張慶奎 劉若卓 于生元△

(1中國人民解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內科，北京 100853；2中國人民解放軍總醫(yī)院海南分院神經(jīng)內科，三亞 572013)

·綜 述·

瞬時受體通道V1生理特性研究進展*

張慶奎1劉若卓2△于生元1△

(1中國人民解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內科，北京 100853；2中國人民解放軍總醫(yī)院海南分院神經(jīng)內科，三亞 572013)

瞬時受體電位香草酸亞型1 (transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1) 屬于TRP (transient receptor potential) 家族,主要分布在哺乳動物C類神經(jīng)纖維，對多種理化、溫度、機械刺激敏感。TRPV1是一種非選擇性陽離子通道，并對鈣離子具有高通透性，與配體結合后激活，導致鈣離子等內流，細胞內鈣離子增加，進而引起一系列細胞內生理性或病理性反應，最終在疼痛等病理機制中發(fā)揮關鍵作用。 本文就TRPV1通道結構、激活物及通透性，通道影響因素及其脫敏現(xiàn)象等予以綜述，探究TRPV1通道研究的最新進展。

瞬時受體電位香草酸亞型1；疼痛；中樞敏化；癢覺

哺乳動物感應有害刺激的主要傳入神經(jīng)元大部分屬于C類多功能傷害感受器。 它們對多種類型的刺激敏感，包括辣椒素(統(tǒng)稱為香草酸)類化學物質、傷害性熱刺激 ( ＞ 42℃) 和中度至高強度的機械刺激。此類神經(jīng)元對香草酸膜反應的系列研究表明，這些化合物通過打開特定非選擇性陽離子通道發(fā)揮作用。強效的香草酸激動劑樹脂毒素 (resiniferatoxin)與背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞膜的特異性結合以及競爭性的香草酸拮抗劑辣椒平(capsazepine) 1992年的發(fā)現(xiàn)，證明了特定受體的存在，1997年該受體被克隆并命名為香草酸受體亞型1 (vanilloid receptor 1,VR1)，2002年被正式更名為TRPV1[1]。

TRPV1屬于TRP家族，TRPV1受體可能是TRP家族當前研究最為充分的一員，其在疼痛生理學和藥理學中的重要角色使它成為研究TRP家族的代表[2]。它是一種非選擇性陽離子通道，且對鈣離子具有高通透性，與配體結合后激活，導致鈣離子等內流，細胞內鈣離子增加，進而引起一系列細胞內生理性或病理性反應，包括熱和化學感應、神經(jīng)源性炎癥、神經(jīng)介質釋放的突觸前調節(jié)以及癢覺等[3]。

1.TRPV1的結構

TRPV1在1997年首次被成功克隆，屬于TRP家族，它們的蛋白結構基本類似，都是四聚體結構，其中每個亞基具有6次跨膜螺旋 (S1-S6) 和較短的孔形螺旋 (pore helix)。與電壓門控離子通道如Kv1.2類似，每個亞基的跨膜螺旋形成兩個不同的“束”。從頂部觀察，S1-S4組成的“束”位于通道的周邊，S5-S6組成的“束”形成中心的離子滲透通道即孔形結構 (pore domain)。N端和C端均位于胞質側，其中N端包含六個錨蛋白重復序列[4]。近年來隨著冷凍電子顯微鏡 (cryoelectron microscopy, cryoEM) 技術的發(fā)展，實現(xiàn)了對大蛋白質復合物原子水平的3D重建，但對于TRP通道等較小的膜蛋白仍處于較低分辨率水平[5]。Liao等(2013) 通過改進cryoEM技術，得到了TRPV1通道3.4 ?分辨率的3D重建圖像。TRPV1由類似電壓門控鈉鉀通道的的四聚體組成。每個亞基由六個跨膜α-螺旋 (S1-S6) 和P環(huán)螺旋 (P-loop helix) 組成。四個亞基呈圓錐狀構象，S5和S6以及P環(huán)構成通道的中心孔，其側面是由S1-S4形成的類電壓傳感器狀結構。通過比較激活與未激活狀態(tài)TRPV1冷凍電鏡下的構型變化，Erhu Cao (2013年)發(fā)現(xiàn)孔型結構內存在兩個門控部位。上方門控靠近胞外，是開口呈“口袋型”的選擇性濾器 (selectivity fi lter),殘基G643-D646構成孔的內壁。在選擇性濾器下面，即靠近胞質側，通道通向一個充水腔，下方門控即靠近胞內的S6疏水區(qū)域將充水腔與細胞液隔離。TRPV1的開放與上方門控構型重組和下方門控顯著擴張相關，提示激活的雙門控機制[6～8]。

2.TRPV1通道激活物

TRPV1是一個對熱和多種化學物質敏感的通道，對許多傷害性刺激均可產(chǎn)生反應，如辣椒素、傷害性熱刺激 ( ＞ 42℃)、電壓、酸性pH和一些脂質代謝產(chǎn)物 (類花生酸、大麻素、N-花生四烯酰多巴胺、油酰乙醇胺)，近些年來又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)對某些生物毒素 (狼蛛毒素、蜈蚣毒素等)、二價金屬離子(Mg2+和Ba2+) 敏感。這些傷害性刺激均可通過別構調節(jié)激活TRPV1通道，不同的配體存在不同的結合位點，如質子和生物毒素是結合到位于胞外的孔形結構，而辣椒素結合到孔型結構的跨膜區(qū)域—辣椒素結合位點 (vanilloid binding site, VBS)[9]。盡管不同刺激物的結合位點各不相同，但它們均可以通過某種途徑激活離子通道。CryoEM技術實現(xiàn)了精確定位辣椒素等刺激物與TRPV1的結合位點，但其與相應位點的結合方式和結合后激活機制仍待進一步研究。

3.TRPV1通道離子通透性

通透性是離子通道的重要特性，通透性的改變Mg2+與2+眾多病理狀態(tài)相關。TRPV1通道為非選擇性陽離子通道，對單價陽離子通透性基本相似，但對二價陽離子通透性存在差異 (通透性：Ca2+＞Mg2+＞ Na+≈ K+≈ Cs+)。人胚腎 (Human Embryonic Kidney, HEK) 細胞轉染的TRPV1通道對鈣離子有非常高的相對滲透率(辣椒素激活情況下通透性比值：PCa/PNa= 9.60; PMg/PNa= 4.99)，超過大多數(shù)非選擇性陽離子通道，與NMDA型谷氨酸受體和α7煙堿乙酰膽堿受體報告的值相似[4]。Tominaga (1998)發(fā)現(xiàn)HEK細胞轉染的TRPV1通道熱刺激激活時PCa/PNa為3.8，明顯低于先前報道辣椒素激活時的數(shù)據(jù)[10]。Nagy (1999) 先后研究了大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上的TRPV1通道分別在辣椒素和傷害性熱刺激作用下的離子通透性，發(fā)現(xiàn)熱刺激時鈣離子通透性低于辣椒素刺激 (PCa/PNa分別為0.9、1.9)[11]。

Zeilhofer (1997) 應用鈣指示劑和膜片鉗技術得出TRPV1通道開放時鈣電流占全細胞電流比例(Pf)，發(fā)現(xiàn)Pf值與刺激物種類、細胞外鈣離子濃度相關，辣椒素作用下Pf值為4.3%，酸性溶液刺激時Pf明顯低于辣椒素刺激，隨著pH值逐漸增加Pf值相應升高 (pH值為5.1、5.6、6.1時，Pf分別為1.65%、2.12%、2.38%)，此外細胞外鈣離子濃度增加Pf也成增加趨勢。Zeilhofer據(jù)此推測辣椒素和氫離子刺激的是不同的離子通道[12]。Damien (2008)同樣觀察到鈣電流受激活方式的調節(jié)，生理條件下氫離子激活鈣電流的Pf值 (6.6%) 顯著低于辣椒素激活鈣電流的Pf值 (9.9%)。運用定點突變技術，Damien發(fā)現(xiàn)Pf值降低是位于孔形結構開口處的三個氨基酸殘基 (Asp646、Glu648和Glu651) 質子化后，負電荷被中和所致，而非Zeilhofer所認為的不同離子通道激活[3]。

基于戈德曼 (Goldman–Hodgkin–Katz, GHK) 恒定電場方程計算出電流的翻轉電位 (current reversal potentials)，結合細胞內鈣指示劑 (fura-2)，可計算得出鈣離子的相對滲透性PCa/PNa，研究者(2008)發(fā)現(xiàn)鈣離子的相對通透性并非恒定，與時間呈相關性[3,13]。事實上GHK模型的應用存在一定限制，其中跨膜相對離子濃度必須已知，但是因為細胞內鈣指示劑存在飽和現(xiàn)象，尤其是接近細胞膜的細胞液，鈣離子濃度變化測定可能存在偏差。Damien和Evan (2016) 認為基于此得來的PCa/PNa存在誤差，然后他們通過相應的校正后，測定辣椒素持續(xù)激活下的TRPV1通道，得出了不同于以往的結論，即鈣Pf值和PCa/PNa均保持恒定。[14]這提示我們在今后鈣離子通道研究時，特別是針對具有較大電流密度的Ca2+高通透型離子通道，需要考慮到流入細胞的Ca2+可能并不能被指示劑很快完全緩沖，鈣Pf值和PCa/PNa也可因此被低估。

TRPV1通道對大分子陽離子同樣通透，如胍鹽、葡萄糖胺 (N-methyl-D-glucamine, NMDG)、碘化丙啶染色劑YO-PRO1、苯乙烯基染料FM1-43、慶大霉素等。隨著離子通道的持續(xù)激活，上述大分子陽離子通透性升高，研究者認為其機制可能與孔形結構擴張 (pore dilation) 相關，而非另外的特異離子通道開放[13,14]。Clare (2015) 通過比較TRPV1通道孔形結構上的多個殘基突變型，對大分子陽離子通透性的差異，發(fā)現(xiàn)孔形結構幾個特定位點上的側鏈相互作用與其離子選擇性相關。關于這些突變型對生理相關更為密切的離子如Ca2+的通透性影響如何仍待進一步研究[15]。

4.TRPV1通道的調節(jié)因素

（1）離子對TRPV1的調節(jié)

TRPV1通道的調節(jié)相當復雜，調節(jié)因素眾多。其不同激活物之間也相互影響，例如Ca2+、Mg2+低濃度時促進離子通道開放，高濃度時可直接開放離子通道[10]，辣椒素、氫離子和熱等可致通道對電壓敏感[16]。Ohta (2008)發(fā)現(xiàn)細胞外鈉離子在室溫下可抑制TRPV1通道，提示其存在調控通道的鈉離子結合位點。Jara-Oseguera (2016)進一步證實了在室溫條件下，細胞外鈉離子與胞外孔型結構上的相關位點結合是穩(wěn)定TRPV1通道處于關閉狀態(tài)所必須，移去細胞外鈉離子可致離子通道開放。Jordt (2000)曾報道弱酸性溶液可增強熱對TRPV1的激活作用[17]。Jara-Oseguera 證實H+可使TRPV1通道酸性殘基質子化，引起Na+與相關位點的結合減少，間接激活通道。如此生理狀態(tài)下，Na+在調控TRPV1通道對熱和酸敏感性中起根本作用。不過胞外孔形結構的離子結合位點并非Na+高度選擇，細胞外液中加入K+、Rb+、Tris+、Cs+、Li+等均可產(chǎn)生同樣作用，其中K+幾乎與Na+等效[16]。該系列研究似乎與Ahern (2005) 的實驗結果存在矛盾，Ahern增加細胞外液Na+濃度50 mM后，觀察到由辣椒素激活的通道電流增加了3倍[10]。我們分析生理狀態(tài)下，細胞外鈉離子是構成滲透壓的重要成分，滲透壓過高或過低都會對機體形成傷害，TRPV1可能參與滲透壓的雙向調節(jié)。

氫離子對TRPV1通道的調節(jié)存在兩種完全相反的效應，除了為人熟知的通道激活作用外，氫離子同時可抑制通道的通透性。Lee和Zheng (2015)發(fā)現(xiàn)氫離子激活TRPV1離子通道后，移去氫離子可產(chǎn)生一過性的電流增強，振幅明顯高于之前，這種現(xiàn)象稱為撤光反應 (OFF response)[18]。組織缺血發(fā)生時細胞外液氫離子濃度升高，再灌注后氫離子濃度下降，可推測氫離子對TRPV1通道的這一特殊效應可能參與再灌注損傷。

（2）磷脂酶C (PLC)途徑對TRPV1的調節(jié)

PLC催化酰肌醇二磷酸 (PIP2) 分解產(chǎn)生三磷酸肌醇 (IP3) 和二酰甘油 (DAG) 兩個第二信使，是存在于胞漿膜上的一個關鍵酶。機體在受到損傷或炎癥時，免疫細胞和受損組織會釋放一系列促炎性介質，如緩激肽、ATP、前列腺素和趨化因子等，這些介質通過激活G蛋白偶聯(lián)受體激活PLC途徑[19]。目前PIP2對TRPV1通道發(fā)揮重要調控作用已得到廣泛認可，但是其效應是促進還是抑制激活仍存在爭議。最初全細胞(whole-cell) 膜片鉗技術實驗發(fā)現(xiàn)PIP2抑制TRPV1通道激活，應用PLC分解PIP2后可解除抑制[20]。之后一系列應用游離內膜向外式記錄的膜片鉗(excised inside-out patches)實驗證實，PIP2促進TRPV1激活，在細胞背景下TRPV1激活也需要內源性的PIP2。游離膜片TRPV1激活的去抑制提示PIP2為間接抑制，而對分離純化的TRPV1的激活抑制又提示其為直接抑制[21]。很明顯關于PIP2的調節(jié)作用及其機制仍有很多工作要做。

（3）TRPV1在細胞膜上運動性 (mobility) 調節(jié)

膜的流動鑲嵌模型說明細胞膜是一種動態(tài)的結構, 具有膜蛋白的運動性 (mobility) 和膜脂的流動性( fl uidity)。特異性信號分子可使相應受體蛋白在細胞膜表面移動，目前有關方面的實驗研究很少。已證實在Orai家族Ca2+釋放激活鈣離子通道 (Ca2+-release activated channels, CRAC) 信號轉導中，其通道的運動性調節(jié)發(fā)揮關鍵作用。CRAC在靜息細胞呈全細胞膜擴散，當內質網(wǎng)中鈣離子濃度降低，CRAC則反應性的在與內質網(wǎng)臨近的胞膜處聚集并激活[22]。Senning和Gordon (2015) 實驗發(fā)現(xiàn)靜息態(tài)的TRPV1在細胞表面自由移動，且運動性在細胞與細胞乃至通道與通道之間存在差異，在細胞外鈣離子存在的情況下施加辣椒素，可致TRPV1運動性明顯下降。他們據(jù)此推測TRPV1激活后的膜上反應與CRAC類似，即通過運動性調控使TRPV1在生理功能相對更為密切的胞膜區(qū)域聚集，從而發(fā)揮更為有效的作用[23]。有關TRPV1運動性的研究遠沒有CRAC充分，其激活后呈細胞外鈣離子依賴的運動性下降，這一機制仍待探索。

(4) TRPV1的轉位 (translocation) 調節(jié)

外周神經(jīng)元細胞膜TRPV1表達增加對炎癥性痛覺過敏 (hyperalgesia) 產(chǎn)生至關重要[24]。胞漿中的含TRPV1的囊泡以胞吐形式轉移到細胞膜，這一過程稱為轉位，蛋白激酶C (PKC) 激活即可引起功能型的TRPV1快速轉位，偏頭痛預防常用制劑肉毒素A可抑制PKC介導的此效應[25]。神經(jīng)生長因子等促炎性因子也可通過Srk激酶介導的通道酪氨酸磷酸化實現(xiàn)TRPV1轉位，增加其細胞膜表達[26]。

在肽能感受器上，TRPV1與主要的促炎性神經(jīng)肽降鈣素基因相關肽 (Calcitonin gene related peptide, CGRP) 和P物質共表達。這些神經(jīng)肽選擇性的存貯在大而具有致密中心的囊泡 (Large Dense-Core Vesicles, LDCVs)，感受器受到炎性刺激時LDCVs胞吐釋放，這一過程呈鈣依賴性，由SNARE介導[27]。Devesa(2014)利用雙重免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)α-CGRP陽性的LDCVs共表達TRPV1，進一步研究發(fā)現(xiàn)α-CGRP在ATP誘發(fā)的TRPV1轉位發(fā)揮不可或缺作用，在α-CGRP基因敲除小鼠ATP不能使TRPV1表達增加，且小鼠未出現(xiàn)痛覺過敏現(xiàn)象[28]。Mathivanan (2016) 發(fā)現(xiàn)緩激肽通過緩激肽B2受體發(fā)揮與ATP類似作用，應用胞吐特異性抑制劑DD04107顯著抑制緩激肽介導的受體上調[29]。Meng (2016) 證實TNFα誘發(fā)包含突觸相關膜蛋白1 (Vesicle-associated membrane protein 1, VAMP1) 的LDCVs胞吐增加，TRPV1和TRPA1膜表達共同上調，二者熒光染色密度均增加約3倍，這一效應可被肉毒素A抑制[30]。

由上可見，病理狀態(tài)下的傷害性刺激有單通道敏化和細胞敏化雙重層面的致痛覺敏化機制。單通道敏化表現(xiàn)為各類刺激物降低TRPV1對溫度、電壓等固有刺激的閾值，細胞敏化表現(xiàn)為通過LDCVs胞吐使TRPV1和TRPA1共轉位。細胞敏化過程中，TRPV1激活，鈣離子內流增加，導致鈣依賴性的LDCVs胞吐，進而CGRP釋放、TRPV1和TRPA1膜表達增加，此時CGRP反過來又促進LDCVs胞吐，形成正反饋，我們認為這一過程可能在痛覺敏化中起到關鍵作用。設法阻斷LDCVs胞吐不僅可減少CGRP釋放，也可降低TRPV1、TRPA1膜表達量，Ponsati (2012) 證實DD04107在慢性炎癥性和神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型中的強效且持久的疼痛緩解作用[31]，肉毒素A也可抑制LDCVs轉位，該藥在偏頭痛預防的良好效果也已得到臨床試驗支持，這些都表明此作用靶點對新藥研制的重大價值。

5.TRPV1 脫敏 (desensitization) 現(xiàn)象

含辣椒素的各種軟膏作為局部止痛制劑應用已有較長歷史。局部皮膚涂抹辣椒素后，在初始的燒灼感后，感覺神經(jīng)對熱、辣椒素以及其它類型刺激均出現(xiàn)脫敏現(xiàn)象[32]。通過提高辣椒素濃度，已脫敏的TRPV1通道可恢復之前的敏感性[33]。在感覺神經(jīng)細胞上長時程應用高濃度辣椒素，TRPV1通道電流表現(xiàn)為初始尖峰后跟著低平“平臺”的雙時相[34]。TRPV1脫敏呈鈣依賴性，去除細胞外鈣離子可致脫敏現(xiàn)象極大減弱甚至消失[35]。有關脫敏機制中最為認可的是內流鈣離子誘發(fā)PLC激活進而引起PIP2水平下降。盡管上述(4.2節(jié)) PIP2對TRPV1活性調節(jié)的實驗結果存在矛盾，數(shù)種可降低PIP2的磷酸肌醇磷酸酶均呈現(xiàn)出對TRPV1的抑制效應，而且PIP2與通道電流二者的下降水平呈現(xiàn)很好的相關性。在全細胞膜片鉗實驗中的玻璃電極內添加PIP2，TRPV1敏化現(xiàn)象減弱，不過并非完全消除，提示可能存在其它信號調控通路[36]。值得注意的是，緩激肽、ATP等促炎性因子也可激活PLC，與辣椒素脫敏效應不同的是它們最終敏化TRPV1，為何看似完全相同的信號通路卻導致截然相反的兩種效果呢？進一步機制仍待研究。

6.結語

綜上所述，TRPV1是在哺乳動物C類神經(jīng)纖維上的非選擇性陽離子通道，對鈣離子高通透。隨著顯微成像技術的發(fā)展其結構研究已達原子水平，可發(fā)現(xiàn)TRPV1激活時，通道蛋白構象發(fā)生變化，辣椒素等刺激物的結合位點也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但相應的結合方式以及結合后的激活方式仍屬未知。TRPV1對多種傷害性刺激均可作出反應，其調節(jié)因素同樣廣泛， TRPV1是細胞對外界環(huán)境多種刺激的“整合器”，在組織受損或發(fā)生炎癥時可引起單通道和細胞兩個水平的敏化，引起機體痛覺過敏、癢感等。通過研究病理狀態(tài)下TRPV1單通道及細胞水平改變，探索藥理學特異性的作用靶點，可預見其在止痛藥研制中重要的臨床價值與廣闊前景。

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10.3969/j.issn.1006-9852.2017.10.008

北京市自然科學基金面上項目(No. 7162178)

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