鄧新輝，彭扶風(fēng)，陳韻聲，何權(quán)運，孔樂群，李貝貝，張霞

1.湖南工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖南 株洲 412007；2.長沙市雅禮中學(xué)，湖南 長沙 410007

具重金屬抗性產(chǎn)酸菌的分離及生物學(xué)特性研究

鄧新輝1*，彭扶風(fēng)2，陳韻聲1，何權(quán)運1，孔樂群1，李貝貝1，張霞1

1.湖南工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖南 株洲 412007；2.長沙市雅禮中學(xué)，湖南 長沙 410007

鉛鋅冶煉廠周邊區(qū)域遭受復(fù)合重金屬的嚴(yán)重污染，目前單一重金屬污染土壤的修復(fù)技術(shù)比較成熟，而針對復(fù)合重金屬嚴(yán)重污染土壤的治理技術(shù)有待進一步研發(fā)。本研究采集鉛鋅冶煉廠附近重金屬污染土壤，試圖從土壤中分離出具重金屬抗性的產(chǎn)酸菌，并應(yīng)用于浸出修復(fù)復(fù)合重金屬重污染土壤。通過野外取樣調(diào)查、分子生物學(xué)鑒定和顯微鏡觀察等分析測試手段，從鉛鋅冶煉廠附近土壤中成功分離出一株具強重金屬抗性的產(chǎn)酸菌，經(jīng)鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger），命名為F2。對其重金屬抗性和浸出修復(fù)能力進行研究，結(jié)果表明：黑曲霉F2對Pb、Zn、Cd和Cu的最大耐受質(zhì)量濃度分別為8 500、6 000、2 200和2 500 mg?L-1。在高濃度重金屬的脅迫下，培養(yǎng)前期菌株處于馴化階段，不生長或生長很慢，培養(yǎng)后期生長速度加快。將黑曲霉接種到50 mL培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)液的pH值從7.00降至2.40，將2.5 g滅菌土壤加入50 mL培養(yǎng)液中，接種1 mL菌液，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中（溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速120 r·min-1）培養(yǎng)15 d，Pb、Zn、Cd和Cu的浸出百分率分別為46.79%、52.01%、29.40%和75.70%，對4種重金屬的總浸出率達59.54%。由此可見，黑曲霉不但具有很強的重金屬耐受性，還具有較大的浸出修復(fù)重金屬污染土壤的潛力，具備一定的研究價值。

黑曲霉；重金屬抗性；土壤；浸出修復(fù)

目前，重金屬污染土壤問題已受到國內(nèi)外專家學(xué)者的密切關(guān)注，尤其冶煉行業(yè)給土壤帶來的重金屬污染不容忽視。鄧新輝等（鄧新輝等，2015；Deng et al.，2012a）的研究表明了某鉛鋅冶煉廠廢渣堆場及附近區(qū)域土壤遭受到Pb、Zn、Cd和Cu等復(fù)合重金屬的嚴(yán)重污染。劉勇等（2015，2014）以關(guān)中西部某鉛鋅冶煉廠區(qū)內(nèi)土壤及周圍農(nóng)田為研究對象，結(jié)果表明廠區(qū)內(nèi)土壤已受到Pb、Zn、Cu、As、Cd和Hg的嚴(yán)重污染，廠區(qū)周圍農(nóng)田存在重金屬潛在生態(tài)危害，其中Cd和Hg的污染水平為重度污染，Pb的污染水平為中度污染。徐玉霞等（2014a，2014b）的研究發(fā)現(xiàn)關(guān)中西部某鉛鋅冶煉廠周圍耕地中Pb、Zn、Cu、Cd、Cr、Hg、As和Ni的平均含量均高于陜西省土壤元素背景值，鉛鋅冶煉廠周圍耕地土壤已達到中重度污染程度，其中重金屬Pb、Hg和Zn污染尤其嚴(yán)重。由此可見，冶煉廠區(qū)內(nèi)及附近區(qū)域土壤已遭受復(fù)合重金屬的嚴(yán)重污染。

治理重金屬污染土壤問題已成為國內(nèi)外專家學(xué)者的研究焦點，目前治理單一重金屬污染土壤的技術(shù)比較成熟，而對復(fù)合重金屬污染土壤的治理技術(shù)還有待研究發(fā)展（曹心德等，2011）。采用微生物技術(shù)治理重金屬污染土壤的前提是必須有重金屬抗性菌，多數(shù)菌株只對某一種或某兩種重金屬具有抗性，而同時對4種或4種以上重金屬具有抗性的菌株目前報道尚少。微生物浸出修復(fù)法是指利用自然界中微生物的直接作用或其代謝產(chǎn)物的間接作用，產(chǎn)生氧化、還原、絡(luò)合、吸附或溶解作用，將固相中的某些不溶性成分（如重金屬、硫及其它金屬）分離浸提出來的一種技術(shù)，該技術(shù)的原理源自于微生物濕法冶金（周順桂等，2002），也適應(yīng)于復(fù)合重金屬污染土壤的治理（Deng et al.，2012b）。用于浸出修復(fù)重金屬污染土壤的菌種有自養(yǎng)型和異養(yǎng)型兩種，自養(yǎng)型菌種主要有氧化亞鐵硫桿菌和氧化硫硫桿菌（Liu et al.，2008；Shi et al.，2004）；異養(yǎng)型菌種主要是一些異養(yǎng)真菌，如Aspergillus nige，Penicillium simplicissimum和Penicillium chrysogenum能通過代謝產(chǎn)生大量小分子有機酸，這些有機酸可以溶解、螯合土壤中的重金屬，達到提取土壤中重金屬的目的，是一種有效的微生物浸提土壤重金屬的方法（Sabra et al.，2012；Amiri et al.，2011）。

本研究試圖從冶煉廠附近復(fù)合重金屬污染土壤中分離具產(chǎn)酸特性的重金屬抗性菌株，旨在尋找對多種重金屬具有一定抗性的菌種，通過其新陳代謝產(chǎn)生的有機酸來提取土壤中的重金屬，以期為發(fā)展一項采用微生物浸出修復(fù)復(fù)合重金屬污染土壤的技術(shù)提供菌種資源和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

在湖南某冶煉廠附近1000 m以內(nèi)采集表層（0～20 cm）土壤，混合均勻，一部分保存于冰箱用于具重金屬抗性產(chǎn)酸菌的分離；另一部分去掉雜質(zhì)，曬干，磨碎，過20目篩，置于恒溫干燥箱中干燥24 h至恒重，裝進密封袋保存于干燥塔內(nèi)備用，部分送武漢楚江環(huán)?？萍加邢薰静捎迷游辗y量其重金屬含量，得出Pb、Zn、Cd和Cu在土壤中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為486、6.75×103、319和486 mg?kg-1。

1.2 培養(yǎng)基

用于菌種篩選的固體培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基的主要成分為：葡萄糖90 g，硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1000 mL。所有試劑均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 具重金屬抗性產(chǎn)酸菌的分離篩選

稱取10 g土壤樣品于150 mL已滅菌的錐形瓶中，加入10 mL滅菌培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，4 d后取1 mL泥漿于裝有9 mL滅菌水的試管中，充分搖勻，得到稀釋10倍的土壤懸液，記為10-1；從10-1管里取1 mL放入另一支裝有9 mL滅菌水的試管中，搖勻，記為10-2；依次稀釋，將土壤泥漿樣品稀釋成10-3、10-4、10-5和10-6。用移液槍從10-4、10-5和10-6稀釋液中分別取0.1 mL接種于含重金屬的LB固體培養(yǎng)基上（重金屬的質(zhì)量濃度為：Pb 1500 mg?L-1、Cd 80 mg?L-1、Cu 2000 mg?L-1和Zn 2000 mg?L-1），輕輕轉(zhuǎn)動平板，將菌液用三角棒涂布于培養(yǎng)基上，將平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察菌落的形態(tài)，采用常規(guī)平板劃線法分離純化。再用無菌接種針挑取不同形態(tài)的菌落，接種于察氏液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，自第2天開始用滅菌酸度計測量培養(yǎng)基pH值，找出能降低培養(yǎng)基pH值的菌株，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｒ陨纤媒橘|(zhì)均在121 ℃下滅菌30 min。

1.4 菌株的重金屬抗性研究

用直徑為0.9 cm的圓形接種環(huán)于平板菌落上沾取孢子接種到含不同重金屬濃度的固體培養(yǎng)基表面，每天用直尺測量菌落直徑，記錄數(shù)據(jù)，通過計算菌落直徑的變化來衡量菌株對重金屬的抗性。添加單一重金屬的培養(yǎng)時間為7～8 d，添加復(fù)合重金屬的培養(yǎng)時間為12 d。重金屬在培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度設(shè)置如下：Cu分別為1800、2000和2500 mg?L-1，Zn分別為4000、5000、6000和7000 mg?L-1，Pb分別為6000、7000和8000 mg?L-1，Cd分別為1800、2000、2200和2400 mg?L-1。

1.5 菌株產(chǎn)酸性能研究

用移液槍吸取無菌水于平板菌落上，蕩洗平板表面孢子，再將孢子懸液接種于液體培養(yǎng)基中，自培養(yǎng)的第2天開始用滅菌酸度計測量培養(yǎng)基pH值，直至培養(yǎng)基pH值不再降低。

1.6 菌株形態(tài)學(xué)和基因鑒定

1.6.1 光學(xué)顯微鏡觀察

用吸管吸取1滴菌株培養(yǎng)液于載玻片中央，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。

1.6.2 分子鑒定

將菌種接于察氏培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5 d，送長沙愛科博生物科技有限公司測定18s rDNA、ITS4和ITS5序列，鑒定菌種。采用優(yōu)化的CTAB法提取基因組DNA，以提取到的基因組DNA為模板，以ITS4/ITS5為引物（ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG-3′）；擴增ITS區(qū)序列，以NS1/NS8為引物（ZJ-NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC；ZJ-NS8：TCCGCAGGTTCACCT ACGGA）；擴增18s DNA區(qū)序列，擴增產(chǎn)物做PCR并純化、測序，然后以GenBank數(shù)據(jù)庫作為參考對測序結(jié)果進行BLAST分析。

1.7 菌株對重金屬的浸出修復(fù)能力研究

取上述察氏液體培養(yǎng)基49 mL裝入250 mL錐形瓶中，接種1 mL菌株孢子液，于電子天平上稱重，記下重量，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后添加2.5 g污染土壤，放回恒溫振蕩培養(yǎng)箱，7 d后再次取出，先恒重，再過濾。由于水分蒸發(fā)而失去的重量用無菌水補充，取濾液，采用ICP-AES測定濾液中重金屬含量。重金屬浸出率（%）等于浸出后濾液中重金屬質(zhì)量（mg）除以浸出前重金屬質(zhì)量（mg）再乘以100%，浸出前重金屬的質(zhì)量以2.5 g土壤計算，故得出2.5 g土壤中Pb、Zn、Cd和Cu的質(zhì)量分別為0.0012、16.875、0.7975和0.0012 mg。

圖1 菌株對重金屬Cu、Zn、Pb和Cd的抗性圖Fig.1 The resistance strain of Cu, Zn, Pb and Cd

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株對重金屬的抗性

如圖1a所示為菌株接種在不同Cu質(zhì)量濃度培養(yǎng)基上的生長情況，第1天接種的菌落直徑均為0.90 cm。當(dāng)Cu質(zhì)量濃度為1800 mg?L-1時，菌株培養(yǎng)7 d后，菌落直徑達2.07 cm，7 d增長了1.17 cm；而Cu質(zhì)量濃度分別為2000和2500 mg?L-1時，培養(yǎng)7 d后，菌落直徑分別只有1.20和1.07 cm，分別只增長了0.30和0.17 cm。因此，當(dāng)Cu質(zhì)量濃度為1800 mg?L-1時，菌株的生長明顯快于Cu質(zhì)量濃度為2000和2500 mg?L-1，尤其當(dāng)Cu質(zhì)量濃度為2500 mg?L-1時，菌株的生長接近停滯，故菌株對Cu的最大耐受質(zhì)量濃度為2500 mg?L-1。

圖1b所示為菌株接種在不同Zn質(zhì)量濃度培養(yǎng)基上的生長情況。從第2天開始，接種在Zn質(zhì)量濃度為4000 mg?L-1的培養(yǎng)基上的菌株生長了，直徑從0.90 cm增大至1.03 cm，其余濃度處理均未生長；培養(yǎng)基中Zn的質(zhì)量濃度分別為4000和5000 mg?L-1時，至培養(yǎng)的第3天，菌株的菌落直徑分別增大至1.10 cm和0.93 cm；當(dāng)Zn質(zhì)量濃度為6000和7000 mg?L-1時，菌株從第4天開始有緩慢生長，菌落直徑均增大至0.93 cm，其中質(zhì)量濃度為6000 mg?L-1的菌株繼續(xù)緩慢生長，至第7天時菌落直徑增大至1.10 cm，而此時Zn質(zhì)量濃度為7000 mg?L-1的菌落直徑增大至1.00 cm。由此可見，當(dāng)Zn的質(zhì)量濃度為6000 mg?L-1時，菌株出現(xiàn)緩慢生長，當(dāng)Zn的質(zhì)量濃度為7000 mg?L-1，菌株生長基本停滯，故菌株對Zn的最大耐受質(zhì)量濃度為6000 mg?L-1。

菌株對Pb的抗性如圖1c所示，當(dāng)Pb質(zhì)量濃度為7000 mg?L-1時，菌株從第2天開始緩慢生長，至第3天菌落直徑從0.90 cm增大至1.07 cm，第4天開始菌株快速生長，菌落直徑增大至1.77 cm，直到第7天增大至4.90 cm；Pb質(zhì)量濃度分別為8000和7000 mg?L-1時菌株的生長趨勢一致，但前者速度明顯減慢；Pb質(zhì)量濃度為8500 mg?L-1時菌株從第5天才開始生長，至第7天時菌落直徑達1.40 cm；而Pb質(zhì)量濃度為9000 mg?L-1時菌株幾乎不生長。因此，菌株對Pb的最大耐受質(zhì)量濃度為8500 mg?L-1。

菌株對Cd的抗性見圖1d，當(dāng)Cd質(zhì)量濃度為1800 mg?L-1時，菌株的生長基本不受Cd的影響，從培養(yǎng)的第2天開始，菌株呈直線生長；當(dāng)Cd質(zhì)量濃度為2000 mg?L-1，從第4天才開始生長，至第7天時菌落直徑由0.90 cm增至1.90 cm；當(dāng)Cd質(zhì)量濃度為2200 mg?L-1時，從第4天才開始緩慢生長，至第7天時菌落直徑才由0.90 cm增至1.30 cm；當(dāng)Cd質(zhì)量濃度為2400 mg?L-1時，菌株基本不生長，至第7天時菌落直徑只有1.07 cm，故菌株能耐受的最大Cd質(zhì)量濃度為2200 mg?L-1。

2.2 菌株培養(yǎng)液pH值的變化

采用pH值為7.0的培養(yǎng)液培養(yǎng)菌株（圖2），培養(yǎng)的第3天，培養(yǎng)液pH值降至3.39，以后每天逐步降低，直至第8天時降至2.40。培養(yǎng)基pH值的降低是由于在培養(yǎng)過程中，菌株代謝產(chǎn)生了小分子有機酸（Deng et al.，2013）。至于菌株在代謝過程中產(chǎn)生了哪些有機酸及其他產(chǎn)物，有待進一步通過液相色譜、質(zhì)譜等分析測試手段研究（Ren et al.，2009）。

圖2 菌株培養(yǎng)液pH值圖Fig.2 Medium pH value of the strain

2.3 具重金屬抗性產(chǎn)酸菌的分離鑒定

從圖3可看出，菌絲呈黑褐色、發(fā)達，多分枝，分生孢子球形，呈黑色，菌落表面粗糙，結(jié)合分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），該具重金屬抗性產(chǎn)酸菌為黑曲霉，拉丁名為Aspergillus niger，命名為F2。

圖3 黑曲霉菌絲及孢子形態(tài)(×40)Fig.3 Mycelium and spore morphology of Aspergillus niger F2

2.4 黑曲霉對重金屬的浸出效率

黑曲霉F2對污染土壤中重金屬Pb、Zn、Cd和Cu的浸出效率如圖5所示，其中Pb的浸出百分率為46.79%，Zn的浸出百分率為52.01%、Cd的浸出百分率為29.40%，Cu的浸出百分率為75.70%，換算得出50 mL液體培養(yǎng)基中能浸出10.52 mg重金屬，即4種重金屬的總浸出率達59.54%。根據(jù)已有文獻報道，在相同條件下（溫度、培養(yǎng)基和恒溫振蕩培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速相同），黑曲霉F2對土壤中重金屬的總浸出率與產(chǎn)黃青霉相當(dāng)（Ahmad et al.，2011），證明該菌株具有很高的應(yīng)用價值，因此，有必要深入研究黑曲霉F2產(chǎn)酸的培養(yǎng)基組分及代謝條件，進一步提高黑曲霉對重金屬的浸出率，了解其代謝途徑，研究其浸出機理，發(fā)展一項黑曲霉F2浸出修復(fù)重金屬污染土壤的技術(shù)。

3 結(jié)論

（1）黑曲霉具有很強的重金屬耐受性，在含高濃度重金屬的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)前期菌株處于接受重金屬的馴化階段，不生長或生長很慢，培養(yǎng)后期生長速度加快。黑曲霉對Pb、Zn、Cd和Cu的最大耐受濃度分別為8500、6000、2200和2500 mg?L-1。

（2）黑曲霉對重金屬污染土壤的浸出修復(fù)潛力大，能將50 mL液體培養(yǎng)基的pH值從7.0降至2.40，對Pb、Zn、Cd和Cu的浸出百分率分別為46.79%、52.01%、29.40%和75.70%，對4種重金屬的總浸出率達59.54%。

圖4 基于黑曲霉ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS sequence of Aspergillus niger F2

圖5 黑曲霉浸出重金屬圖Fig.5 Heavy metal bioleaching efficiency of Aspergillus niger F2

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Study on Isolating of the Strain Having the Ability of Heavy Metal Resistance and Producing Organic Acid

DENG Xinhui1*, PENG Fufeng2, CHEN Yunsheng1, HE Quanyun1, KONG Lequn1, LI Beibei1, ZHANG Xia1
1.College of Life Sciences and Chemistry of Hunan University of Technology, Zhuzhou 412007, China; 2.Yali High School, Changsha 410007, China

The soil in the surrounding area of Pb/Zn smeltery was contaminated by heavy metals such as Pb, Zn, Cd and Cu et al.The remediation technology for single heavy metal contaminated soil is already mature, but it needs further development for the seriously heavy metals compound contaminated soil.In the paper, the soil was collected in the surrounding area of Pb/Zn smeltery, and the microbiology having not only the ability of heavy metal resistance but also the ability of producing acid would be selected and isolated in order to being used to remedy the contaminated soil.Through field sampling and surveying, molecular biological identification, microscopic examination, a strain was selected from the soil samples which was indentified as Aspergillus niger and named as F2, the ability of heavy metal resistant and bioleaching remediation was studied in the paper.The results show: The largest concentration of resistance to Pb, Zn, Cd and Cu of Aspergillus niger F2 is 8 500, 6 000, 2 200 and 2 500 mg?L-1, the largest concentration of resistance to the compound of Pb, Zn, Cd and Cu is 105, 2 400, 2 200 and 2 400 mg?L-1.The growth of Aspergillus niger F2 on LB medium containing high concentrations of heavy metals was faster in the later stage than in the early stage.The pH value of liquid medium was degraded from 7.00 to 2.40 in 7 days.2.5 g sterilized soil was added into 49 mL liquid medium, 1 mL spore suspension liquid was inoculated, then put in 28 ℃ and 120 r·min-1orbital shaker incubator, after 15 days, the bioleaching efficiency of Pb, Zn, Cd and Cu was 46.79%, 52.01%, 29.40% and 75.70% respectively, the total bioleaching efficiency of Pb, Zn, Cd and Cu was 59.54%.Thus Aspergillus niger F2 has large ability of heavy metal resistance and good applied value of bioleaching remediation on heavy metal contaminated soil.

Aspergillus; niger; heavy metal resistance; soil bioleaching

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.10.019

X172

A

1674-5906（2016）10-1727-06

鄧新輝, 彭扶風(fēng), 陳韻聲, 何權(quán)運, 孔樂群, 李貝貝, 張霞.2016.具重金屬抗性產(chǎn)酸菌的分離及生物學(xué)特性研究[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 25(10): 1727-1732.

DENG Xinhui, PENG Fufeng, CHEN Yunsheng, HE Quanyun, KONG Lequn, LI Beibei, ZHANG Xia.2016.Study on isolating of the strain having the ability of heavy metal resistance and producing organic acid [J].Ecology and Environmental Sciences, 25(10): 1727-1732.

國家自然科學(xué)基金項目（51474102）；湖南省自然科學(xué)基金項目（2015JJ3059）；湖南省大學(xué)生創(chuàng)新項目

鄧新輝（1974年生），女，博士研究生，主要從事重金屬污染土壤研究。E-mail: xhdeng2007@126.com *通信作者

2016-05-26