董 明

（湖北省十堰市鄖西縣中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 十堰 442600）

血清肌鈣蛋白-I均相化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法的建立

董 明

（湖北省十堰市鄖西縣中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 十堰 442600）

目的 通過光激化學(xué)發(fā)光法建立一種血清肌鈣蛋白-I的均相免疫檢測方法，并探究其應(yīng)用價(jià)值。方法 我院2015年2月至2015年8月間收治的急性心肌梗死患者50例作為研究對象，并以同期接受體檢的健康志愿者50例作為對照，采用光激化學(xué)發(fā)光法建立的免疫檢測法對其血清肌鈣蛋白-I水平進(jìn)行測定，并對該方法進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果 高值血清、中值血清、低值血清標(biāo)本的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均≤10%，重復(fù)性良好；分析靈敏度與功能靈敏度分別為0.048 ng/mL、0.055ng/mL，加入干擾物后的干擾率均≤10%，加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品后的回收率分別為106.56%、103.73%。本文建立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與直接化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果相關(guān)性良好（r2=0.982）。結(jié)論 在光激化學(xué)發(fā)光法基礎(chǔ)上建立的血清肌鈣蛋白-I檢測方法，具有檢測精密度高、重復(fù)性好，靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度俱佳，抗干擾能力強(qiáng)，且無需清洗分離的優(yōu)點(diǎn)，通過方法的進(jìn)一步優(yōu)化可以為臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

血清肌鈣蛋白-I；急性心肌梗死；化學(xué)發(fā)光免疫法；檢測

本文就我院2015年2月至2015年8月間收治的急性心肌梗死患者50例作為研究對象，以光激光化學(xué)發(fā)光法為基礎(chǔ)建立一種血清肌鈣蛋白-I檢測方法，分析其檢測效果，并對其進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)。具體報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取我院2015年2月至2015年8月間收治的急性心肌梗死患者50例作為研究對象，所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會心血管分會制定的《急性心肌梗死診斷和治療指南》中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。50例患者中，男31例，女19例；年齡在34～82歲，平均（52.1±3.7）歲。另取同期在我院接受體檢的健康志愿者50例作為對照，其中，男30例，女20例；年齡在34～79歲，平均（51.5±3.5）歲。兩組受檢者在性別、年齡等方面的比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血清肌鈣蛋白-I檢測方法的建立。制備肌鈣蛋白-I受體-受體微球：使用濃度為0.05 mol/L的MES緩沖液度對預(yù)標(biāo)記的肌鈣蛋白-I多克隆抗體進(jìn)行透析，并通過紫外分光光度儀對其濃度進(jìn)行測定。在0.05 mL MES緩沖液中加入0.5 mg發(fā)光微球行超聲再懸浮后，將其與0.1 mg處理后的抗體、MES緩沖液混勻得到反應(yīng)液，加入25倍氰基硼氫化鈉，在室溫下連續(xù)反應(yīng)48 h，再加入體積為反應(yīng)液1/5和1/10的甘氨酸、氰基硼氫化鈉旋轉(zhuǎn)反應(yīng)后，按照5∶8的比例加入牛血清白蛋白，過夜反應(yīng)，反應(yīng)溫度為4 ℃。經(jīng)MES緩沖液清洗后，將得到的受體微球進(jìn)行稀釋，稀釋濃度為1 mg/mL。

標(biāo)記生物素并配制標(biāo)準(zhǔn)品：以3 mL DMF溶解活化生物素0.1 g，逐漸加入肌鈣蛋白-I單克隆抗體溶液中，室溫反應(yīng)1 h后，以PBS溶液透析，將游離生物素去除后，分裝保存。將肌鈣蛋白-I純品用滅活小牛血清、PBS溶液配制成濃度分別為0、2.5 ng/mL、8 ng/mL、24 ng/mL、36 ng/mL、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，標(biāo)定后分裝備用。

測定：在發(fā)光微孔板內(nèi)依次加入生物素標(biāo)記抗體、標(biāo)準(zhǔn)品（待測樣本）、受體球（均為25 μL）混勻后，于避光條件下加入鏈霉素及供體微球（加入量為175 μL），混勻后讀取光信號值，肌鈣蛋白-I標(biāo)準(zhǔn)品-光信號值的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制完成后，可以據(jù)此獲得待測樣本中肌鈣蛋白-I的水平。

1.2.2 方法學(xué)評價(jià)。精密度評價(jià)：采集健康志愿者的血液標(biāo)本，通過處理后將獲得的血清混合，并將其配制成不同濃度的待測標(biāo)本，保存在-20 ℃的冰箱中待檢，同一實(shí)驗(yàn)的同一標(biāo)本做十次檢驗(yàn)，并對其批內(nèi)精密度進(jìn)行計(jì)算；同時，對3種不同標(biāo)本連續(xù)10 d的測定值進(jìn)行記錄，計(jì)算批間精密度。

靈敏度評價(jià)：選擇不含肌鈣蛋白-I的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行反復(fù)測定，記錄十次測得的光信號值，并分別計(jì)算其平均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對分析靈敏度進(jìn)行計(jì)算；同時，選擇低值樣本再次進(jìn)行倍比稀釋，分裝保存，將統(tǒng)一系列不同值的樣本進(jìn)行連續(xù)測定，每天重復(fù)精密度為20%的對應(yīng)濃度記為功能靈敏度。

特異性評價(jià)：分別向低值血清與高值血清中加入血紅蛋白（5 g/L）、三酰甘油（11 mol/L）、總膽紅素（240 μmol/L）、蛋白質(zhì)干擾物（12 mg/dL）進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，并以加入不含肌鈣蛋白-I等體積基質(zhì)的樣本為基礎(chǔ)樣本，分別對其濃度進(jìn)行測定，并以基礎(chǔ)樣品測定濃度與分析樣品測定濃度之差/基礎(chǔ)樣品測定濃度的百分比為干擾率。

準(zhǔn)確度評價(jià)：將混合后的健康志愿者血清分3份，并在其中2份中加入等體積的標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為8 ng/mL、36 ng/mL，另一份中加入無肌鈣蛋白-I的基質(zhì)，分貝對不同樣品的濃度值進(jìn)行檢測，并按照分析樣品測定濃度與基礎(chǔ)樣品測定濃度之差/加入濃度的百分比為回收率。

與直接化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)：分別采集50例急性心肌梗死患者的血液標(biāo)本，采用本文建立的方法與直接化學(xué)發(fā)光法分別進(jìn)行測定，并行相關(guān)性實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相關(guān)性分析采用person分析法，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 精密度：高值血清、中值血清、低值血清標(biāo)本的批內(nèi)變異系數(shù)分別為5.23%、4.97%、3.41%，批間變異系數(shù)分別為7.23%、8.54%、8.22%，均≤10%，重復(fù)性良好。

2.2 靈敏度：經(jīng)計(jì)算，分析靈敏度與功能靈敏度分別為0.048 ng/mL、 0.055 ng/mL。

2.3 特異性：低值血清加入血紅蛋白、三酰甘油、總膽紅素、蛋白質(zhì)干擾物后的干擾率分別為9.21%、9.34%、9.18%、9.03%；高值血清中加入血紅蛋白、三酰甘油、總膽紅素、蛋白質(zhì)干擾物后的干擾率分別為8.23%、8.02%、8.00%、7.81%。

2.4 準(zhǔn)確度：加入濃度為8 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品后，回收率為106.56%；加入濃度為36 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品后，回收率為103.73%。

2.5 與直接化學(xué)發(fā)光法的相關(guān)性：將本文建立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與直接化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，r2=0.982，相關(guān)性良好。

3 討 論

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展和物質(zhì)生活水平的不斷提高，人們的生活方式、飲食結(jié)構(gòu)都出現(xiàn)了巨大的改變，與之密切相關(guān)的心血管疾病發(fā)生率也呈現(xiàn)快速上升的趨勢，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命安全。急性心肌梗死就是十分嚴(yán)重的一種，早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療是挽救急性心肌梗死患者的重要途徑[1]，特別是對于非ST段抬高型的急性心肌梗死患者而言，其臨床癥狀不典型，心電圖改變不明顯，容易被忽視而造成嚴(yán)重后果，而血清肌鈣蛋白-I作為一種心肌損傷標(biāo)志物在心肌損傷的診斷中具有良好的敏感性和很高的特異性，被認(rèn)為是急性心肌梗死的診斷金標(biāo)準(zhǔn)[2]，對血清肌鈣蛋白-I的水平進(jìn)行定量測定也可以對心肌梗死面積進(jìn)行反映，利于繼發(fā)性心肌梗死或者復(fù)發(fā)性心肌梗死患者的及時發(fā)現(xiàn)[3]。

臨床檢測血清肌鈣蛋白-I的方法包括金標(biāo)免疫層析法、酶聯(lián)免疫分析法、放射免疫法等多種，金標(biāo)免疫層析法在實(shí)踐應(yīng)用中雖然操作簡便，標(biāo)本用量也很少，但其受主觀影視影響大，且無法實(shí)現(xiàn)定量測定；酶聯(lián)免疫分析法的顯色靈敏度較低，同樣無法實(shí)現(xiàn)完全的定量測定；而放射免疫法的放射污染大，使用限制較大?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法雖然同時具備了良好的檢測靈敏度、特異性，能夠?qū)崿F(xiàn)自動化定量分析，但檢測費(fèi)用較高，推廣難度大。選擇一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、背景干擾小、安全性好、精度高、能實(shí)現(xiàn)定量檢測、經(jīng)濟(jì)性好、普及度廣的肌鈣蛋白-I檢測方法對于急性心肌梗死患者具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)中使用的光激化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)以能量的近距離轉(zhuǎn)移為核心，可以在抗原-抗體特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)上，把激發(fā)態(tài)單線態(tài)氧供體球的極短距離傳遞，轉(zhuǎn)移到受體球，并使其發(fā)光，通過繪制不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的光信號值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得可以用來測定樣本被測物含量的數(shù)學(xué)模型，其有檢測均相，無需清洗分離的優(yōu)勢[4]，以雙抗體夾心法為基礎(chǔ)，通過光激化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)血清肌鈣蛋白-I的快速、敏感檢測，且價(jià)格相對較低。本文對該法進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)，可見其精密度高、重復(fù)性好，且有良好的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度，抗干擾能力強(qiáng)。將其與直接化學(xué)發(fā)光法的測定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，則可見其r2為0.982，相關(guān)性好，檢測效果可靠。當(dāng)然，在實(shí)踐應(yīng)用過程中，還需對相關(guān)的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，對相關(guān)問題進(jìn)行進(jìn)一步分析和解決，為其臨床推廣奠定基礎(chǔ)。

[1] 程敏卓,張向輝,趙衛(wèi)國.基于光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)開發(fā)的多表位檢測cTnI的方法[J].免疫學(xué)雜志,2014,30(9):825-827.

[2] 石興景.兩種方法測定肌鈣蛋白I結(jié)果的比對分析[J].中國醫(yī)療前沿,2011,6(8):67-69.

[3] 賈娟娟,劉一兵,張雪峰,等.人心肌肌鈣蛋白I酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的建立[J].標(biāo)記免疫分析與臨床,2012,19(5):282-284.

[4] 李玉芹,牛文彥,朱黎娜,等.血清肌鈣蛋白-I均相化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法的建立[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2014,30(10):1640-1642.

R542.2+2

B

1671-8194（2017）18-0171-02