劉小麗，石亞男，李 盼，陶苗苗，王詩語

（1.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心 安徽 阜陽 236037）

鈣離子處理對香椿種子萌發(fā)及生理特征的影響

劉小麗1，2*，石亞男1，李 盼1，陶苗苗1，王詩語1

（1.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心 安徽 阜陽 236037）

本實(shí)驗(yàn)以香椿（Toona sinensis）種子為材料，研究不同濃度的鈣離子對其種子萌發(fā)及生理特性的影響。研究的主要因素包括：種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等，以及在同樣的處理?xiàng)l件下，種子的過氧化物酶的活性、丙二醛的產(chǎn)生量、脯氨酸的積累量和種子浸出液的電導(dǎo)率等生理生化變化。結(jié)果表明：香椿對鈣離子具有最佳適應(yīng)濃度，在濃度為550 mg/L時生長情況最好，增加或者減少都將抑制香椿種子的發(fā)芽，且高濃度相對于低濃度對香椿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢的影響更大。

香椿；鈣離子；過氧化物酶；丙二醛；脯氨酸

香椿（Toona sincnsisRocm.）為楝科楝屬的多年生落葉喬木［1］，以嫩莖芽供食用。香椿嫩芽脆嫩多汁，具有濃郁的獨(dú)特香氣，蛋白質(zhì)和維生素C含量豐富，極具營養(yǎng)價值，而且樹皮、根皮、種子均為上品藥材［2］，經(jīng)濟(jì)價值極高。我國是唯一用香椿作為蔬菜的國家［3］，利用香椿種子可生產(chǎn)芽苗菜，生產(chǎn)效率更高，且不受季節(jié)限制，可全年生產(chǎn)，頗受生產(chǎn)者和消費(fèi)者歡迎［4］。

近年來香椿的研究主要集中在栽培技術(shù)，產(chǎn)品的開發(fā)，生長發(fā)育，藥理及病理等方面[5]。種子的活力是生產(chǎn)中的重要因素，受到其內(nèi)部生理?xiàng)l件的影響。過氧化物酶（POD）活性、脯氨酸含量、丙二醛（MDA）含量、浸出液電導(dǎo)率等，均與種子活力相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的鈣離子處理香椿種子，進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，檢測處理后的種子活力變化，同時檢測種子內(nèi)部生理指標(biāo)的變化，研究鈣離子影響種子活力的生理機(jī)制。研究優(yōu)化香椿種子活力的條件，為生產(chǎn)中提高香椿種子的發(fā)芽率以及培養(yǎng)壯苗奠定理論基礎(chǔ)，以提高香椿培植技術(shù)，實(shí)現(xiàn)香椿苗大規(guī)模生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 香椿種子

由安徽省阜陽師范學(xué)院抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心提供，種子在4℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)前將種子放在布袋中輕輕揉搓，然后吹去各種雜質(zhì)，挑選顆粒飽滿、無機(jī)械損傷的香椿種子放于鋁箔紙中低溫保存待用。

1.1.2 試劑

無水氯化鈣，蒸餾水，0.1%氯化汞溶液，20mmol/L磷酸二氫鉀，反應(yīng)混合液，冰醋酸，甲苯，3%磺基水楊酸，0.3 mol/L甘露醇，標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸溶液，三氯乙酸（TCA），酸性茚三酮試劑，硫代巴比妥酸(TBA)，石英砂。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

人工常溫氣候培養(yǎng)箱（LHP-250HE型），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，加濕器，溫濕度器，恒溫水浴鍋，電子精密天平，冰箱，紫外分光光度計(jì)，秒表，磁力攪拌器（78HW-1型），離心機(jī)，電導(dǎo)率儀，藥品冷藏柜，鋁箔紙袋，研缽，培養(yǎng)皿，容量瓶，移液器，錐形瓶以及各種其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)用具。

1.2 方法

1.2.1 種子處理

將香椿種子放入9個小燒杯中，加入氯化鈣溶液，濃度梯度為0 mg/L、150 mg/L、300 mg/L、450 mg/L、550 mg/L、650 mg/L、750 mg/L、900 mg/ L、1 050 mg/L。浸泡12 h之后倒掉溶液，去除種皮上的粘液，再次浸泡12 h。每個濃度設(shè)置3組重復(fù)。

1.2.2 過氧化物酶（POD）活性測定

測定香椿種子的過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚法［6］，以1mL KH2PO4與3mL反應(yīng)混合液作為空白。POD酶活性大小用△OD470/min·g表示。

1.2.3 丙二醛（MDA）產(chǎn)生量的測定

1.2.3.1 MDA的提取

分別稱取各個濃度鈣離子處理的香椿種子0.2 g加入2mL 10%TCA在研缽中研磨成漿，再加入8mL TCA研磨充分，4 000 r/min離心10 min，取上清液。

1.2.3.2 顯色反應(yīng)與測定

吸取2mL提取液，加入2mL 0.6%TBA，混勻，加蓋，沸水浴15 min,迅速冷卻離心。取上清液，在532 nm和450 nm處測定OD值。

1.2.4 脯氨酸積累量的測定

取各個鈣離子濃度溶液處理的香椿種子0.2 g，用3%磺基水楊酸5mL研磨成漿，分別放入10mL離心管中標(biāo)記。沸水浴10 min，冷卻后，3 000 r/min離心提取上清液待用。

用100 ug/mL脯氨酸配制成0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取2mL，加2mL 3%磺基水楊酸、2mL冰醋酸與4mL 2.5%酸性茚三酮在加塞的試管中，沸水浴1小時，冷卻加入4mL甲苯，于旋渦混合儀上震蕩30 s，靜置等待分層。依次吸取上層紅色甲苯在520 nm處酶標(biāo)儀中測定OD值，并繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取待用上清液2mL，分別加入2mL 3%磺基水楊酸，2mL冰醋酸和4mL 2.5%酸性茚三酮試劑。沸水浴1小時，加4mL甲苯，于漩渦混合儀上震蕩30 s，靜置分層完全后，取上清液測OD值。

1.2.5 電導(dǎo)率的測定

分別取不同濃度溶液處理的香椿種子各50粒，放入盛有50mL去離子水的小燒杯中，于25℃浸泡10 h后，過濾到干凈燒杯中，測定濾出溶液電導(dǎo)率。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣離子處理對香椿種子發(fā)芽的影響

用胚根長度達(dá)到種子直徑的二分之一為香椿種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)，在培養(yǎng)皿中的時間為初始時間，連續(xù)三天內(nèi)無發(fā)芽數(shù)增長為種子發(fā)芽完全。第五天計(jì)算發(fā)芽勢，第十天開始計(jì)算發(fā)芽率和相對種子鮮重，記錄發(fā)芽指數(shù)(GI),活力指數(shù)(VI)。

發(fā)芽率=第10天內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)除以供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽勢=第5天內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)除以供試種子數(shù)×100%；

GI=∑Gt/Dt（Gt：與Dt相對應(yīng)的每天發(fā)芽數(shù)，Dt：發(fā)芽日數(shù)）；

VI=GI×S（S：第十天發(fā)芽的香椿的相對平均鮮重（mg）[7]）。

由表1可知，不同濃度的鈣離子對香椿種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢影響是不相同的。以550 mg/L為峰值呈先升高后下降的趨勢。1 050 mg/L接近對照組數(shù)值，表明此濃度下對香椿種子的影響是微弱的或無影響。

表1 鈣離子處理對香椿種子發(fā)芽的影響

2.2 鈣離子處理對香椿種子發(fā)芽指數(shù)的影響

由圖1可以得出：香椿種子的發(fā)芽指數(shù)隨著鈣離子濃度的不同而不同。在濃度為150到550 mg/L時，發(fā)芽指數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢，且每組濃度的發(fā)芽指數(shù)均高于對照組；在濃度為550 mg/L時，達(dá)到最大值。超過最大值后，發(fā)芽指數(shù)呈現(xiàn)大幅度下降的趨勢，促進(jìn)作用逐步下降。當(dāng)濃度為1 050 mg/L時，發(fā)芽指數(shù)接近于對照組26.54，對種子的發(fā)芽指數(shù)無促進(jìn)作用。

圖1 鈣離子處理對香椿種子發(fā)芽指數(shù)的影響

2.3 鈣離子處理對香椿種子活力指數(shù)的影響

由表2可以得出：濃度為150到900 mg/L的鈣離子溶液對種子的鮮重均有促進(jìn)作用，且此濃度范圍內(nèi)的種子活力指數(shù)都高于對照組38.5。由此得出在150到900 mg/L的濃度對提高種子活力，都有促進(jìn)的作用。在濃度為150到550 mg/L之間，隨著濃度的增加，種子鮮重在增加，種子活力不斷提升，在濃度為550 mg/L時，種子鮮重和種子活力均達(dá)到最大值。超過這一范圍，種子鮮重和活力不斷下降。在濃度為1 050 mg/L時，種子鮮重和活力接近于對照組，幾乎無促進(jìn)作用。

表2 鈣離子處理對香椿種子活力指數(shù)的影響

2.4 鈣離子處理對香椿種子過氧化物酶（POD）活性的影響

過氧化物酶廣泛存在和分布于植物的各個組織及器官中，能夠催化很多生理生化反應(yīng)。在有過氧化氫的存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成呈茶褐色的物質(zhì)，該物質(zhì)在470 nm處有最大光吸收，因此可以利用分光光度計(jì)測量470 nm的吸光度的變化，從而測定出POD活性[8-9]。

由圖2可知從濃度為0 mg/L到550 mg/L香椿種子的過氧化物酶活性變化不大，但整體呈下降趨勢。550 mg/L濃度后到750 mg/L呈增加趨勢，且略明顯。750 mg/L后增加趨勢較大。與發(fā)芽勢及發(fā)芽率大致保持一致。

圖2 鈣離子處理對香椿種子POD活性的影響

2.5 鈣離子處理對香椿種子內(nèi)丙二醛的積累量的影響

植物細(xì)胞在逆境條件下會發(fā)生原生質(zhì)膜過氧化作用，丙二醛是產(chǎn)物之一，通常將其作為脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)[10]。

由圖3可知，隨著鈣離子濃度的變化，以550 mg/L為最低值，呈先下降后上升的趨勢，與發(fā)芽率發(fā)芽勢基本一致。表明在從低鈣離子濃度到高鈣離子濃度時，植物生長生理所受的外界影響是先脅迫到適宜再到脅迫的過程。丙二醛積累量在750 mg/L后增加明顯，表明高濃度鈣離子對香椿發(fā)芽生理影響較低濃度時大。

圖3 鈣離子處理對香椿種子內(nèi)丙二醛的積累量的影響

2.6 鈣離子處理對香椿種子內(nèi)脯氨酸的積累量的影響

在適宜的環(huán)境條件下,植物體內(nèi)游離脯氨酸含量較低。遇到逆境條件時,尤其是干旱、水淹、鹽漬等環(huán)境下,植物體內(nèi)游離脯氨酸含量將明顯增加。脯氨酸親水性極強(qiáng),對于調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡、保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、防止?jié)B透脅迫對植物造成傷害等方面具有極其重要的作用。

由圖4可知，實(shí)驗(yàn)測定脯氨酸積累量與香椿的發(fā)芽率發(fā)芽勢一致。保持先下降至550 mg/L后上升的趨勢。

圖4 鈣離子處理對香椿種子內(nèi)脯氨酸的積累量的影響

2.7 鈣離子處理對香椿種子電導(dǎo)率的影響

由圖5可知，0到550 mg/L電導(dǎo)率呈下降趨勢，550 mg/L到1 050 mg/L呈上升趨勢。原因可能有兩個方面：一方面適宜的鈣離子濃度能夠維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，胞膜完整仍具有選擇透過性，因此電導(dǎo)率較低。適宜的鈣離子濃度提高了物質(zhì)運(yùn)輸?shù)男剩瓜愦环N子代謝速率增強(qiáng)：從而提高了發(fā)芽率和發(fā)芽勢。另外一方面，胞膜的選擇透過性并不是無限的，當(dāng)離子濃度過高，胞膜完整性破壞，選擇透過性消失，細(xì)胞破裂，溶質(zhì)滲出，電導(dǎo)率升高。因此電導(dǎo)率可作為衡量細(xì)胞完整性高低的指標(biāo)。

3 討論

3.1 不同濃度的鈣離子對香椿萌發(fā)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，香椿對鈣離子有最佳適應(yīng)濃度，在濃度為550 mg/L時生長情況最好。濃度增加或者減少都將抑制香椿種子的發(fā)芽。本次實(shí)驗(yàn)并未出現(xiàn)處理的種子不發(fā)芽現(xiàn)象，0到550 mg/L時鈣離子對香椿的萌發(fā)有影響，但相對于550 mg/ L到1 050 mg/L時的影響較小。表明香椿種子對鈣離子有一定的耐受性，高濃度對香椿種子發(fā)芽影響較大。實(shí)際種植香椿過程中，應(yīng)使鈣離子濃度保持在最適濃度或之下。

圖5 鈣離子處理對香椿種子電導(dǎo)率的影響

3.2 不同濃度鈣離子對香椿種子生理特性的影響

在盡量排除實(shí)驗(yàn)過程的人為和實(shí)驗(yàn)儀器的誤差條件下，測得的各項(xiàng)生理特性數(shù)據(jù)和香椿的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性。表明，鈣離子影響種子的生理生化特性，進(jìn)而影響種子的活力，表現(xiàn)在萌發(fā)情況的變化。在550 mg/L濃度下，各項(xiàng)生理指標(biāo)都是最佳，種子活力最好。因此，想要提升香椿的發(fā)芽率提高效益，應(yīng)盡可能控制鈣離子為最適濃度或以下。

鈣離子對生長發(fā)育有著重要的作用，鈣離子不足，會影響細(xì)胞的正常生理活動，過多，細(xì)胞會通過一定的機(jī)制把鈣離子排除。適宜的濃度對維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定，信息的傳遞，穩(wěn)固作物品質(zhì)都起著重要的作用。

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Effects of calcium ion treatment on seed germination and physiological characteristics of Toona sinensis

LIU Xiao-li1，2*，SHI Ya-nan1，LI Pan1，TAO Miao-miao1，WANG Shi-yu1
(1.School of Biology and Food Engineering,Fuyang Normal University,Fuyang Anhui236037,China;2.Engineering Technology Research Center of Anti-aging Chinese Herbal Medicine of Anhui Province,Fuyang Anhui236037,China)

To study the effects of different concentrations of calcium ions on seed germination and physiological characteristics,the Chinese toon(Toona sinensis)seed was used as material in the experiment.The main factors included：seed germination rate,germination potential,germination index,vigor index,and under the same treatment conditions,biochemical changes of peroxidase activity,malondialdehyde production,proline accumulation and conductivity of seed leaching solution.The results showed that Toona sinensis had the best ability to adapt a concentration of calcium ion.It grew best at the concentration of 550 mg/L.Increasing or decreasing the concentration inhibited the Toona sinensis seed germination.A high concentration affected the Toona sinensis seed germination rate and germination potential greater than the low concentration did.

Toona sinensis;calcium ion;peroxidase;malondialdehyde;proline

Q-945.4

：A

：1004-4329（2016）04-053-05

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329(2016)04-053-05

2016-08-20

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2016A872，KJ2016A871）；大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201510371059）資助。

劉小麗（1967- ），女，博士，副教授，研究方向：生藥學(xué)。Email：liu_x_l2002@sina.com