丁香瑩 梁敏

1．廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530021

2．廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西南寧530021

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)是臨床最常用的藥物之一，由于具有良好的抗炎、抗毒、抗休克和免疫抑制作用，廣泛用于風濕性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、皮膚病及腎臟病等疾病的治療［1］。然而長期應用GC會導致許多并發(fā)癥，包括骨質(zhì)疏松癥、骨壞死、代謝綜合癥、心血管疾病、感染、白內(nèi)障等［2］，其中所導致的骨質(zhì)疏松癥，稱之為糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松 癥 (glucocorticoid-induced Osteoporosis，GIOP)［3］，是GC最嚴重的并發(fā)癥之一。GIOP是20～45歲人群骨質(zhì)疏松癥最常見的原因。GC治療數(shù)星期后即開始出現(xiàn)骨量丟失，在最初的3個月內(nèi)骨量丟失速度最快，之后為持續(xù)的骨量丟失，1年后骨量丟失速度減慢。在國外一項大樣本的人群調(diào)查中發(fā)現(xiàn)平均0.75%的人長期口服 GC治療［4］，超過40%的使用GC的人群發(fā)生了骨量丟失［5］。GIOP的發(fā)生與激素的劑量密切相關(guān)，大劑量和長時間的激素治療更容易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松和骨折。但是，即使使用小劑量的GC也會出現(xiàn)GIOP。如每日服用2.5 mg強的松也可能發(fā)生椎骨和髖關(guān)節(jié)骨質(zhì)疏松性骨折［6，7］。GIOP引起的骨折嚴重影響生活質(zhì)量，致殘率和致死率高。因此，目前GIOP已成為全世界面臨的嚴峻公共衛(wèi)生問題，危害巨大［8］。

1 細胞凋亡的特點與檢測

細胞凋亡是細胞生理性的死亡，凋亡對組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要的作用。1972年，Kerr等［9］首次提出了“細胞凋亡(apoptosis)”的概念，細胞凋亡具有獨特的形態(tài)學和生化特征，包括細胞收縮、細胞膜外滲、染色質(zhì)濃縮、細胞核DNA降解［10］。凋亡的異常與許多的疾病密切相關(guān)［11］，如癌癥、老年性癡呆［12］等。目前有多種檢測細胞凋亡的方法，隨著細胞凋亡研究的深入，新的檢測方法也被不斷地開發(fā)出來。

1.1 形態(tài)學檢測方法

1.1.1 普通光學顯微鏡和電子顯微鏡:光鏡下可以識別細胞凋亡過程中發(fā)生的形態(tài)變化。采用普通倒置光學顯微鏡觀察細胞凋亡是一個較為快速和廉價的方法，但檢測缺乏客觀性，只能觀察到大體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，較難與細胞壞死區(qū)分開來。電子顯微鏡分透射電鏡和掃描電鏡兩種。一般采用透射電鏡觀察細胞凋亡，透射電鏡是觀察細胞凋亡最經(jīng)典和最可靠的方法［13］。采用電子顯微鏡觀察細胞凋亡可以提供足量的信息，對后續(xù)生化或分子研究有一定的幫助。但是標本的制作需要耗費較長的時間(透射電鏡需5～6 d，掃描電鏡需要24 h)，透射電鏡分析只能對細胞凋亡進行定性，對細胞凋亡程度的定量分析困難。

1.1.2 熒光顯微鏡:在熒光顯微鏡下凋亡細胞核的特征性形態(tài)可被清晰地辨認，正常細胞的細胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)的是黃綠色熒光并且分布均勻，細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)橘紅色熒光，而凋亡細胞的細胞核染色質(zhì)染色呈黃綠色熒光且濃聚在核膜內(nèi)側(cè)。熒光顯微鏡技術(shù)是良好的凋亡檢測手段，但是對于細胞凋亡的早期，熒光顯微鏡很難分辨。

1.2 流式細胞術(shù)

1.2.1 Annexin V-FITC/PI雙染法:細胞凋亡的最早跡象之一是細胞膜的磷脂酰絲氨酸從質(zhì)膜的內(nèi)部轉(zhuǎn)移到細胞膜的外層［14］。膜聯(lián)蛋白V以鈣依賴性的方式結(jié)合這些暴露于膜外磷脂酰絲氨酸，它通常與重要的染料一起使用，例如與核酸結(jié)合的7氨基放線菌素D(7-amino-actinomysin D，7-ADD)或碘化丙啶(propidium lodide，PI)，但PI只有當膜完整性被破壞時才能滲透到質(zhì)膜，如在細胞凋亡或壞死的后期階段。Annexin V-FITC/PI雙染法可用于細胞凋亡的早期檢測，也可用于細胞凋亡的定量和定性研究。但干擾因素多，尤其在處理細胞的過程中很容易產(chǎn)生假陽性和假陰性結(jié)果。

1.2.2 線粒體膜電位的檢測:線粒體是細胞中產(chǎn)生ATP的主要場所，在凋亡發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用，線粒體膜電位變化發(fā)生在核酸酶激活和明顯的形態(tài)變化之前。線粒體膜電位的下降被認為是細胞凋亡過程中最早發(fā)生的事件，一旦線粒體膜電位發(fā)生變化，細胞凋亡將不可逆轉(zhuǎn)［15］。因此通過檢測線粒體膜電位變化可以進行細胞凋亡的早期檢測。

1.3 DNA片段化的分子生物學檢測

在凋亡進行的過程中，DNA降解要早于典型的形態(tài)學改變，因此DNA分子水平的檢測對發(fā)現(xiàn)凋亡有較高的價值。細胞凋亡最明顯的生化特點是激活內(nèi)源性核酸酶，將核染色體的核小體分解形成寡核苷酸片段，大小約180～200bp［14］。主要的檢測方法有瓊脂糖凝膠電泳法(DNA Ladder)和原位切口末端標記法(TUNEL)。這些方法具有較高的特異性和靈敏度，為細胞凋亡提供了強大的工具和檢測手段。

1.3.1 TUNEL法:1992年由Gavrieli首次提出了脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)介導的缺口末端標記(TUNEL)檢測方法［16］。TUNEL法是基于細胞凋亡中斷裂的DNA鏈會產(chǎn)生大量的3＇-OH末端，利用脫氧核糖核甘酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)將標記的dUTP連接到3＇-OH末端［17］。因為正常細胞幾乎沒有DNA斷裂，沒有 3＇-0H 末端產(chǎn)生，故很少染色，因此TUNEL法具有極高的靈敏度，可用于單個細胞的檢測;還可以進行定量分析，被廣泛應用于組織切片中。但是TUNEL方法缺乏專一性。

1.3.2 DNA Ladder法:細胞凋亡啟動時激活核酸內(nèi)切酶，DNA被分解為180～200 bp整數(shù)倍的小片段，在瓊脂糖凝膠電泳中表現(xiàn)為梯狀條帶，這是凋亡特異性結(jié)果。正?；罴毎鸇NA條帶位于加樣孔附近的區(qū)帶，壞死細胞的DNA由于不規(guī)則降解顯示出一條連續(xù)的膜狀條帶。采用這種方法快速簡便易行，但特異性和敏感性較差，只能進行定性分析［18］。

細胞凋亡的研究需要定性和定量研究，常需要結(jié)合多種方法?？筛鶕?jù)標本的不同和研究的需要選擇不同的研究方法。

2 GC對成骨細胞和骨細胞凋亡的影響

2.1 GIOP與成骨細胞凋亡的關(guān)系

對大約42000名男子和婦女的7項隊列研究數(shù)據(jù)進行的Meta分析表明，使用GC會增加任何年齡的腰椎骨折的風險［19］。臨床研究［20］發(fā)現(xiàn)，GIOP 患者的骨組織中成骨細胞數(shù)目減少，成骨細胞的凋亡率增加。動物實驗［21］也證實，小鼠服用強的松后，椎骨骨密度降低;組織形態(tài)學顯示骨小梁面積減少，成骨細胞集落形成單位減少，成骨細胞的凋亡數(shù)目增長3倍，干骺端的皮質(zhì)骨28%的骨細胞發(fā)生調(diào)亡。提示應用GC后，無論人體和動物發(fā)生骨質(zhì)疏松的風險增加，與成骨細胞發(fā)生凋亡有關(guān)。

2.2 GC導致成骨細胞凋亡可能的通路

成骨細胞作為GC主要的作用靶點，在GIOP發(fā)病中起著重要的作用，GC主要通過與 GC受體(glucocorticoid receptor，GR)結(jié)合來發(fā)揮生物學作用［22］，研 究［23］發(fā)現(xiàn)，GR的拮抗劑米非司酮(RU486)，能夠抑制地塞米松導致的細胞凋亡。有研究報道，GC能夠增加 BH3-only蛋白Bim的表達［24］以及下調(diào) TIMP-1［25］來促進成骨細胞的凋亡，導致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。在體外實驗中，過量的GC能夠誘導前凋亡因子Bim和Bak表達，降低存活因子 Bcl-xL 表達［24，26］。過量的 GC 通過促進 Ca2+流出來激活pyk2，活化的pyk2誘導JNK活化，隨后引起細胞凋亡［27］。過量的GC增加了活性氧(ROS)的產(chǎn)生，活性氧(ROS)能夠通過PKCβ/p66shc/JNK通路誘導細胞凋亡，同時過量的GC抑制了Akt，從而抑制了骨形成和防止細胞凋亡所必需的Wnt/βcatenin通路［28］。Wnt信號通路在成骨細胞生成和骨代謝方面具有重要作用，Wnt信號通路促使成骨細胞分化，抑制成骨細胞和骨細胞的凋亡［29，30］。高劑量的GC抑制Wnt信號通路，引起成骨細胞發(fā)生凋亡。在動物實驗及體外培養(yǎng)原代C57BL/6細胞中，GC增加了Wnt通路抑制劑(硬化蛋白和Dkk-1)的表達進而促進成骨細胞的凋亡［31］，在沉默Dkk-1表達后能夠恢復地塞米松促進成骨細胞分化的作用［32］。

2.3 GC導致成骨細胞凋亡與caspase家族

天門冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶(caspases)是一組在凋亡中發(fā)揮重要作用的蛋白酶。caspases在凋亡信號作用下發(fā)生逐級水解活化，最后裂解細胞的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，使細胞降解引起凋亡，caspases活化是導致凋亡的中心環(huán)節(jié)。有研究［33，34］發(fā)現(xiàn) GC 通過激活 caspase-3的活性來誘導成骨細胞凋亡。采用1 μmol/L地塞米松干預成骨細胞系MC3T3-E1細胞，明顯增加活化caspase-3的表達［35］。在我們本課題組研究不同濃度地塞米松干預成骨細胞不同時間后成骨發(fā)生凋亡相比對照組明顯增加，呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性，同時也發(fā)現(xiàn)caspase-3和caspase-9的基因表達增加，呈現(xiàn)出濃度依賴性和時間依賴性。表明GC導致成骨細胞凋亡與caspase家族密切相關(guān)，GC可能是通過激活caspase的活性來誘導成骨細胞凋亡。

2.4 GC導致成骨細胞凋亡的其他靶點

GC還能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激促進成骨細胞凋亡，磷酸化的eIF2a能夠減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，應用磷酸化的eIF2a能夠抑制GC通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所致的成骨細胞和骨細胞凋亡的發(fā)生［36］。研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松通過激活轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1(TAK1)誘導成骨細胞系和骨細胞的凋亡，應用TAK1抑制劑后，能夠阻斷地塞米松所致的成骨細胞凋亡［37］。

綜上所述，成骨細胞是GC作用的主要靶點，GC通過各種機制誘導和促進成骨細胞凋亡，從而導致GIOP的發(fā)生。由此可見，細胞凋亡在GIOP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了極其重要的作用。

3 糖皮質(zhì)激素促進細胞凋亡的相關(guān)基因

細胞凋亡受到嚴格的調(diào)控，具有十分復雜的分子調(diào)控機制，參與的分子和酶也非常多，細胞凋亡的啟動和發(fā)展需要許多基因及其產(chǎn)物參與。參與GIOP中成骨細胞和骨細胞凋亡的基因主要有B細胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)基因家族、p53基因、Fas和FasL基因等。

3.1 Bcl-2基因家族

Bcl-2基因家族有眾多成員，如:Bcl-2、Bcl-x、Bcl-w、Bax、Bak、Bad、Bim、Mcl-1、A1 等。Bcl-2 家族在GIOP中扮演重要的角色［24］，Bcl-2是抗凋亡基因，Bax是促凋亡基因，Bax/Bcl-2的比率的高低決定了細胞凋亡是否發(fā)生。用1 mg/kg的地塞米松處理小鼠72 h，TUNEL染色顯示小鼠成骨細胞的凋亡率比對照組增加了8倍，實驗組成骨細胞的Bcl-2水平下降，Bax水平升高，Bax/Bcl-2比率上升，提示地塞米松通過升高Bax/Bcl-2比率來促進細胞凋亡的發(fā)生［38］。

3.2 p53基因

p53基因是一種重要的抑癌基因，調(diào)控著細胞生長、分化及死亡各方面。近年來研究［39］表明，p53基因在細胞凋亡的調(diào)控中亦有重要作用。研究［35］發(fā)現(xiàn)，地塞米松誘導成骨細胞凋亡與p53基因異常激活有關(guān)，觀察地塞米松對小鼠成骨細胞系的研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期G1期阻滯和細胞凋亡伴隨著p53基因和促凋亡基因Noxa和Puma的表達增加而增加。當p53受到p53 RNA干擾時，地塞米松就不能誘導成骨細胞凋亡和細胞周期阻滯。

3.3 Fas和FasL基因

Fas又稱為CD95分子，F(xiàn)as與其配體Fas L相互作用是引起細胞凋亡的主要途徑之一［40］。大多數(shù)的組織和細胞都有Fas的表達。Fas L為TNF相關(guān)的Ⅱ型膜分子。有研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松誘導的成骨細胞凋亡可能與Fas/CD95死亡受體有關(guān)，應用Fas信號通路的上游caspase-8的抑制劑后，能夠阻斷地塞米松所致的成骨細胞凋亡［41］。

4 結(jié)語

GC是臨床上治療多種疾病的常用藥物，其中以地塞米松應用得最為廣泛。在采用GC治療疾病的同時也導致了繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。GC主要是通過增加成骨細胞凋亡，引起成骨細胞的數(shù)量減少，導致了GIOP的發(fā)生。因此對于需要使用GC治療的患者，可以使用增加骨形成的藥物，如特立帕肽來防治GIOP。由于特立帕肽存在價格昂貴，需要每天注射，有增加骨肉瘤發(fā)病風險等缺陷，因此，有可能通過開發(fā)抑制成骨細胞凋亡的藥物來防治GIOP，為臨床防治GIOP等代謝性骨病提供更好的手段。