夏麗瓊，黃鵬，唐昭山，曾建國(guó)，*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

·綜述·

毛狀根研究進(jìn)展及其在博落回資源創(chuàng)新中的應(yīng)用前景△

夏麗瓊1，黃鵬2，唐昭山3，曾建國(guó)1，2*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；
3.湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

發(fā)根農(nóng)桿菌作為一種天然菌株可用于誘導(dǎo)多種植物產(chǎn)生毛狀根性狀。毛狀根組織能夠穩(wěn)定高效地生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物，該研究領(lǐng)域正受到越來越多的關(guān)注。本文對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌及毛狀根的特性、遺傳機(jī)制和應(yīng)用進(jìn)行了綜述。同時(shí)結(jié)合本課題組前期研究基礎(chǔ)，對(duì)毛狀根在博落回資源創(chuàng)新與新藥源途徑開發(fā)上的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

毛狀根；次生代謝產(chǎn)物；發(fā)根農(nóng)桿菌；博落回；資源創(chuàng)新

毛狀根(hairy roots)是植物宿主經(jīng)過發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)浸染后，在植株的創(chuàng)傷表面被誘導(dǎo)而出現(xiàn)的一種特殊表現(xiàn)型。目前，發(fā)根農(nóng)桿菌已被廣泛應(yīng)用于植物分子育種、植物代謝工程與次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等領(lǐng)域，具有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值和研究意義。目前發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)適用于幾乎所有雙子葉植物及少數(shù)單子葉植物，如黃芪[1]、曼陀羅[2]、人參[3]、西洋參[4]、顛茄[5]、莨菪[6]、決明子[7]、丹參[8]、辣椒[9]、長(zhǎng)春花[10]、罌粟[11]等物種中。本文對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌機(jī)制和原理進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹，并重點(diǎn)關(guān)注毛根技術(shù)在次生代謝產(chǎn)物開發(fā)中的進(jìn)展，然后對(duì)毛狀根技術(shù)在博落回資源開發(fā)中的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行展望。

1 毛狀根特性與形成機(jī)制

發(fā)根農(nóng)桿菌屬于根瘤菌科(Rhizobiaceae)農(nóng)桿菌屬的一種革蘭氏陰性好氧土壤細(xì)菌，具鞭毛，外形呈桿狀，其能感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物及個(gè)別裸子植物[12]。發(fā)根農(nóng)桿菌浸染植物宿主后會(huì)產(chǎn)生大量毛絮狀不定根，又被稱作發(fā)根或毛狀根。其根誘導(dǎo)的主要機(jī)制是發(fā)根農(nóng)桿菌所含的Ri質(zhì)粒。毛狀根誘發(fā)機(jī)制[13]是由于農(nóng)桿菌中的Ri質(zhì)粒上存在T-DNA(轉(zhuǎn)移區(qū))和Vir(致病區(qū))這2個(gè)與轉(zhuǎn)化有關(guān)的功能區(qū)。其中轉(zhuǎn)移區(qū)的主要功能是在轉(zhuǎn)化時(shí)整合到宿主植物基因組，并表達(dá)決定毛狀根形成的基因；致病區(qū)的作用是協(xié)助轉(zhuǎn)移區(qū)完成轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)移區(qū)中共包括左邊界序列TL-DNA和右邊界TR-DNA區(qū)。其中TL-DNA區(qū)中包含有rolA[14-15]、rolB[16]、rolC[17]、rolD[18-19]這幾個(gè)與毛狀根表型性狀產(chǎn)生有關(guān)的基因。這些基因在轉(zhuǎn)入植物宿主后，對(duì)植物宿主表型產(chǎn)生影響，而其中的rolB基因是毛狀根形成最關(guān)鍵的基因[20-22]。而在TR-DNA上有能指導(dǎo)吲哚乙酸合成的tms1和tms2基因，同時(shí)能促進(jìn)毛狀根的生成[23-24]。

2 毛狀根技術(shù)的現(xiàn)狀

2.1 毛狀根技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

相比戶外田間種植的傳統(tǒng)農(nóng)作物或者轉(zhuǎn)基因作物，毛狀根組織始終處于人工可控的封閉環(huán)境中，產(chǎn)生基因漂移的風(fēng)險(xiǎn)大大降低；能快速生長(zhǎng)，在培養(yǎng)過程中會(huì)高速增殖；與根癌農(nóng)桿菌相比毛狀根的遺傳性能穩(wěn)定，繼代與擴(kuò)大培養(yǎng)后生化特性不易改變；毛狀根能在培養(yǎng)基中產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，為提取和分離提供了便利的條件。由于其具有穩(wěn)定的生物合成能力，在對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化后可以實(shí)現(xiàn)可持續(xù)天然產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)；目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有超過450種不同種類的植物易受發(fā)根農(nóng)桿菌侵染[25-26]，包括多種雙子葉植物、單子葉植物家系[27]及一些裸子植物，為代謝通路中靶基因的挖掘和篩選提供了方便。如楊蕊等[28]通過誘導(dǎo)并篩選出了高產(chǎn)量桃葉珊瑚苷的杜仲毛狀根，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于自然根及皮，最高可達(dá)30.105 mg·g-1。Matsuda等[29]通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)甜瓜生成毛狀根，能提高其中精油如(Z)-3-己烯醇，(E)-2-己烯醛，1-壬醇和(Z)-6-壬烯醇含量，且均高于天然成熟瓜果實(shí)。Jiao Jiao等[30]通過誘導(dǎo)黃芪產(chǎn)生毛狀根來生產(chǎn)異黃酮，其最佳培養(yǎng)條件下，34日齡的總異黃酮積累量達(dá)到了234.77 μg·g-1干重(DW)，比田間生長(zhǎng)3年的黃芪根中(187.38 μg·g-1DW)含量更高；除了植物宿主本身的代謝產(chǎn)物以外，毛狀根材料還能夠通過生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生有價(jià)值的化合物，如東莨菪堿、尼古丁、莨菪堿、洋地黃毒苷等[31]。通過底物飼喂可以改變毛狀根天然產(chǎn)物生產(chǎn)，比如Faria等[32]對(duì)蒔蘿毛狀根組織培養(yǎng)15 d后，通過加入薄荷醇或香葉醇(25 mg·L-1)這兩種含氧單萜底物，轉(zhuǎn)化生成為10種新的香葉基乙酸酯，以及芳樟醇和橙花醇氧化物。

2.2 毛狀根技術(shù)的不足

毛狀根技術(shù)雖然具有以上一些優(yōu)點(diǎn)，但是由于還處于發(fā)展和完善階段有以下不足之處：毛狀根組織培養(yǎng)雖然在許多物種中都能夠成功建立體系，但是目前真正能實(shí)現(xiàn)商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的主要是人參，其中最成功的例子是韓國(guó)CBN Biotech公司(http：//cbnbiotech.com)對(duì)人參根進(jìn)行毛狀根的生物反應(yīng)器組培并實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。CBN Biotech公司生產(chǎn)的人參毛狀根能夠在45 d的周期中產(chǎn)生850 kg新鮮和85.4 kg干生物質(zhì)。目前，CBN生物技術(shù)公司每年生產(chǎn)30-35噸人參不定根，其產(chǎn)品大規(guī)模應(yīng)用于制藥、食品和化妝品行業(yè)[33]。但是經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根多次繼代培養(yǎng)后，其體內(nèi)的有效成分會(huì)逐漸減少，甚至丟失，因此許多高價(jià)值的藥用植物毛狀根培養(yǎng)還僅僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段。且就目前情況來看，發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)木本植物與單子葉植物成功率還很低，因此為進(jìn)一步獲得能穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)量的毛狀根株系，其培養(yǎng)條件仍待繼續(xù)優(yōu)化。此外，毛狀根工業(yè)化生產(chǎn)需要較高成本的裝置與設(shè)備，這使其大規(guī)模生產(chǎn)受限，因此還需要進(jìn)一步研制出廉價(jià)的新型生物反應(yīng)器來提高產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

3 博落回毛狀根工業(yè)化生產(chǎn)的可行性

博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br.是罌粟科(Papaveraceae)博落回屬(Macleaya)多年生草本植物，在中國(guó)作為一種傳統(tǒng)天然藥物已經(jīng)使用有很長(zhǎng)時(shí)間。其具有較好的抗炎、殺蟲、抗癌、抗腫瘤、殺菌、調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)等作用[34]。國(guó)內(nèi)研發(fā)的美佑壯已經(jīng)被農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為藥物飼料添加劑，以替代飼用抗生素在國(guó)際上使用。血根堿(SAN)、白屈菜紅堿(CHE)、小檗堿(BBR)等芐基異喹啉類生物堿(BIAs)是博落回主要的生物活性成分。血根堿、白屈菜紅堿等生物堿由于具有良好的抑菌、抗炎作用[35]，在歐洲已成為飼用抗生素的良好替代品[36]。市場(chǎng)對(duì)這些生物堿的需求逐年增加，而博落回作為一種野生資源，數(shù)量逐年減少。目前還未能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模人工種植博落回，且環(huán)境因素對(duì)于人工種植影響很大。而BIAs分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此通過化學(xué)合成血根堿的成本很高，也不利于產(chǎn)品開發(fā)。本課題組正在通過博落回“野生變家種”及“定向培育”等研究手段培育高血根堿含量植株，但是這些傳統(tǒng)育種手段有培育周期長(zhǎng)、成本高等問題。因此，找到一種周期較短且能替代和可持續(xù)高效生產(chǎn)生物堿的方法是當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)毛狀根的技術(shù)已經(jīng)在產(chǎn)生物堿類化合物植物中得到廣泛應(yīng)用。如罌粟中的可卡因還原酶基因(CodR)，在植物表達(dá)載體中過表達(dá)后再通過發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到罌粟中，可以使毛狀根中的嗎啡含量顯著提高[37-39]。長(zhǎng)春花[40]毛狀根比葉和根中長(zhǎng)春新堿的含量分別高0.5倍和23.5倍，長(zhǎng)春堿含量分別高23.5倍和27.4倍。煙草[41]經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)不僅能合成煙堿，而且其煙堿含量均比對(duì)照高；其中以毛狀根多倍體再生植株的煙堿含量最高，達(dá)到432.52 mg·g-1(干重)，且分別約為對(duì)照和二倍體煙草毛狀根再生植株的6.90倍和4.57倍。同樣，一些罌粟科植物也已建立起毛狀根體系，并獲得了高產(chǎn)量的生物堿。如Borbiro[42]早在2000年就已經(jīng)建立起了罌粟的發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系。在此基礎(chǔ)上，有學(xué)者利用該遺傳體系，將可卡因還原酶基因(CodR)在罌粟毛根培養(yǎng)物中過量表達(dá)，將可卡因還原酶基因(CodR)的轉(zhuǎn)錄水平提高了10倍和24倍，并顯著提高了嗎啡和可待因的含量。除了通過基因過表達(dá)，不同發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)植物宿主產(chǎn)生的效果也有差異，通過比較幾種不同的發(fā)根農(nóng)桿菌，篩選出了比野生型罌粟高出3倍可待因含量的高產(chǎn)細(xì)胞株。2010年，有研究通過薊罌粟毛狀根生產(chǎn)血根堿取得了成功，但是由于其中含有一些成癮性物質(zhì)，導(dǎo)致通過薊罌粟工業(yè)化生產(chǎn)血根堿的方案無法實(shí)現(xiàn)[43]。而博落回作為一種完全不含有嗎啡和可待因的植物，可以通過建立毛狀根體系工業(yè)化生產(chǎn)血根堿。

目前，我們已經(jīng)建立了完整的博落回體細(xì)胞再生體系[44]，為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)以及未來的毛狀根組培生產(chǎn)血根堿等次生代謝產(chǎn)物奠定了研究基礎(chǔ)。之后，我們通過建立博落回花藥離體培養(yǎng)技術(shù)，培育出了博落回單倍體材料，為構(gòu)建博落回加倍單倍體或雙單倍體(DH)系提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[45]。2012年通過對(duì)博落回和小果博落回轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序[46]，預(yù)測(cè)了大量參與血根堿合成的功能基因[47-49]。2017年在博落回全基因組測(cè)序基礎(chǔ)上對(duì)14個(gè)參與合成血根堿與白屈菜紅堿的功能基因進(jìn)行了驗(yàn)證。同時(shí)，通過已經(jīng)得到解析的博落回血根堿合成通路，利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，過表達(dá)血根堿通路中的一些關(guān)鍵基因，來提高血根堿含量。前期，本課題組已經(jīng)初步建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的博落回遺傳轉(zhuǎn)化體系[51]，這為發(fā)根農(nóng)桿菌體系的建立提供了研究基礎(chǔ)。

下一步，課題組擬通過使用多種發(fā)根農(nóng)桿菌浸染博落回葉片組織，誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生毛狀根。然后通過超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法(UPLC-QQQ-MS)定量、通過高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(HPLC-Q-TOF-MS)定性等方法檢測(cè)毛狀根組織中BIAs代謝產(chǎn)物的含量，來篩選高血根堿含量的材料以及最優(yōu)化的培養(yǎng)方式。本課題組期望通過前期建立毛狀根體系來實(shí)現(xiàn)博落回資源改良和血根堿新藥源途徑開發(fā)，若能實(shí)現(xiàn)將降低血根堿生產(chǎn)成本和資源的可持續(xù)開發(fā)。

4 展望

迄今為止，絕大部分的生物堿只能從植物中提取。許多含有生物堿的植物屬于野生資源，具有生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、受環(huán)境影響大、采集困難、難以大規(guī)模種植或野生變家種后成本過高等問題。近年來，一些科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用合成生物學(xué)方法在微生物中構(gòu)建整個(gè)植物次生代謝合成途徑，并實(shí)現(xiàn)了在釀酒酵母等微生物中合成生物堿。雖然通過微生物合成生物堿類化合物能夠節(jié)省生產(chǎn)周期，但是由于合成生物堿類化合物的酶種類多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以在微生物中高效表達(dá)。特別是一些合成路徑很長(zhǎng)的生物堿，如嗎啡、血根堿等的產(chǎn)率很低，目前還無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)。因此，在有革命性的新技術(shù)和新發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)之前，運(yùn)用代謝工程技術(shù)開發(fā)博落回毛狀根技術(shù)也許也是開辟博落回新藥源的一種現(xiàn)實(shí)選擇。

雖然發(fā)根農(nóng)桿菌和毛狀根的研究取得了很多成果，但由于其利用時(shí)間還比較短，還有很多地方值得進(jìn)一步研究。首先，不同的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根的能力有差異，因此需要篩選出適合誘導(dǎo)博落回的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株。其次，在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)博落回毛狀根來實(shí)現(xiàn)次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，其對(duì)于生物反應(yīng)器的大小、形狀等條件，對(duì)其次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的影響，需要充分的研究,摸索出合適的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)方式，使其得到最優(yōu)化，最大限度地提高目的產(chǎn)物。目前，博落回資源的開發(fā)還主要集中在傳統(tǒng)育種與提取工藝的改進(jìn)上，通過毛狀根技術(shù)來擴(kuò)大博落回資源的開發(fā)利用將是未來一個(gè)重要的研究方向。

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ResearchprogressofHairyRootsandApplicationProspectinMacleayacordataResourceInnovation

XIA Liqiong1，HUANG Peng2，TANG Zhaoshan3，ZENG Jianguo1，2*

(1.Schoolofpharmacy，HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208，China；2.NationalandLocalUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；3.MicolltaBioresourceInc，Changsha41005，China)

Agrobacteriumrhizogenesas a natural strain can be used to induce a variety of plants to produce hairy root.The research of hairy root tissues of many plants is able to produce secondary metabolites in a stable and efficient way，which is attracting more and more attentions.In this paper，we reviewed the characteristics，genetic mechanism and application ofAgrobacteriumrhizogenesand hairy roots.Meanwhile，we combined with our previous research to discuss the application prospects of hairy root in resource innovation and new drug sources development inM.cordata.

Hairy root；secondary metabolites；Agrobacteriumrhizogenes；Macleayacordata；resource innovation

湖南省科技重點(diǎn)計(jì)劃(2016SK3002)

*

曾建國(guó)，教授，研究方向：中藥資源綜合利用；Tel：(0731)84673824，E-mail：zengjianguo@hunau.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.028

2017-02-20)