劉英 江霞

·綜述·

糖尿病細胞治療的研究進展

劉英 江霞

糖尿病細胞治療能重建胰島β細胞功能，為治愈糖尿病提供了可能。胰島移植是一種能夠穩(wěn)定控制血糖并且耐受良好的治療手段，可有效改善血糖代謝及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，提高生活質(zhì)量，但稀缺的胰腺供體和長期免疫排斥治療引發(fā)了多能干細胞的相關(guān)性研究，目前已在糖尿病小鼠的基礎(chǔ)試驗中證實了其具有逆轉(zhuǎn)糖尿病的潛能，然而安全是其致命的弱點。近些年，針對胰腺祖細胞的體外研究顯示通過化學(xué)方法可以刺激腺泡或α細胞轉(zhuǎn)化為β細胞新生并在不需要移植的情況下改善胰腺功能，規(guī)避不良反應(yīng)。所以，糖尿病細胞治療是潛能與風(fēng)險并存的，只有揚長避短，才能為糖尿病治療提供新的有效的方法。

糖尿??； 胰腺； 移植； 多能干細胞； 細胞轉(zhuǎn)分化

糖尿病是日益嚴(yán)重的世界公共衛(wèi)生問題，截止到2011年全球的糖尿病患者已經(jīng)達到3.66億人，預(yù)計到2030年糖尿病患者將激增至4.39億人[1-2]。大量循證醫(yī)學(xué)研究顯示，糖尿病患者重建胰島內(nèi)源性分泌系統(tǒng)對延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展至關(guān)重要，所以尋求更有效的治療方法成為內(nèi)分泌臨床醫(yī)生亟待解決的問題。近些年，越來越多的學(xué)者將細胞治療作為糖尿病的治療靶點。本文將從胰島移植、多能干細胞分化及體細胞的重組或轉(zhuǎn)分化等方面來闡述糖尿病細胞治療的研究進展。

一、胰島移植

（一）人胰島移植

20世紀(jì)70年代，胰島分離和純化技術(shù)的出現(xiàn)使胰島移植從基礎(chǔ)研究進展到臨床階段，并使1型糖尿病的細胞治療成為現(xiàn)實。2012年胰島移植登記處（collaborative islet transplant，CIT）的數(shù)據(jù)顯示，677例接收胰島移植（單獨或聯(lián)合腎移植）的患者，3年后（2007年至2010年）有44﹪的患者脫離胰島素治療，60﹪的患者維持糖化血紅蛋白低于6.5﹪，只有48﹪的患者需要胰島細胞再移植治療[3]。在針對此研究的回顧性分析總結(jié)出對臨床結(jié)果起決定性作用的是胰島細胞分離純化技術(shù)、體外灌注技術(shù)及免疫抑制方案的改善，而不是輸注的胰島當(dāng)量（islet equivalent quantity，IEQs）的變化。

胰島移植的必要條件是極其復(fù)雜的，免疫抑制方案的不斷優(yōu)化，顯著改善了胰島移植的預(yù)后。大量研究表明[4-7]，胰島移植物更易遭受CD8+T細胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，活化的CD8+T細胞可通過多種途徑殺傷胰島移植物。靶向殺傷免疫細胞是一種新的抗胰島排斥反應(yīng)治療策略，主張在不干擾正常免疫功能的情況下實現(xiàn)抗胰島移植排斥反應(yīng)。在CIT-07研究中對48例1型糖尿病患者給予胰島移植的同時（3次輸注，中位數(shù)11 476 IEQ/kg），聯(lián)合西羅莫司，兔抗胸腺細胞球蛋白，依那西普和他克莫司+西羅莫司的維持治療[8]，患者在行移植術(shù)2年后仍具有80﹪的移植物功能，并改善了血糖水平及生活質(zhì)量。Inverardi等[9]將粒細胞集落刺激因子和艾塞那肽與經(jīng)典免疫抑制藥物（他克莫司，西羅莫司，依那西普，賽尼哌）相結(jié)合來治療移植后的免疫反應(yīng)，此法可使70﹪的患者移植物功能延長至4 500 d。

移植物的長期存活，還決定于術(shù)中胰島細胞團所引起的急性凝血反應(yīng)及術(shù)后局部血供。最近的研究集中在對胰島移植原位血管的改進。2015年，Pepper等[10]在小鼠皮下植入一個尼龍導(dǎo)管，以促進新生血管網(wǎng)形成，并將其作為移植胰島的環(huán)境。也有研究嘗試使用血管內(nèi)皮生長因子提高移植部位胰島血管化[11-12]。微囊化是由Boettler和他的同事提出的一個免疫隔離裝置，既實現(xiàn)免疫隔離，同時又允許胰島素和葡萄糖分子通過。但由于半透膜技術(shù)的不完善，使胰島出現(xiàn)相對缺氧狀態(tài)及血運重建緩慢，在功能上難以實現(xiàn)平穩(wěn)的血糖控制[13]。

目前胰島移植仍面臨許多困境：尸體供體短缺，往往需要兩三個胰腺才能獲得移植時充足的IEQs供應(yīng)（2×106β細胞/kg）和移植后血糖控制，終身免疫抑制治療和胰島移植物的存活依賴于門靜脈提供高效的能量與氧氣交換技術(shù)的瓶頸。所以目前胰島組織的冷凍保存也是一個值得關(guān)注的問題，最新的數(shù)據(jù)顯示[14]通過冷凍保存20年后，人類胰島細胞能保持原有的純度，鈣離子水平和葡萄糖刺激的胰島素分泌（glucose-stimulated insulin secretion，GSIS）與新鮮分離的胰島相比降低了胰島素含量，從而在小鼠模型中對逆轉(zhuǎn)糖尿病能力存在負(fù)面影響。

（二）豬胰島移植

豬作為細胞治療的重要來源具有許多優(yōu)點：供應(yīng)量大，胰島制劑純度高以及該技術(shù)已在非人類靈長類動物中得到證實[15-16]。2016年ADA年會，David教授[17]提出使用轉(zhuǎn)基因動物既減少了人畜共患病，又可以克服免疫抑制療法和微囊化技術(shù)的缺陷，這也是人類通過對供體塑造改善移植預(yù)后的首次嘗試。動物研究曾證實豬胰島移植聯(lián)合抗免疫抑制治療的可行性，實驗將鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）處理的恒河猴給予成年豬胰島移植并聯(lián)合眼鏡蛇毒因子、抗胸腺細胞球蛋白、抗CD154單克隆抗體及低劑量西羅莫司治療后，血糖維持正常水平可達6個月以上，且無嚴(yán)重不良影響。

豬胰島細胞移植到人體內(nèi)長期存活的實例已被數(shù)次證實：1996年1例41歲的T1DM患者移植了豬胰島細胞后，能有效改善血糖水平，且10年后利用腹腔鏡技術(shù)在其網(wǎng)膜上觀察到存活并有功能的豬胰島細胞[18]。2007年，在俄羅斯進行的1項研究針對8例T1DM患者給予微囊化豬胰島移植（DIABECELL，5 000～10 000 IEQ/kg/劑量，共3次）的觀察，6例患者改善了血糖、糖化血紅蛋白水平，并減少了胰島素用量，2例患者脫離胰島素治療長達32周，且沒有嚴(yán)重的不良事件發(fā)生（包括豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染）。在新西蘭（NCT00940173），16例糖尿病自身抗體陽性的T1DM患者接受不同量的胰島細胞移植（從5 000～20 000 IEQ/kg），觀察52周后，患者無意識低血糖發(fā)作的數(shù)量減少、糖化血紅蛋白下降且日均胰島素需要量也減少。移植耐受性好且患者自覺生活質(zhì)量得到了改善。另一個類似的研究開展于阿根廷（NCT01739829），從研究中也能觀察到移植后患者糖化血紅蛋白水平降低（從8.6﹪到6.7﹪），胰島素需要量減少（減低了20﹪的日劑量）并且減少了無意識的低血糖發(fā)生次數(shù)（減少了70﹪）。雖然只有少數(shù)患者可以停用胰島素，但證明了微囊化移植豬胰島細胞裝置在人體中使用的安全性和有效性。

二、多能干細胞

（一）胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）

多能干細胞能重新編程以獲得β細胞樣功能，其有利于細胞替代方法的優(yōu)勢在于：表型特征的建立，應(yīng)用廣泛，高擴增和分化潛能。21世紀(jì)初，第一次證實ESCs具有變?yōu)镚SIS物質(zhì)的能力，在特定的培養(yǎng)條件和分子方法下可實現(xiàn)分化。Kroon等[19]和D'amour等[20]逐步在體外試驗中發(fā)現(xiàn)將干細胞植入糖耐量正常的SCID小鼠后能轉(zhuǎn)化為β樣細胞，給予STZ處理移植后小鼠，血糖水平能保持在正常范圍反映了ESCs來源的β樣細胞的GSIS接近移植人胰島的水平。然而，體內(nèi)實驗[21]發(fā)現(xiàn)ESCs有形成畸胎瘤的傾向，它的機制可能為移植未分化的ESCs導(dǎo)致擴增細胞亞群染色體異常促進癌癥發(fā)生[22]。到現(xiàn)在為止，選擇ESCs進行改善內(nèi)分泌激素或β樣細胞的移植可行性尚不確定，問題在于極低數(shù)量的多能干細胞可能導(dǎo)致腫瘤形成以及大量β細胞選擇和純化技術(shù)的不成熟?？紤]到這些問題，ViaCyte公司開發(fā)了膠囊系統(tǒng)，在此胰腺祖細胞來源的ESCs能在皮下移植后成熟為有功能的β樣細胞，現(xiàn)在這項技術(shù)已應(yīng)用于臨床，試驗結(jié)果尚待公布。

ESCs大量分化為β樣細胞譜系的技術(shù)也在逐步改善中。2012年，Rezania等[23]概括了內(nèi)分泌標(biāo)志物的功能，通過一個四步法技術(shù)，獲得人類ESCs，其中包括98﹪PDX1+ 細胞，50﹪胰腺內(nèi)胚層細胞（NKX6.1+ / PDX1+），12﹪胰島素+細胞，19﹪胰高血糖素+細胞和70﹪H1細胞。給予糖尿病小鼠移植3個月后，移植物能在移植后4～5個月維持血糖水平正常。然而，50﹪的大鼠出現(xiàn)畸胎瘤（骨和軟骨），充分表明低比例的PDX1?細胞影響了機體的無序生長和分化。所以，同一研究組又進一步改進了四步法分化技術(shù)，以限制人ESCs來源的內(nèi)分泌細胞移植后的致瘤問題[24]。對技術(shù)的修改（單細胞播種H1細胞，在1～2階段添加培養(yǎng)液，增加蛋白激酶活性劑的濃度，和第4階段降低ALK5抑制劑濃度）沒有提高更多的分化率（如培養(yǎng)14 d后90﹪PDX1+，50﹪NKX6.1+和20﹪內(nèi)分泌細胞），但在移植21周后減少了非內(nèi)胚層組織的比例（下降到1/74）。在體外，新技術(shù)方法使第4階段非胰腺細胞基因的表達（例如：OCT4，aFP）及β細胞標(biāo)記物（包括胰島素、NKX2.2、NEUROD1、CHGA）降低了，并且使糖尿病小鼠移植后3個月內(nèi)移植物功能正常，改善血糖水平及C肽分泌。Rezania等[25]和Pagliuca等[26]兩個團隊也分別進行了體外研究，應(yīng)用不同的程序方法對人多能干細胞移植后葡萄糖敏感GSIS水平與人自身β細胞的功能進行比較，但目前這些β樣細胞能否逆轉(zhuǎn)高血糖，以及對移植物長期的組織學(xué)影響情況還不清楚。

盡管相關(guān)研究表明ESCs移植后可逆轉(zhuǎn)糖尿病，但仍有幾個應(yīng)用難點，如倫理上胚胎細胞的采樣和細胞重新編碼的缺陷，如不同的ESCs細胞再生分化的差異性，不適當(dāng)?shù)母渭毎麡庸δ?，在體內(nèi)不能再生復(fù)制的問題。人ESCs來源的β樣細胞免疫隔離技術(shù)已成功在同源免疫缺陷動物模型上使用，但長期分化表達的情況還不確定。誘導(dǎo)多能干細胞可以依據(jù)編碼需求同化為ESCs，但其生產(chǎn)成本和對其積累表觀遺傳的關(guān)注或編碼異常仍是其使用的關(guān)注方向[27-28]。大型動物研究（例如，非人類靈長類動物）和正在進行的臨床試驗將進一步明確上述問題并確認(rèn)小鼠模型中累積的數(shù)據(jù)。

（二）間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）

MSCs起源于中胚層，是成體干細胞的一種，具有以下特征：（1）取材方便簡單，人體取材時對健康無損害；（2）易于分離和體外傳代培養(yǎng)，擴增潛力強并具有很高的基因穩(wěn)定性；（3）移植后免疫反應(yīng)低，無成瘤性；（4）無倫理學(xué)爭議。因此，MSCs被認(rèn)為是可用于臨床細胞學(xué)治療的理想種子細胞。母義明等將骨髓來源MSCs注射進T2DM鼠體內(nèi)，通過免疫印跡法測定出在其骨骼肌、肝臟、脂肪組織內(nèi)，磷酸化的胰島素受體底物-1及蛋白激酶B明顯上升，其血糖也得到控制，提示 MSCs 能在外周組織中減輕胰島素抵抗[29]。MSCs還可通過使用誘導(dǎo)試劑（如煙酰胺、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子等）或與胰腺組織共培養(yǎng)皆能成功將MSCs誘導(dǎo)為胰島素分泌細胞。而且MSCs能釋放一些免疫調(diào)節(jié)相關(guān)因子，如IFN-γ、轉(zhuǎn)化生長因子-β、IL-4、IL-10等，減輕因自身免疫性破壞而導(dǎo)致的β細胞減少，從而保護新生及殘余的β細胞[30]。在由STZ誘導(dǎo)的T1DM 動物實驗中，MSCs能分化成GSIS細胞，并以血糖依賴性釋放胰島素的方式控制高血糖及改善糖尿病癥狀[31]。

雖然MSCs在糖尿病及糖尿病并發(fā)癥治療方面得到了越來越多的證實，且大量學(xué)者致力于其改善臨床癥狀的機制研究，但其誘導(dǎo)分化條件以及定向誘導(dǎo)分化的調(diào)控機制還不是很清楚。目前亟待解決的重要問題包括：尋找更好的純化方法和簡便準(zhǔn)確的鑒定方法，在增殖的同時保持其多向分化潛能，促進目的細胞的組織特異性整合和功能發(fā)揮，進一步提高MSCs在損傷部位的存活及修復(fù)等等。

三、胰腺內(nèi)的體細胞

目前，關(guān)于胰腺內(nèi)是否有存活干細胞還不太清楚，但胰腺本身確實具有損傷后的外分泌功能再生以及部分細胞成分具有可塑性或β細胞轉(zhuǎn)分化的能力[32]。

（一）β細胞

β細胞復(fù)制是目前最直接的方法用以恢復(fù)胰島素產(chǎn)生細胞的質(zhì)量，現(xiàn)有相關(guān)研究也集中在這個方面，希望能尋找到有效的體內(nèi)治療方法[33]。上皮β細胞缺乏在體外有絲分裂的活性，但可以通過表型轉(zhuǎn)變來實現(xiàn)擴展。Efrat團隊在不同但卻特定的條件下生產(chǎn)出的高增殖β細胞衍生物可逆轉(zhuǎn)STZ處理的NOD-SCID小鼠的高糖毒性[34]。

人類胰島也被叫做胰源性祖細胞（pancreatic-derived multipotent precursors，PMPs），它可在體外分離并于克隆的條件下進行轉(zhuǎn)分化。這些PMPs移植后能產(chǎn)生足夠的胰島素來穩(wěn)定STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD-SCID小鼠的血糖水平[35]，效果類似于人類胰島。此外，PMPs的 glut2low表型能讓他們在STZ處理后的小鼠和人類胰島中擴增，且“激活”的PMPs能增強β細胞分化潛力[36]。這些前期研究對大規(guī)模生產(chǎn)PMPs是至關(guān)重要的，但仍需要在移植模型中進一步證實這些前體細胞的潛力。

（二）α細胞

α-β細胞的轉(zhuǎn)分化也是目前關(guān)注的焦點。Collombat等[37]對STZ處理的轉(zhuǎn)基因小鼠給予胰高血糖素表達的α細胞后能改善β細胞功能。Thorel 等[38]通過白喉毒素?fù)p傷幾乎99﹪的β細胞后引發(fā)α細胞的大量產(chǎn)生以及α-β細胞的重組，這與Collombat的研究結(jié)果[37]相一致。但在嚴(yán)重的胰島細胞損失的模型中卻沒有發(fā)現(xiàn)α細胞的這種自發(fā)傾向[39]。Collombat團隊還對ArxKO糖尿病小鼠持續(xù)α細胞補充來觀察血糖恢復(fù)情況，通過抑制Arx來代替過表達Pax4，這項基于GABA或GABA受體激動劑的模型方法，開辟了新的治療途徑。但目前關(guān)于向β細胞轉(zhuǎn)化的機制是否有年齡依賴性以及其是否依賴部分其他亞型（如：δ細胞）[40]的爭論仍然存在。

雖然α-β細胞的重組在體外被得到證實，但體內(nèi)α-β細胞的轉(zhuǎn)分化和α-β細胞的新生仍是值得進一步探究的。

（三）腺泡細胞

Zhou等[41]人研究發(fā)現(xiàn)腺泡細胞作為胰腺的主要細胞在關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Ngn3，Pdx1和MafA的過表達情況下能形成新的β細胞。腺病毒介導(dǎo)的重組足以使腺泡細胞向功能性胰島素產(chǎn)生的細胞轉(zhuǎn)化，且能夠在一周內(nèi)完全恢復(fù)STZ誘導(dǎo)的Rag1-/-糖尿病小鼠模型的高血糖。且同組研究人員還使用一個多順反子攜帶三個轉(zhuǎn)錄因子來提高腺泡細胞重組的效率[42]，并能長期維持血糖正常。

為避免腺病毒結(jié)構(gòu)和多轉(zhuǎn)錄因子的使用，Heimberg團隊研發(fā)了一個對四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠通過腹膜滲透泵輸注細胞因子（表皮生長因子與神經(jīng)營養(yǎng)因子）的系統(tǒng)[43]，該系統(tǒng)輸注后65﹪的動物胰島素水平升高，而此舉對STZ處理的小鼠反應(yīng)欠佳。譜系追蹤顯示在細胞因子誘導(dǎo)后，腺泡細胞起源的新形成的β細胞能在擴增前轉(zhuǎn)變?yōu)镹gn3+表型并于5 d后使血糖標(biāo)準(zhǔn)化。這對于改善β細胞功能來說是一個重大的突破，但需更多研究來明確“脫靶”表皮生長因子的影響，特別是與腫瘤的相關(guān)性。

腺泡細胞被認(rèn)為是可被操控的能轉(zhuǎn)化為β細胞的胰腺祖細胞，而人類腺泡細胞體外擴增仍然是繁瑣的且有自發(fā)表型的轉(zhuǎn)變[44]。

（四）導(dǎo)管細胞

導(dǎo)管細胞是胚胎胰腺內(nèi)分泌和外分泌的祖細胞[45-46]，但他們在出生后作為兼性干細胞對β細胞再生的作用尚具爭議[47]。譜系追蹤通過對HNF1β+和SOX9+細胞的觀察推斷導(dǎo)管細胞對改善β細胞質(zhì)量無明顯作用[48]。然而既往的研究中發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管細胞能產(chǎn)生新的α細胞?；蛘T導(dǎo)的缺陷型α細胞能轉(zhuǎn)變?yōu)棣录毎诉^程猶如促發(fā)了導(dǎo)管細胞向α細胞轉(zhuǎn)化的開關(guān)。

此外，導(dǎo)管細胞在純化，培養(yǎng)和運輸?shù)确矫婢哂休^強的優(yōu)勢。一些研究證實了通過特定的膜蛋白對導(dǎo)管細胞進行分類的可能性[49]和其向β細胞分化的潛能，但是在體外導(dǎo)管細胞缺乏持續(xù)性增殖和易迅速失去表型的特性[50]。基于此，Lysy等[51]研究通過對人類CA19-9+導(dǎo)管細胞部分上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使其大規(guī)模擴增22倍，并于1個月后收集培養(yǎng)了1 011細胞[52]，這些人導(dǎo)管源性細胞暴露于特定生長因子及小分子環(huán)境下，14 d內(nèi)即具有特異性的β細胞特征（包括GSIS）。此外，人導(dǎo)管源性細胞能抑制克隆的擴增和干細胞標(biāo)記的表達，解決了移植后無節(jié)制增長的顧慮。進一步的研究要在糖尿病動物模型中開展，以觀察人導(dǎo)管源性細胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為有活性的β細胞的能力。

自人類胰島移植開始，大量的基礎(chǔ)和臨床工作已經(jīng)將細胞治療糖尿病由理論變?yōu)榱爽F(xiàn)實。但人類胰島移植仍然是唯一的器官組織用以改善患者的胰島功能，可惜的是目前仍受到供體短缺和長期免疫抑制劑治療的困擾。豬胰島移植是目前關(guān)注的異種異體胰島移植的熱點，但需消除移植后的安全隱患并利用微囊化技術(shù)提供持續(xù)的胰島功能。部分團隊致力于多能干細胞治療糖尿病的領(lǐng)域，通過大鼠研究已證實了其治療潛能，目前正在進行的臨床試驗，將進一步揭示其安全和治療的可行性問題。最后，胰腺的內(nèi)分泌和外分泌細胞具有潛在的治療可塑性，其可能作為兼性祖細胞為機體提供β細胞來源。

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Research progress of diabetes cell therapy

Liu Ying, Jiang Xia. Department of Endocrinology, the First Centre Hosipital, Tianjin 300192, China

Jiang Xia, Email:jiangxia9698@126.com

Diabetes cell therapy can restore β cell function and provides the possibility to cure diabetes. Islet transplantation can achieve stable blood sugar level and is well tolerated. It also improves blood sugar metabolism, prevent the development of complications, and improve the quality of life. But the scarcity of donor pancreas and the need for long-term immunosuppression make the researchers to seek solution from pluripotent stem cells（PSCs）, which have the potential to reverse diabetes in diabetic mice. However, safety is the Achilles' heel of PSCs. In recent years, pancreatic progenitor cells were shown to stimulate acini cells or α cells to differentiate into β cells, which can provide a new effective method for diabetes treatment.

Diabetes； Pancreas； Islet transplantation； Pluripotent stem cells；Cell transdifferentiation

2016-07-26）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.01.011

300192 天津市第一中心醫(yī)院內(nèi)分泌科

江霞，Email：jiangxia9698@126.com

劉英,江霞.糖尿病細胞治療的研究進展[J/CD].中華細胞與干細胞雜志（電子版）, 2017, 7(1):59-63.