桃葉珊瑚苷具有止痛、降血壓、抗炎、抑制腫瘤生長(zhǎng)、抗病毒、降血糖、抗氧化延緩衰老等多種作用[6]；地黃發(fā)揮療效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)如梓醇益母草苷、桃葉珊瑚苷、蜜力特苷、地黃苷A、D、E都屬于環(huán)烯醚萜類化學(xué)成分[7]。龍膽科龍膽屬和獐芽菜屬中主要的成分也是環(huán)烯醚萜，龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷等成分具有保肝、抗膽堿、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜等作用，已經(jīng)開發(fā)作為抗肝炎和健胃藥等[8]。

環(huán)烯醚萜類化合物多種多樣的生物活性備受研究者的關(guān)注，一直是研究的熱點(diǎn)。但研究主要集中在新化合物的分類鑒定、藥理活性的研究[6,9-11]。隨著對(duì)次生代謝成分生物合成以及功能基因的研究的開展，環(huán)烯醚萜類化合物的生物合成途徑以及功能基因的挖掘研究也積累了很多成果。本文就這一方面的研究進(jìn)行綜述。

1 環(huán)烯醚萜類成分代謝合成途徑

萜類化合物的合成過程可分為3個(gè)階段，即中間體的生成(IPP和DMAPP生成)、萜類化合物的合成(催化IPP和DMAPP生成各種中間體或萜類)和最后的修飾(對(duì)萜類終產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)雜的結(jié)構(gòu)修飾)，環(huán)烯醚萜作為特殊的單萜類成分也具有類似的合成途徑。1.1 中間體的生成 公認(rèn)的環(huán)烯醚萜中間體生成途徑有兩條：一條為甲羥戊酸途徑(MVA pathway)，該途徑在胞質(zhì)中進(jìn)行，由3分子乙酰輔酶A縮合成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A開始，共計(jì)6個(gè)酶的參與[12]。另一條途徑為甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑(MEP pathway)，它在質(zhì)體中進(jìn)行，由甘油醛-3-磷酸和丙酮酸縮合開始，共計(jì)8個(gè)酶的作用，該途徑所參與的8個(gè)酶已經(jīng)有6個(gè)(除了HDS，HDR)成功結(jié)晶并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定[13]。兩個(gè)途徑最終均合成IPP和其異構(gòu)體體二甲基丙烯基焦磷DMAPP。這兩條途徑發(fā)生于細(xì)胞的不同位置，起始物完全不同，但產(chǎn)物卻完全一致，而且存在著IPP和DMAPP在胞質(zhì)和質(zhì)體之間的交互使用，有學(xué)者認(rèn)為MEP途徑合成的IPP和DMAPP主要用于單萜、雙萜、四萜的生物合成[13]。

自然界中的萜類化合物雖然種類繁多、結(jié)構(gòu)多樣，但都以異戊二烯為基本單位，都起始于共同的前體：IPP 或DMAPP[14-15]。

1.2 環(huán)烯醚萜的骨架構(gòu)成 IPP和DMAPP以“頭-尾”或“頭-頭”的縮合方式在香葉基焦磷酸合酶(geranyl diphosphate synthase，GPPS)催化下縮合成香葉基焦磷酸(geranyl pyrophosphate，GPP)。GPP是重要的分界點(diǎn)，不同的萜類合成自GPP開始通過不同的代謝方向流向單萜、二萜、三萜和生物堿等合成途徑。

對(duì)于環(huán)烯醚萜合成，GPP先去磷酸基團(tuán)而成香葉醇(geraniol)，繼而在香葉醇-10-羥化酶(geraniol 10-hydroxylase，Gl0H)的作用下在C-10位置上羥基化而生成10-羥基-香葉醇(10-hydroxygeraniol)，接著C1和C10部位被氧化成10-氧香葉醛,至此，以上反應(yīng)都屬于鏈?zhǔn)降摹?0-氧香葉醛再經(jīng)過關(guān)鍵的一步環(huán)化，而成環(huán)烯醚萜的骨架琉蟻二醛(iridodial)，作用于此步的酶直到2012年才發(fā)現(xiàn)和獲得，即環(huán)烯醚萜合酶(iridoidsynthase，IS)[16]。

1.3 后修飾階段 一種植物體內(nèi)一般存在多種不同形式的環(huán)烯醚萜類物質(zhì)，主要是因?yàn)檩祁惿锖铣赏緩街泻笮揎椕傅拇嬖?，這些結(jié)構(gòu)修飾包括羥基化、糖基化、甲基化、環(huán)氧化等、酰基化或者結(jié)合小分子等修飾多種反應(yīng)[17]。

環(huán)烯醚萜類化合物具有環(huán)戊烷環(huán)烯醚萜(iridoid)和環(huán)戊烷開裂的裂環(huán)環(huán)烯醚萜(secoiridoid)兩種基本骨架。所以環(huán)烯醚萜類成分的生源途徑主要有兩種：從表伊蟻二醛(epi-iridodial)經(jīng)表去氧番木鱉酸(epi-deoxyloganic)生成桃葉珊瑚苷(aucubin)和類似的脫羧化合物[8]。龍膽科龍膽屬和獐牙菜屬中的主要成分獐牙菜苦苷、龍膽苦苷以及長(zhǎng)春花中多樣的吲哚生物堿均來自裂環(huán)烯醚萜類合成途徑，裂環(huán)番木鱉苷是形成獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、吲哚生物堿等的關(guān)鍵中間體。

相比于環(huán)烯醚萜而言，裂環(huán)環(huán)烯醚萜的生物合成途徑的研究相對(duì)深入，尤其長(zhǎng)春花的吲哚生物堿生物合成途徑進(jìn)行了40多年的研究，合成途徑得到比較多的解析，因而裂環(huán)番木鱉苷之前的生物合成途徑的研究有助于其他植物裂環(huán)環(huán)烯醚萜的生物合成途徑的解析。近幾年，龍膽、秦艽和獐牙菜屬等龍膽科多種植物的研究也積累了不少成果。伊蟻二醛(iridodial)經(jīng)7-deoxyloganetic acid、去氧番木鱉酸(deoxyloganic acid) 、番木鱉酸(loganic acid)、番木鱉苷(loganin)而成裂環(huán)番木鱉苷。這里面涉及到的酶分別是(7-Deoxyloganetic acid synthase, 7DLS)、DLGT(7-deoxyloganetic acid glucosyltransferase)、DL7H(7-deoxyloganic acid 7-hydroxylase)、LAMT(loganic acid o-methyltransferase)、SLS(secologanin synthase)5種酶[18-19]。

2 環(huán)烯醚萜類成分三個(gè)重要功能基因研究進(jìn)展

IPP和DMAPP生成之前相關(guān)途徑中的關(guān)鍵酶已有很多表述，此文重點(diǎn)綜述IPP和DMAPP生成之后即萜類化合物的合成和修飾的相關(guān)功能基因的研究。

G10H基因香葉醇是環(huán)烯醚萜類化合物生物合成途徑的重要組分。此反應(yīng)是生成番木鱉苷的第一個(gè)專屬步驟，G10H 在裂環(huán)番木鱉苷的形成過程中起關(guān)鍵性的調(diào)控作用，是烯醚萜類化合物合成途徑中第一個(gè)限速步驟[20-21]。G10H屬于膜結(jié)合的依賴 NADPH細(xì)胞色素p450單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase)家族中CYP76B 亞家族的成員[22]。除此之外，G10H 還具有較弱的催化3′-羥基柚皮素(3′-hydroxylation of naringenin)生成圣草酚(eriodictyol)的活性，參與植物黃酮類物質(zhì)的合成[23]。

G10H基因首次從長(zhǎng)春花中被純化出來[24]。由于植物體內(nèi)的多種多樣的P450基因，克隆G10H基因比較難。第一個(gè)基因cDNA 2001年從長(zhǎng)春中克隆出來[25]。目前，G10H 酶編碼基因已從長(zhǎng)春花[26]、川西獐牙菜、秦艽、黑紫獐牙菜[27]等植物中克隆得到，且已證明G10H在長(zhǎng)春花中的長(zhǎng)春花堿和川西獐牙菜中的獐牙菜苦苷等物質(zhì)合成過程中起著重要調(diào)節(jié)作用[28]。G10H基因cDNA全長(zhǎng)1578-1637bp，開放閱讀框?yàn)?488-1491，編碼495-496個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)G10H無跨膜或者部分跨膜結(jié)構(gòu)域，在植物不同器官中的表達(dá)量不同，如主要在秦艽的根和花表達(dá)，而在葉、莖總表達(dá)量很低，在川西獐牙菜中，主要在葉中表達(dá)，莖和根表達(dá)微弱。川西獐牙菜中對(duì)胚性細(xì)胞的愈傷組織進(jìn)行了過表達(dá)研究，驗(yàn)證了G10H對(duì)裂環(huán)烯醚萜的上調(diào)作用[28]。

IS基因環(huán)烯醚萜合酶是環(huán)烯醚萜生物合成的關(guān)鍵酶，是孕酮5β-還原酶(P5βR)家族的成員，屬于短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)超基因家族成員[29]。其底物為線狀單萜10-oxogeranial，首次從長(zhǎng)春花中發(fā)現(xiàn)和鑒定。該酶與所有已知的利用香葉二磷酸作為底物并產(chǎn)生一種陽離子中間產(chǎn)物的單萜環(huán)化酶相反，新的環(huán)烯醚萜苷合成酶使單萜在兩個(gè)主要步驟中環(huán)化，前驅(qū)10-氧香葉醛(10-oxogerania1)經(jīng)過一個(gè)傳統(tǒng)的還原反應(yīng)形成一種烯醇中間體，然后通過一個(gè)Diels-Alder環(huán)加成反應(yīng)或邁克爾(Michael)加成反應(yīng)進(jìn)行環(huán)化[30]。環(huán)烯醚萜合酶是科學(xué)家的一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)，這使得研究人員通過生物技術(shù)合成環(huán)烯醚萜類化合物整體成為可能。Hu等[31]首次解析了環(huán)烯醚萜合酶及其復(fù)合體結(jié)構(gòu)，并對(duì)IS的催化機(jī)理進(jìn)行了研究，有反式機(jī)制與順式機(jī)制兩種催化機(jī)制。Lili Qin等[32]為了進(jìn)一步揭示IS的催化機(jī)制，通過從長(zhǎng)春花中克隆、表達(dá)、純化、結(jié)晶的方法分析了環(huán)烯醚萜合酶載脂蛋白和結(jié)合了NADP+/8-oxogeranial的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)活性中心缺少在SDR中經(jīng)典的結(jié)構(gòu)保守區(qū)Tyr/Lys/Ser，Tyr178具有重要的催化功能，IS具有底物專一性。目前，張成玨[33]已在川西獐牙菜 中克隆得到。

SLS基因SLS可以催化番木鱉苷的環(huán)戊烯環(huán)氧化裂解而成開聯(lián)番木鱉苷[34]，也是一個(gè)細(xì)胞色素P450超家族成員，最早是由Vetter等[35]于1993年發(fā)現(xiàn)。喂飼實(shí)驗(yàn)表明這個(gè)反應(yīng)發(fā)生在液泡中[20]，在長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞中分離并進(jìn)行了功能分析，它是一種與細(xì)胞膜相關(guān)的對(duì)氧氣和NADPH依賴的細(xì)胞色素P450單加氧酶[36]。作為直接催化合成開聯(lián)番木鱉苷的酶，是長(zhǎng)春花吲哚生物堿生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，也是裂環(huán)烯醚萜類生物合成的一個(gè)關(guān)鍵酶。

韓梅等[26]采用兩步Gateway-PCR反應(yīng)法從2周齡長(zhǎng)春花幼苗中克隆SLS1481bp的基因片段。Yamamoto等[34]從忍冬的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)粒體的準(zhǔn)備中物中檢測(cè)到SLS。SLS在反應(yīng)中的作用依賴于NADPH和分子氧，能被一氧化碳和細(xì)胞色素P450抑制劑阻斷，表明該反應(yīng)受細(xì)胞色素P450調(diào)節(jié)。免疫組織化學(xué)和原位雜交試驗(yàn)表明SLS定位于長(zhǎng)春花葉片的表皮細(xì)胞中[36]。目前僅從長(zhǎng)春花、喜樹[37]、滇龍膽[38]中克隆到SLS基因。喜樹中SLS基因cDNA長(zhǎng)度1706bp，具1575bp完整的開放閱讀框，編碼524個(gè)氨基酸。GrSLS1基因開放閱讀框長(zhǎng)1560bp，編碼519個(gè)氨基酸。

3 小結(jié)與展望

鑒于環(huán)烯醚萜類成分的重要生物活性，深入解析生物合成途徑和挖掘相關(guān)功能基因，可以為將來通過基因工程方法進(jìn)行酶的體外改造、篩選獲得高效生產(chǎn)的環(huán)烯醚萜類的工程菌奠定重要基礎(chǔ)，或者調(diào)控活性成分的積累，提高藥材的品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

藥用植物中環(huán)烯醚萜類化合物的生物合成途徑尤其是下游途徑的解析以及相關(guān)功能基因的研究還處于起步階段，目前只有對(duì)長(zhǎng)春花、喜樹、獐芽菜屬等少數(shù)植物進(jìn)行過研究。雖然目前推測(cè)環(huán)烯醚萜合酶、開聯(lián)番木鱉苷合成酶可能是關(guān)鍵酶，但其研究還不夠深入，尚需要結(jié)合基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)，對(duì)這些關(guān)鍵酶基因克隆、表達(dá)及功能鑒定、次生代謝途徑的影響及調(diào)控進(jìn)行繼續(xù)深入的研究。

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Progress of Biosynthetic Pathway and the Key Enzyme Genes of Iridoids

WU Xinyi LIU Xiaoli*

Collage of Pharmaceutical of Science, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China

Iridoids are a class of compounds widely found in dicotyledonous plants, which have a wide range of biological activities, such as neuroprotection, anti-tumor, antioxidant, anti-inflammatory and other effects. In this paper, the biosynthetic pathway of iridoids in medicinal plants and three key enzyme genes were reviewed.In order to lay the foundation for further analysis of iridoid biosynthesis pathway and the establishment of functional genes.

Medicinal Plants；lridoid；Biosyntheticpathway；Key Enzyme Genes

云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目自籌項(xiàng)目(2014FZ077);國(guó)家自然科學(xué)基金(8166140544)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究-中醫(yī)聯(lián)合專項(xiàng)(2015FB205(-024))。

吳昕怡(1992-),女,碩士研究生在讀，研究方向?yàn)橹兴庂Y源開發(fā)與利用研究。E-mail:2665438954@qq.com

劉小莉，女，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源學(xué)教學(xué)和科研工作。E-mail:kmxunzi@aliyun.com

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1007-8517(2017)08-0044-05

2017-02-22 編輯：陶希睿)