金春花、劉文博、關(guān)宏锏綜述，金春子審校

一氧化氮合酶各種亞型的信號通路對心力衰竭的作用機制與治療的研究進展

金春花、劉文博、關(guān)宏锏綜述，金春子審校

一氧化氮（NO）是心臟的一種重要的信號分子，它是由三種NO合酶（NOS）即神經(jīng)型NOS（NOS1）、誘導(dǎo)型NOS（NOS2）和內(nèi)皮型NOS（NOS3）產(chǎn)生的內(nèi)源性物質(zhì)。NO信號通過環(huán)鳥苷酸（cGMP）依賴途徑或非依賴途徑進行翻譯后修飾（即cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化，巰基-亞硝基化等）從而調(diào)控下游蛋白。NOS的功能障礙（即表達、定位、耦合和活性的改變等）存在于各種心臟疾病中（如心力衰竭），導(dǎo)致了收縮功能障礙及心室重構(gòu)和肥大。本文將重點闡述在健康和疾病狀態(tài)下NOS各種亞型的信號通路，并討論現(xiàn)有的和潛在的方法通過靶向NO通路來治療心力衰竭。

綜述；一氧化氮合酶；心力衰竭

一氧化氮（NO）是由NO合酶（NOS）蛋白家族合成的多種功能性調(diào)節(jié)氣體。在哺乳動物中，有三種NOS。1995年Balligand等以及1999年Xu等提出，神經(jīng)型NOS（NOS1）和內(nèi)皮型NOS（NOS3），在心室肌細胞中的表達方式為結(jié)構(gòu)型表達，而誘導(dǎo)型NOS（NOS2）的表達受環(huán)境因素影響（例如細胞因子的產(chǎn)生受免疫應(yīng)答影響）。通過NOS1和NOS3生成的NO是鈣依賴型，而NOS2生成的NO是鈣通道/鈣調(diào)蛋白非依賴性的。NOS是由兩個同源單體組成的二聚體。NOS二聚體的C端（還原酶結(jié)構(gòu)域）包括黃素單核苷酸（FMN）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）結(jié)合位點和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），而N端（氧合酶結(jié)構(gòu)域）由L-精氨酸、四氫生物蝶呤（BH4），游離氧（O2），亞鐵血紅素基團組成。另外鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點位于氧合酶結(jié)構(gòu)域和還原酶結(jié)構(gòu)域之間。黃素的作用是將C端（還原酶結(jié)構(gòu)域）的電子轉(zhuǎn)移到另一N端（氧合酶結(jié)構(gòu)域），通過氧化L-精氨酸而生成L-瓜氨酸和NO[1]。

氧化應(yīng)激狀態(tài)下，NOS的產(chǎn)物O2-中斷了NO的產(chǎn)生并代替了NO，使NOS長期解偶聯(lián)。BH4是結(jié)合與血紅素氧化酶域促進L-精氨酸生成NO，但消耗或氧化BH4時可以使電子從還原酶結(jié)構(gòu)域流向氧合酶結(jié)構(gòu)域而使氧生成O2-[2]。此外，NOS3中的谷胱甘肽化在半胱氨酸689和半胱氨酸908阻斷劑的作用下NADPH還原為NADP，從而導(dǎo)致在還原酶結(jié)構(gòu)域中生成O2

-。有報道表明，ONOO-的毒性也同樣使NOS3解偶聯(lián)[3]。因此，在心肌細胞中，NOS主要生成NO。然而，在疾病的條件下，NOS也能導(dǎo)致O2-的生成和ONOO-水平的增加[4]。

1 NOS1 信號

1989年Knowlese等在大腦中首次發(fā)現(xiàn)NOS1，被命名為nNOS。然而，這種酶在各種細胞類型（包括心室肌細胞）中表達，因此又稱為NOS1。NOS1在心肌中主要存在于心肌細胞的肌質(zhì)網(wǎng)（SR）中，但也存在于線粒體、高爾基體和細胞膜中[1]。1999年，Xu研究團隊發(fā)現(xiàn)SR中表達NOS1。這種被表達的NOS1能夠控制肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵（SERCA）而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子的重吸收[5]。顯然，NOS1源性NO是心肌細胞中鈣離子的調(diào)控中至關(guān)重要的調(diào)節(jié)因子。通過使用NOS1基因敲除和心肌細胞特異性NOS1表達模型與NOS1抑制劑的結(jié)合發(fā)現(xiàn)，正常心肌中NOS1產(chǎn)生的NO對正常心臟的收縮和舒張起著調(diào)節(jié)作用。是由NOS1產(chǎn)生的NO通過環(huán)鳥苷酸（cGMP）依賴機制，調(diào)節(jié)心肌細胞膜中的L型鈣通道的活性，以減少細胞內(nèi)大量的一過性鈣離子內(nèi)流，從而調(diào)控細胞內(nèi)鈣超載。相比之下，細胞內(nèi)的Na+/Ca2+交換則不受影響[6]。在SR中，NOS1源性NO促進心肌舒張，是通過增加蛋白激酶A（PKA）依賴的受磷蛋白的磷酸化位點16絲氨酸（P-Ser16PLN）和Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴激酶Ⅱ（CaMKⅡ）-依賴的受磷蛋白的磷酸化位點17蘇氨酸磷酸化（P-Thr17PLN）來促進肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵（SERCA）對鈣的重吸收，繼而抑制蛋白磷酸酶2A和蛋白磷酸酶1的活性[6]。Jin等[7]研究發(fā)現(xiàn)在疾病心臟中NOS1通過PKG依賴的心肌肌鈣蛋白I的磷酸化位點23/24絲氨酸（cTnI23/24）和心臟肌球蛋白結(jié)合蛋白C的磷酸化位點273絲氨酸（cMyBP-C273）的磷酸化抑制肌絲鈣敏感性，導(dǎo)致細胞內(nèi)游離鈣離子增多，繼而使SR的鈣重吸收也增多而調(diào)控心肌細胞收縮性。NOS1源性NO可通過巰基-亞硝基化直接激活肌質(zhì)網(wǎng)鈣通道蛋白（RyR）并增加SR的鈣離子釋放，或間接地通過調(diào)節(jié)PKA、蛋白磷酸酶（PP）活性介導(dǎo)的受磷蛋白的磷酸化，調(diào)控RyR活性以及增強黃嘌呤氧化還原酶（XOR）活性和細胞收縮。 NOS1除了生成NO，也可以得到一個電子生成NO的

2 NOS3信號

NOS3首次發(fā)現(xiàn)于冠狀動脈內(nèi)皮細胞，被稱為eNOS。然而，這種酶也存在于多種細胞類型中（包括心室肌細胞），被更名為NOS3。在心肌細胞，NOS3結(jié)合微囊蛋白-3（Caveolin-3）存在于心肌細胞的胞膜小凹（caveolae）中。除了能夠增加[Ca2+]i，NOS3也可以通過蛋白激酶（Akt）激活絲氨酸1179位點的磷酸化，這對終末期心力衰竭的心肌保護起到重要作用[10]。雖然NO是高度可擴散性的氣體，但NOS信號具有時間和空間的位點局部性[1]。由于NOS1和NOS3存在于心肌細胞的不同部位（心室肌細胞caveolae中和SR中），它們有各自的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、終末靶蛋白以及對心肌功能的影響。與NOS1不同的是，NOS3信號不能調(diào)控心肌細胞的收縮，只能調(diào)控β腎上腺素受體（β-AR）刺激對其引起的收縮。在心肌細胞caveolae中，NOS3定位于L-型鈣通道（LTCC）和β-腎上腺素能受體位點處[1,11]。超氧化物歧化酶（SOD）和NOS3存在的部位相同，可以降低O2-含量。含有O2-的緩沖液，通過SOD驅(qū)動NOS3介導(dǎo)cGMP/可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）/PKG信號通路來使多種靶蛋白磷酸化（即LTCC）。與敲除NOS3基因（NOS1-/-）心肌細胞相比， NOS3-/-心肌細胞給予β-AR刺激，其收縮力增加。由于相同的亞細胞定位，NOS3可以調(diào)控LTCC?？傊焖僖种埔吧托募〖毎鸑OS3或NOS3-/-，β-AR刺激強度更高，鈣離子內(nèi)流增加[1,11]。Sun 等[12]于 2006提出，女性心肌細胞NOS3對LTCC的作用影響高于男性，這說明NOS3信號有性別差異。除了限制β-AR激發(fā)細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流外，NOS3信號也可以縮短動作電位時程。在給予β-AR刺激時，NOS3-/-小鼠動作電位（AP）延長。決定動作電位時程的是各種K+通道。然而，在野生型和NOS3-/-心肌細胞中的K+通道變化（瞬時外向電流（Ito）、靜息電流（IKsus）、內(nèi)向整流電流（IK1））無明顯變化[13]。因此，可以推斷，在NOS3-/-心肌細胞中增加鈣離子內(nèi)流可以使Na+/Ca2+交換（NCX）增強，進而延長動作電位時程。此外，在NOS3-/-心肌細胞中，增加鈣離子內(nèi)流可以導(dǎo)致SR的鈣負(fù)載。如果SR的鈣離子超負(fù)荷，可以導(dǎo)致鈣離子自發(fā)性釋放和后除極[14]。這些情況也存在于NOS3-/-小鼠心肌細胞中。因此，NOS3抑制LTCC可以抑制早后除極來預(yù)防心律失常的發(fā)生。折返性心律失?？梢允笰P持續(xù)時間延長。不幸的是，絕大多數(shù)心力衰竭患者的死因是心律失常[15]。因此，NOS3功能異?？赡軈⑴c心力衰竭患者的心律失常。NOS3參與心律失常的發(fā)生外，還可以抑制心肌肥大。誘導(dǎo)心肌細胞病理性肥厚的主要途徑是活化T細胞核因子（NFAT）鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路。通過介導(dǎo)LTCC鈣離子內(nèi)流激活鈣依賴磷酸酶，使細胞質(zhì)磷酸化和NFAT轉(zhuǎn)移，進一步導(dǎo)致肥厚性基因的表達。因此，NOS3和NO/ cGMP/PKG抑制LTCC會減弱鈣調(diào)磷酸酶的活性，從而抑制NFAT易位和心肌肥厚?？傊?，NOS3源性NO通過限制鈣離子內(nèi)流對心肌有一定的保護作用，可以預(yù)防心律失常的發(fā)生和抑制心肌細胞肥厚。

3 NOS2的信號

NOS2首先在有活性的巨噬細胞中被發(fā)現(xiàn)，被稱為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，并為了統(tǒng)一將其更名為NOS2。在炎癥反應(yīng)中，心室肌細胞也能誘導(dǎo)NOS2的表達。普遍認(rèn)為NOS2參與多種病理條件下的心肌損傷，如缺血再灌注損傷，敗血癥，衰老，心肌梗死和心力衰竭。NOS2信號通過cGMP依賴途徑和非依賴途徑對不同的終末靶蛋白進行多種翻譯后修飾（如磷酸化，S-亞硝基化， 硝化和氧化）,會導(dǎo)致心肌收縮功能障礙。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)NOS2表達的積極影響。這種差異可能是由哪種途徑被激活（cGMP依賴途徑或非依賴途徑）和/或終末靶點有關(guān)，這可能取決于心臟中的ROS水平。在疾病早期階段和/或當(dāng)NOS2被表達時，ROS水平很可能會下降。這將允許cGMP依賴途徑介導(dǎo)NOS2信號表達，從而達到保護心肌的目的。例如，NOS2信號可以通過介導(dǎo)PKG磷酸化途徑減弱β-AR刺激ICa，繼而限制非生理條件下的鈣離子內(nèi)流。然而，由于NOS2的激活是鈣通道/鈣調(diào)蛋白非依賴性的，持續(xù)性表達NOS2會降低L-精氨酸的濃度，進而導(dǎo)致NOS2的解偶聯(lián)和O2-的生成[16]。此外，通過線粒體、NADPH氧化酶和XOR可增加心力衰竭患者血中的O2

-含量。由此產(chǎn)生的高濃度的ONOO-。事實上，高濃度的ONOO-會增加NOS2的表達，從而引起心肌收縮功能障礙。因此，NOS2對心肌收縮功能的影響（有利或不利）是時間依賴性的。然而，研究表明，用NOS2基因敲除（NOS2-/-）小鼠制作心力衰竭模型顯示，NOS2的表達對心力衰竭有害。尤其對于壓力負(fù)荷過大（小鼠主動脈縮窄模型）或心肌梗死時，NOS2-/-小鼠可以更好的保護心肌，使減少心肌肥大、心室重構(gòu)、心室擴大、心肌纖維化、收縮功能障礙、細胞凋亡以及降低死亡率[17]。在心力衰竭中，NOS2導(dǎo)致心肌收縮功能障礙的機制是通過在β-AR刺激下減少鈣離子瞬變幅度來抑制基礎(chǔ)收縮力、減弱正性肌力作用。這通過改變RyR活性和降低PLB的磷酸化來實現(xiàn)。

4 靶向NOS治療心力衰竭

心力衰竭患者中，NO生物利用度和氧化應(yīng)激功能減低所導(dǎo)致的NOS功能失調(diào)是收縮功能障礙、心肌肥厚和心室重構(gòu)的直接原因。多種治療方法都嘗試去修復(fù)心力衰竭患者的NO信號，但收效甚微。如前所訴，對NOS2的抑制有利于降低心力衰竭患者的ONOO-水平。然而，試驗已經(jīng)由于患者的負(fù)面影響，最有可能是由于其它NOS同工酶的抑制作用而提前終止。因此，研究并開發(fā)一種NOS2抑制劑并且不影響其它NOS同工酶是非常有必要的。另一種方法是廣泛增加NO的水平。例如，通過增加血NO濃度，治療心絞痛、慢性性心力衰竭患者的缺血癥狀，但由于長期消耗使超氧化物生成逐漸增加而表現(xiàn)出相應(yīng)的副作用[18]。其結(jié)果可能產(chǎn)生更高水平的ONOO-，而對患者更加有害。另一種方法是用藥物合理補充BH4來耦合NOS3從而增加NO的含量。不幸的是，BH4在心力衰竭患者中很容易被氧化成BH2并且對NOS3影響有限。也有些化合物（例如奈必洛爾），能夠增加NOS3的表達并且防止其解偶聯(lián)。這些化合物對動物心力衰竭模型和人類細胞系都有積極的影響，但對人類的心力衰竭無效。其他的化合物，如硫化氫可以通過Akt依賴途徑增加NOS3活性，這樣可能對心力衰竭的治療有益。其他的方法還可以瞄準(zhǔn)NOS3下游蛋白來增加cGMP水平。通過直接應(yīng)用可溶性鳥苷酸環(huán)化酶激活劑（如西那西呱）或使用特定的PDE5抑制劑（如烏地那非、西地那非和伐地那非）。這些化合物均在收縮性/舒張性心力衰竭的患者中進行臨床試驗并得出了各種測試結(jié)果。然而，西那西呱并沒有得出任何有益的影響。隨著慢性PDE5的逐漸抑制似乎改善了心力衰竭患者心功能和臨床狀態(tài)。一些臨床試驗?zāi)壳罢趯﹂L效PDE5抑制劑（烏地那非）或其他形式（例如射血分?jǐn)?shù)正常的心力衰竭）的心力衰竭進行測試[19]。因此，通過利用NOS通道操縱其下游蛋白（特別是通過抑制PDE5增加cGMP水平），來達到治療心力衰竭的目的。

5 結(jié)論

NOS信號在心臟功能調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用。除了其正常的生理調(diào)節(jié)， NOS功能的變化是心力衰竭綜合征的一個主要因素。對每個NOS亞型的表達、定位、活性進行改變，結(jié)果導(dǎo)致下游蛋白質(zhì)功能紊亂，造成了心肌收縮功能障礙和心室重構(gòu)。通過恢復(fù)NO的產(chǎn)生或針對下游機制來解決NOS信號機能失調(diào)的各種治療策略已被提出。然而，在人類心力衰竭模型中僅能獲得有限的有益成果，仍需要進一步研究調(diào)查。

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（編輯：王寶茹）

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國家自然科學(xué)基金（81460039）；吉林省教育廳科研基金（2016-276）；吉林省科技廳青年科研基金（20140520024JH）；吉林省衛(wèi)生廳青年科研基金（2014Q043）

133000 吉林省延吉市，延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 婦科（金春花），心內(nèi)科（劉文博、金春子），神經(jīng)內(nèi)科（關(guān)宏锏）

金春花 主管護師 學(xué)士 主要從事婦科疾病與心力衰竭方面研究 Email：38972010@qq.com 通訊作者:金春子 Email：15526771826@163.com

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1000-3614（2017）08-0830-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.08.025還原產(chǎn)物次硝酸（HNO）。研究表明，外源性HNO和NO信號具有類似的功能，及對心肌收縮的影響和相似靶蛋白（RYR和SERCA/PLB）[8]。有趣的是，在心力衰竭中這種現(xiàn)象普遍存在。研究表明，HNO對心力衰竭的動物模型具有有益作用，并且可能用于心力衰竭治療[9]。

2017-03-23）