張紅云，陳秋英

（1. 玉林市動(dòng)物疫病防控控制中心，廣西玉林 537000；2. 廣西麗原生物股份有限公司，廣西南寧 530105）

禽白血病及其診治技術(shù)研究進(jìn)展

張紅云1，陳秋英2

（1. 玉林市動(dòng)物疫病防控控制中心，廣西玉林 537000；2. 廣西麗原生物股份有限公司，廣西南寧 530105）

為了解我國禽白血病的研究現(xiàn)狀，本文概述了禽白血病及禽白血病病毒基本特征，對(duì)比分析了國內(nèi)外建立的多種禽白血病病毒檢測(cè)方法，包括病原學(xué)方法、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法，提出了加強(qiáng)監(jiān)督和疫病凈化、預(yù)防疫苗污染等防控建議，以期為禽白血病防控提供參考。

禽白血??；J亞群；診治技術(shù)；預(yù)防控制

禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的一種危害雞群的傳染性腫瘤病。自1868年禽白血病被首次報(bào)道以來，該病因造成較大的經(jīng)濟(jì)損失而被廣泛關(guān)注[1]。該病最早在我國發(fā)現(xiàn)于一些肉雞病例中，后來逐漸出現(xiàn)在蛋雞群體中，雞感染后會(huì)出現(xiàn)腫瘤性死亡、生長性能下降和免疫抑制等癥狀，給我國養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失[2-3]。

ALV是一種反轉(zhuǎn)錄病毒，既可以通過種蛋垂直傳播，也可以水平感染。根據(jù)病毒與宿主細(xì)胞特異性相關(guān)的囊膜蛋白的抗原性，可將ALV分成A—J 10個(gè)亞群，自然感染雞群的包括A、B、C、D、E和J 6個(gè)亞群[4]。2012年，王鑫等[4]從我國地方品種蘆花雞中分離到3株ALV，經(jīng)鑒定這3株病毒與已知感染雞的6個(gè)亞群均有一定的差異性，屬于一個(gè)新的亞群，被定名為K亞群。其中，E亞群是非致病性的或者致病性很弱，J亞群的致病性和傳染性最強(qiáng)[5]。J亞群禽白血病病毒（ALV-J）是20世紀(jì)80年代末期在英國從肉用型雞群中分離到的一種致病性ALV新亞群。1999年，國內(nèi)杜巖等[6]首次從市場(chǎng)肉雞中分離檢出J亞群ALV，隨后該病毒在多個(gè)省份都有檢出[2]。ALV-J可引起肉雞骨髓細(xì)胞瘤和血管瘤、體重下降、生長抑制和嚴(yán)重的免疫抑制。蛋雞可感染，但自然發(fā)病率很低。2005年徐鑌蕊等[7]用ALV-J gp85單克隆抗體在分子水平上證實(shí)了我國蛋雞中存在J亞群ALV，而一些地方品系雞也被證實(shí)有ALV-J感染的存在[8]。

有學(xué)者一直關(guān)注該病在我國的發(fā)生與流行情況，但目前仍無有效的商品化疫苗，也無特效治療藥物。因此，通過各種方法對(duì)雞群進(jìn)行ALV檢測(cè)，淘汰帶毒種雞，逐漸凈化種雞群，仍然是當(dāng)前預(yù)防該病的主要方法。面對(duì)這種由病毒感染引起的傳染性腫瘤，選擇一種有效的診斷方法是預(yù)防該病的重要環(huán)節(jié)。多年來，國內(nèi)外相繼建立了多種ALV檢測(cè)方法。本文對(duì)一些常見方法進(jìn)行分析比較，以期有助于雞群中ALV凈化工作的順利進(jìn)行。

1 禽白血病的診斷技術(shù)

1.1 病原的分離與鑒定

通過細(xì)胞培養(yǎng)和雞胚分離培養(yǎng)進(jìn)行病毒的分離鑒定，被認(rèn)為是目前最可靠的方法。但該方法耗時(shí)較長、操作過程復(fù)雜，不適用于禽白血病的快速診斷和臨床應(yīng)用。而將該方法結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）或間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA），可以對(duì)雞群ALV進(jìn)行批量檢測(cè)，適用于該病的流行病學(xué)調(diào)查和雞場(chǎng)凈化。

1.2 血清學(xué)檢測(cè)方法

1.2.1 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。20世紀(jì)80年代，張晶[9]等研究出從羽髓中檢測(cè)ALV群特異抗原的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，該方法操作簡(jiǎn)便，適用于現(xiàn)場(chǎng)大面積應(yīng)用，曾在我國的種雞ALV凈化工作中發(fā)揮重要作用。2003年，我國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)將利用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)雞白血病的方法形成了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/ T 1172—2003）。但是由于瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的敏感性較差，且會(huì)出現(xiàn)一定的假陽性[10]，現(xiàn)在已較少使用。

1.2.2 病毒中和試驗(yàn)。病毒中和試驗(yàn)具有較強(qiáng)的特異性。一個(gè)亞群中的ALV只能被同亞群中的ALV對(duì)應(yīng)的抗體所中和，這也是ALV亞群的分類基礎(chǔ)之一[11]。因此，可以用J亞群ALV檢測(cè)感染雞血清中的ALV-J特異性抗體。但ALV-J存在抗原多樣性，而只有抗體與病毒粒子的表面抗原相對(duì)應(yīng)，才能獲得最準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。病毒中和試驗(yàn)?zāi)軌虼笈繖z測(cè)樣品，是一種檢測(cè)ALV的經(jīng)典方法，但因試驗(yàn)操作煩瑣，耗時(shí)費(fèi)料，不適用于臨床診斷。

1.2.3 ELISA。Smith等[12]提純了P27蛋白，并建立了檢測(cè)ALV的雙抗體夾心ELISA。該方法簡(jiǎn)便、快捷、敏感、高效，適用于大面積檢測(cè)。秦愛建等[13]利用ALV-J囊膜蛋白特異性單克隆抗體建立的夾心ELISA法，特異性高，適用于大規(guī)模檢測(cè)。葉建強(qiáng)等[14]利用抗ALV-J囊膜蛋白特異性單克隆抗體JE9，建立了檢測(cè)ALV-Jenv抗原抗體免疫復(fù)合物的ELISA方法。2013年，廖亞琳等[15]利用ALV-J gp85單因子血清純化后的抗體建立了檢測(cè)ALV-J抗原的雙抗體夾心ELISA方法，其具有良好的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，對(duì)ALV-J抗原的最小檢出量為0.165 μg/mL。

1.2.4 IFA。秦愛建等[13]研制出的抗ALV-J nev的單克隆抗體，可鑒定所有的ALV-J變異株，其特異性高，并能檢出組織或培養(yǎng)物中的ALV-J。徐鑌蕊等[16]用F1144單抗和FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗聯(lián)合成功鑒定了從蛋雞中分理處的ALV-J。單克隆抗體的間接熒光抗體檢測(cè)方法，敏感性與特異性較強(qiáng)，但操作復(fù)雜，耗時(shí)較長，不適于在臨床中推廣應(yīng)用，目前多用于實(shí)驗(yàn)室輔助檢測(cè)。

1.2.5 小結(jié)。血清學(xué)檢測(cè)方法是依據(jù)抗原與抗體之間發(fā)生特異性結(jié)合的原理來檢測(cè)抗體和抗原的檢測(cè)方法。血清學(xué)檢測(cè)時(shí)，主要針對(duì)兩種ALV抗原蛋白，其中g(shù)p85是囊膜糖蛋白，可以區(qū)別不同亞群，對(duì)A、B和J亞群ALV，可以用針對(duì)該蛋白的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。而p27是衣殼蛋白，屬于群特異性抗原，不能區(qū)分亞群，因此在檢測(cè)過程中可能會(huì)受內(nèi)源性ALV-E的干擾，出現(xiàn)假陽性，需針對(duì)不同的ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)?？偟膩碚f，上述ALV的血清學(xué)檢測(cè)方法中，ELISA方法最為常用。相對(duì)于其他血清學(xué)檢測(cè)方法，ELISA方法操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，適用于大批量樣品的檢測(cè)，在臨床上應(yīng)用較廣泛，市面上也有專門的檢測(cè)試劑盒在銷售，這也是國內(nèi)外一些大型養(yǎng)禽場(chǎng)對(duì)禽群中ALV的進(jìn)行定期檢測(cè)和種群凈化時(shí)常用的方法。

1.3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

1.3.1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。PCR方法因檢測(cè)組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中ALV前病毒DNA高靈敏性而被廣泛應(yīng)用。Smith等[17]分別從pol基因和gp85基因片段中選取一段作為上游和下游引物序列，避免了與內(nèi)源性EAV序列發(fā)生非特異性反應(yīng)。Smith[18]等、秦愛建[13]等分別基于env基因序列建立了PCR檢測(cè)方法，但由于ALV-J不同毒株中env基因的變異較大，需經(jīng)常驗(yàn)證是否能檢測(cè)到所有變異病毒。Kim等[19]建立了定量競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR法（Qc-RT-PCR），可以對(duì)ALV-J感染進(jìn)行檢測(cè)并定量。2012年Sathish等[20]基于ALV的p27基因建立了PCR方法。該方法同時(shí)與馬立克病毒和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥的PCR方法組成多重PCR。他們?cè)谟《饶喜康貐^(qū)的一些蛋禽場(chǎng)收集有這3種疾病癥狀的樣品，先用特異性抗體進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)確定樣品的病理變化，再進(jìn)行病毒細(xì)胞分離培養(yǎng)和免疫熒光試驗(yàn)驗(yàn)證樣品中這3種病原的存在，然后設(shè)計(jì)特異的引物同時(shí)進(jìn)行多重PCR，試驗(yàn)表明檢測(cè)的陽性結(jié)果是一致的。這種方法能夠這3種禽腫瘤病進(jìn)行快速鑒別診斷，適用于臨床上對(duì)禽腫瘤病多重感染的鑒別診斷。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠更準(zhǔn)確和特異地檢測(cè)病毒。Kim等[21]采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法對(duì)ALV-J RNA進(jìn)行檢測(cè)并量化，并將結(jié)果與其他檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該方法特異性強(qiáng)、易于操作、重復(fù)性好，但敏感性低。2013年Qin等[22]建立了TaqMan探針實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)ALV。該方法對(duì)ALV-J特異性高。將ALV-J的DF-1細(xì)胞培養(yǎng)物，用該方法與TCID50和p27抗原蛋白特異性檢測(cè)，得出的病毒增長曲線是一致的。將該方法與病毒分離培養(yǎng)和普通PCR方法，對(duì)同一批組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法的陽性檢出率均高于另外兩種方法。這種TaqMan探針實(shí)時(shí)RT-PCR特異性強(qiáng)、敏感性高，在臨床檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)室中都適用。2015年Dai等[23]建立了可以分別檢測(cè)ALV-J和ALV-A/ B的SYBR Green I real-time PCR方法。經(jīng)驗(yàn)證，該方法對(duì)ALV-J和ALV-A/B的敏感度比普通PCR高了近百倍，對(duì)組織樣品的陽性檢出率也高于普通PCR和病毒分離培養(yǎng)的方法。它們還利用這種方法對(duì)感染雞的各個(gè)組織進(jìn)行檢測(cè)，找出ALV-J在體內(nèi)的分布情況。

1.3.3 原位PCR。徐鑌蕊等[7]采用原位PCR和原位雜交技術(shù)擴(kuò)增ALV-J DNA，從分子水平上證實(shí)了蛋雞中存在ALV-J感染。

1.3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）。Zhang等[24]以普通水浴鍋和3對(duì)特異性引物建立了一種ALV-J的檢測(cè)技術(shù)。該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快捷、成本低，適用于臨床快速檢測(cè)。

1.3.5 小結(jié)。PCR檢測(cè)方法在敏感性和精確性上均高于ELISA檢測(cè)方法，在檢測(cè)ALV病毒前基因組時(shí)，具有較高的特異性。但該方法不能保證能夠檢出發(fā)生變異的新病毒，因此必要時(shí)需要通過其他方法來驗(yàn)證病毒的變異情況，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，PCR檢測(cè)方法對(duì)試劑、儀器等有特定要求，操作過程復(fù)雜，因此該方法適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，不適于在臨床應(yīng)用中推廣。每種檢測(cè)方法均有優(yōu)劣之分，單純一種方法檢測(cè)容易出現(xiàn)漏檢、假陽性等問題。因此，在進(jìn)行ALV診斷時(shí)，應(yīng)該根據(jù)實(shí)際需要選擇合適的方法結(jié)合起來進(jìn)行檢測(cè)，從而提高檢測(cè)準(zhǔn)確率。

2 禽白血病的預(yù)防和控制

目前還沒有有效預(yù)防ALV的疫苗，通過加強(qiáng)ALV檢測(cè)進(jìn)行種群凈化仍是主要的防治措施。早期我國有研究人員試圖通過對(duì)種雞場(chǎng)進(jìn)行凈化，而達(dá)到控制我國禽白血病甚至是消除該病的目的，但是由于各種因素干擾，最終沒有達(dá)到預(yù)期效果。隨后，不加節(jié)制地從國外引種，隨意擴(kuò)大引種的使用代次，沒有定期的檢疫制度，使ALV橫向傳播，導(dǎo)致ALV擴(kuò)散。

ALV的防控需要各個(gè)環(huán)節(jié)結(jié)合起來，采取綜合防治措施。一是政府主管部門應(yīng)該制定相關(guān)的監(jiān)控、監(jiān)督和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，加強(qiáng)國外引種檢測(cè)，加大內(nèi)部檢疫力度，使整個(gè)行業(yè)逐漸趨于標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化。二是對(duì)種雞群進(jìn)行凈化。國外已經(jīng)有一些大型養(yǎng)禽企業(yè)成功凈化ALV的案例，我們可以借鑒他們的經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合我們自身的情況，制定一系列嚴(yán)格的凈化措施，并切實(shí)執(zhí)行，就有可能實(shí)現(xiàn)基本凈化ALV。三是要預(yù)防弱毒疫苗的污染[25]。弱毒疫苗中外源性ALV的污染很可能是我國蛋雞和地方品系雞群感染ALV的原因之一。因此，需要加強(qiáng)弱毒疫苗中ALV的檢測(cè)和監(jiān)控。四是要提高科學(xué)養(yǎng)殖管理水平，防止因其他免疫抑制病毒的感染導(dǎo)致禽白血病情況惡化。

3 展望

雖然我國當(dāng)前禽白血病防控體系仍不完善，想無法徹底凈化該病，但是一直以來政府都在不斷地努力，同時(shí)還有很多學(xué)者關(guān)注該病的發(fā)展，并致力于研究預(yù)防、檢測(cè)、控制該病的方法。多年來，陸續(xù)出現(xiàn)了一些控制ALV的疫苗，對(duì)ALV的控制起到積極的作用。2015年Liu等[26]結(jié)合ALV和馬立克病毒發(fā)明了兩種可以控制這兩種禽腫瘤病的疫苗，將ALV-J的env或者gag+env基因插入馬立克病毒基因中組成重組病毒，制成了疫苗，均可以有效抑制ALV-J造成的病毒血癥。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，ALV的徹底凈化指日可待。

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（責(zé)任編輯：孫榮釗）

Research Advances of the Diagnostic and Control Technology for Avian Leukosis

Zhang Hongyun1，Chen Qiuying2
（1. Yulin Animal Disease Prevention and Control Center，Yulin，Guangxi 537000；2. Guangxi Liyuan Biological Co.，Ltd，Nanning，Guangxi 530105）

s：To understand the research status of avian leukosis virus in China，the basic characteristics of avian leukosis and its virus were introduced in this paper. A comparative analysis of detection methods for avian leukosis virus has been done，which include etiological method，serological method and molecular biological method. Some suggestions of prevention and control were brought forward on strengthening supervision，disease sequestration and prevention of vaccine contamination，with an aim to provide reference for prevention and control of avian leukosis.

avian leukosis；subgroup J；diagnosis and treatment technology；prevention and control

S855.3

：A

：1005-944X（2017）06-0078-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.023

禽白血病的控制與凈化技術(shù)研究與應(yīng)用（玉市科攻1421029）