武紅敏，郭威,郭曉軍，周賢，朱寶成

(河北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，河北 保定 071001)

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華北地區(qū)圈養(yǎng)大熊貓糞便中產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌菌株的分離與鑒定

武紅敏，郭威,郭曉軍，周賢，朱寶成

(河北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，河北 保定 071001)

為分離篩選大熊貓腸道中具有纖維素降解能力的芽孢桿菌菌株，首先對8份大熊貓糞便進行高溫水浴處理，利用剛果紅平板法進行初篩和復篩，DNS法測定酶活力.結果分離出126株菌株，其中8株菌株纖維素降解能力較強.結合形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鑒定8個菌株均屬于芽孢桿菌屬，其中1株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，1株阿薩爾基芽孢桿菌(B.axarquienis)，2株西姆芽孢桿菌(B.siamensis)，4株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus).實驗表明大熊貓腸道中存在多種降解纖維素的芽孢桿菌，其中新發(fā)現(xiàn)的有大熊貓源的阿薩爾基芽孢桿菌和西姆芽孢桿菌，豐富了大熊貓腸道菌群的研究，并為高效生產(chǎn)纖維素酶提供新的菌種來源.探究了大熊貓消化道內(nèi)高效的纖維素降解菌，有利于實現(xiàn)高纖維類飼料資源化利用.

大熊貓；糞便；芽孢桿菌；纖維素酶

大熊貓是食肉目動物中罕見的素食者，以采食箭竹為主.大熊貓除能消化吸收竹子中的大部分蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)外，也可以有效利用纖維素、半纖維素[1].但是在大熊貓基因組序列中并沒有發(fā)現(xiàn)編碼纖維素酶的相關基因[2]，因此，認為大熊貓消化纖維素是依賴其腸道微生物的作用[3].譚志等[4]、魯海峰等[5]、馬清義等[6]分別研究了野外放歸和圈養(yǎng)大熊貓腸道菌群的種類、數(shù)量、分布及群落結構.馬海玲[7]從大熊貓糞便中分離得到13株纖維素分解菌，其中8株為真菌，5株為放線菌.王海娟等[3]研究推測了大熊貓腸道菌群消化竹纖維的過程.開展大熊貓腸道消化纖維素菌群組成和功能研究是十分必要的[8].

目前，對纖維素酶菌株已有深入研究，生產(chǎn)纖維素酶多使用真菌作為生產(chǎn)菌株；而以功能菌株來達到降解纖維素的目的時，則以細菌為優(yōu)，即由過去以真菌為生產(chǎn)菌轉(zhuǎn)到以細菌為生產(chǎn)主體[9].從菌劑的角度來講，芽孢桿菌穩(wěn)定性和環(huán)境適應性好、產(chǎn)酶活性高，可以得到比較穩(wěn)定的菌劑，便于農(nóng)牧業(yè)上的應用[10].目前所選育出來的芽孢桿菌菌株中高效產(chǎn)酶的菌種還不多，故仍然需要尋找新的產(chǎn)纖維素酶菌株或進一步選育高產(chǎn)菌株[11].因此大熊貓腸道纖維分解菌的研究具有潛在的應用價值.

本實驗擬從健康的大熊貓新鮮糞便中分離篩選纖維素降解芽孢桿菌菌株，并對其進行種屬鑒定，為纖維素降解提供新的菌種來源.

1 材料與方法

1.1 樣品及來源

大熊貓新鮮糞樣8份，于2014年10月份采自石家莊動物園健康的大熊貓.

1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基、NB種子培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基[12]、菌種篩選培養(yǎng)基[13](CMC-Na培養(yǎng)基、剛果紅培養(yǎng)基)、發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[14]、生理生化鑒定培養(yǎng)基(依據(jù)文獻[15]的方法配制)，所有培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃滅菌15 min.

1.3 實驗方法

1.3.1 纖維素降解菌的篩選

取樣：將新鮮的大熊貓糞便裝入無菌自封袋中，將裝有樣品的自封袋冷藏.

富集培養(yǎng)：將8份大熊貓糞便樣品混勻，取混合后的糞樣5 g于盛有50 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，搖床震蕩20 min，80 ℃水浴20 min滅活菌體.取水浴后的10 mL糞樣混懸液接種于100 mL富集培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min搖床富集培養(yǎng)24 h.

細菌菌株的分離：將富集培養(yǎng)后的菌液進行梯度稀釋，分別取稀釋度為10-4、10-5、10-6的菌液100 μL涂布于剛果紅平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h.挑取不同菌落形態(tài)的單個菌落，鏡檢，取G+菌株連續(xù)3次劃線接種NA平板，將單菌落接種于NA斜面，保存于4 ℃冰箱.

纖維素降解菌的初篩：將分離純化后的菌株點接到剛果紅培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h.觀察是否出現(xiàn)透明圈.

纖維素降解菌的復篩：將初篩得到的菌株接種于NB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)12 h，然后將種子液按6%的接種量接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h.將發(fā)酵液3 000 r/min離心10 min，取離心后的上清液60 μL注入CMC-Na平板孔內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)，24 h后滴加2 mg/mL剛果紅染色液，染色30 min后，再用蒸餾水和1 mol/L NaCl洗去染液，分別記錄透明圈直徑.

纖維素酶活力的測定：發(fā)酵上清液即為粗酶液，參照文獻[16]進行葡萄糖標準曲線的繪制以及酶活力的測定.

酶活力定義：1 mL粗酶液每分鐘催化羧甲基纖維素鈉生成1 μmol 還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位U.

1.3.2 菌株鑒定

根據(jù)菌株的菌落和菌體形態(tài)特征、生理生化特性實驗及16S rDNA序列分析進行菌株的種屬鑒定，具體方法參照文獻[15]、文獻[17].

菌株形態(tài)鑒定：參照文獻[17]進行.

菌株的生理生化鑒定：參照文獻[15]進行.

16S rDNA序列分析鑒定：參考 Kim等[18]和Rainey等[19]的方法提取細菌總DNA，采用細菌 16S rDNA 的通用引物進行PCR.產(chǎn)物純化后送北京寶銳通生物科技有限公司測序.將所測得的16S rDNA序列結果提交到GenBank中進行BLAST比對，選取相似性較高的序列，利用Mega 5軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹[20].將8株菌株的16S rDNA基因提交到NCBI數(shù)據(jù)庫.

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

2.1.1 纖維素降解菌株的初篩

將富集樣品經(jīng)熱處理后，由剛果紅平板篩選得到126株具有降解纖維素能力的菌株.

2.1.2 纖維素降解菌株的復篩

對初篩得到的126株菌株進行復篩，得到76株降解纖維素能力較高的菌株，部分菌株的透明圈大小見圖1、表1.

圖1 打孔法復篩結果Fig.1 Results of stiletto method rescreening

菌株 透明圈直徑/mm菌株 透明圈直徑/mmN-218.43±0.12Y-119.53±0.06N-323.97±0.06Y-319.13±0.12N-524.03±0.15Y-620.40±0.10N-624.00±0.10Y-919.03±0.15N-723.53±0.15Y-1022.00±0.10N-1022.50±0.10Y-1118.00±0.00L-1121.47±0.062L-919.97±0.15L-1221.93±0.122L-1720.03±0.06

續(xù)表1

2.1.3 纖維素酶活力測定

對復篩過程中透明圈直徑>18.0 mm的40株菌株進行酶活力測定，結果見表2.

表2 發(fā)酵液中纖維素酶活力測定結果

由表2可以看出,2N-10、2N-12、2N-14、2L-9、2L-24、Y-6、Y-10和3X-10 8株菌株酶活性較高，因此，選取此8株菌株進行進一步研究.

2.2 菌株的種屬鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)學鑒定

菌株菌落形態(tài)如圖2所示，菌株菌體形態(tài)見圖3，芽孢形態(tài)見圖4，菌落形態(tài)特征見表3，菌體形態(tài)特征見表4.

圖2 菌株菌落形態(tài)Fig.2 Colonial morphology of strains

圖3 菌株菌體形態(tài)Fig.3 Mycelia morphology of strains

圖4 芽孢形態(tài)(2N-10)Fig.4 Spore of strain 2N-10

菌株菌落形狀菌落大小顏色邊緣光學特性表面隆起2N-10圓形適中乳白鋸齒狀不透明干燥四周隆起2N-12圓形適中乳白鋸齒狀不透明干燥四周隆起2N-14圓形適中白色鋸齒狀不透明干燥中間隆起2L-9圓形適中白色較規(guī)則不透明干燥四周隆起2L-24圓形偏大黃色褶皺 不透明干燥四周隆起Y-6圓形偏小乳白鋸齒狀不透明黏稠四周隆起Y-10圓形適中微黃鋸齒狀不透明黏稠中心凸起3X-10圓形適中乳白較整齊不透明濕潤中心凸起

表4 菌株菌體形態(tài)特征

2.2.2 菌株的生理生化鑒定

生理生化結果見表5.菌株2N-12、Y-6和Y-10甲基紅實驗為陽性，其余為陰性；糖類發(fā)酵實驗中，除2N-12和2N-14菌株外，其余都為陽性；丙二酸利用實驗只有Y-6和Y-10菌株為陽性.其余各實驗項目結果均一致.

表5 菌株的生理生化特征

續(xù)表5

“+”表示陽性，“-”表示陰性，以加號多少表示菌株活性的強弱.

2.2.3 菌株16S rDNA的分子鑒定結果

以菌株的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增后在10 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳，結果如圖5.由圖5可見，在約1 500 bp處有明亮的條帶，與預期大小一致.測序結果表明，8株菌株的16S rDNA序列長度都在1 545～1 675 bp.

M.DNA Marker(bp)1-8.分別為2N-10、2N-12、2N-14、2L-9、2L-24、Y-6、Y-10和3X-10菌株的16S rDNA基因片段的PCR產(chǎn)物.圖5 16S rDNA PCR擴增電泳檢測Fig.5 Electrophoresis detection of 16S rDNA PCR amplification

2.2.4 基于16S rDNA序列及系統(tǒng)進化樹分析

將測得菌株的序列提交到GenBank中進行BLAST比對，選取較高相似度的標準菌株，利用Mega5軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖6—9.將8株菌株的16S rDNA基因提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，得到菌株序列號(KX214610～KX214617),見表6.

圖6 2N-12菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹結構Fig.6 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain 2N-12

圖7 2N-14菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹結構Fig.7 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain 2N-14

圖8 Y-10菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹結構Fig.8 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain Y-10

圖9 3X-10菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹結構Fig.9 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain 3X-10

菌株鑒定結果最大相似率/%登錄號Accessionnumbers2N-10甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus100 KX2146102N-12阿薩爾基亞芽孢桿菌Bacillusaxarquienis99.5KX2146122N-14枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis100 KX2146132L-9甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus100 KX2146152L-24甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus100 KX214611Y-6西姆芽孢桿菌Bacillussiamensis100 KX214616Y-10西姆芽孢桿菌Bacillussiamensis99.7KX2146143X-10甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus100 KX214617

經(jīng)16S rDNA分子鑒定，結合菌株的形態(tài)特征和生理生化實驗結果，參照文獻[15]和文獻[17]，發(fā)現(xiàn)菌株特征均與芽孢桿菌相近，2N-14為B.subtilis，2N-12為B.axarquienis，Y-6和Y-10為B.siamensis，2N-10、2L-9、2L-24和3X-10為B.methylotrophicus.

3 討論

目前國內(nèi)外對大熊貓腸道菌群的研究主要集中在以大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、克雷伯氏桿菌(Klebsiella)、空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)為代表的致病菌；而對其腸道纖維素降解菌的研究較少.本實驗從大熊貓的糞樣中共篩選到了具有較高纖維素酶活的菌株40株，為以后研究大熊貓腸道內(nèi)降解纖維素的機制提供了更多的菌源.在熊貓體內(nèi)篩選到產(chǎn)纖維素酶的菌種方面，榮華[21]從大熊貓腸道內(nèi)分離篩選出1株梭菌屬厭氧纖維降解菌PD-2，曹涵文等[22]于福州動物園大熊貓糞便中分離出1株假單胞菌菌株NC020209，而本實驗篩選到的纖維降解菌均為芽孢桿菌屬，較前2種菌生產(chǎn)更為容易、應用更為廣泛.在熊貓體內(nèi)芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶酶活方面，樊程等[23]從雅安碧峰峽熊貓基地大熊貓糞便中分離得到1株好氧菌株解淀粉芽孢桿菌 NBRC15535，其纖維素總酶活最高僅為0.229 U/mL；周瀟瀟等[24]為進一步弄清成年大熊貓腸道中芽孢桿菌的分布和尋求大熊貓微生態(tài)制劑的菌源，在大熊貓腸道中分離篩選出7株纖維降解菌，分別為4株枯草芽孢桿菌、1株蠟樣芽孢桿菌、2株短小芽孢桿菌，但并未進行進一步的酶活測定篩選；趙珊等[25]從四川臥龍自然保護區(qū)的新鮮大熊貓糞便內(nèi)篩選到1株好氧纖維素降解菌蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus，A1)，且在最適培養(yǎng)條件下纖維素酶活最高達到0.139 U/mL；而本實驗篩選到的產(chǎn)纖維素酶菌株中，酶活在0.250 U/mL以上的有8株菌，分別為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)1株，阿薩爾基芽孢桿菌(B.axarquienis)1株，西姆芽孢桿菌(B.siamensis)2株，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)4株，高于上述報道.

本實驗報道從大熊貓腸道中分離篩選得到具有纖維素降解能力的阿薩爾基芽孢桿菌、西姆芽孢桿菌，豐富了大熊貓腸道菌群的種類.目前對阿薩爾基芽孢桿菌和西姆芽孢桿菌的研究還很少.阿薩爾基芽孢桿菌方面，只有Ruiz-García 等[26]在2005年分離出了阿薩爾基芽孢桿菌的新種的報道，尚未有功能研究的報道，本研究首次報道了阿薩爾基芽孢桿菌具有降解纖維素的功能.西姆芽孢桿菌的研究主要集中在生物防治[27]和新型食品酶源[28]的報道，尚未發(fā)現(xiàn)西姆芽孢桿菌對于纖維素降解功能的研究.本實驗首次報道阿薩爾基芽孢桿菌和西姆芽孢桿菌具有降解纖維素的功能，為進一步開發(fā)2個菌株提供了理論基礎.

[1] 婁治平，賴仞，苗海霞.生物多樣性保護與生物資源永續(xù)利用[J].中國科學院院刊，2012，27(3)：359-365.DOI:10.3969/j.issn.1000-3045.2012.03.015.

LOU Z P,LAI R,MIAO H X.Conservation of biodiversity and sustainable utilization of biological resources[J].Bulletin of Chinese Academy of Sciences,2012,27(3):359-365.DOI:10.3969/j.issn.1000-3045.2012.03.015.

[2] LI R,FAN W,TIAN G,et al.The sequence and de novo assembly of the giant panda genome[J].Nature,2010,463(7279):311-317.DOI:10.1038/nature 08696.

[3] 王海娟，潘渠.大熊貓腸道正常菌群降解纖維素的機制[J].中國微生態(tài)學雜志，2014，26(2)：225-228.DOI:10.13381/j.cnkicjm.201402028.

WANG H J,PAN Q.The mechanism of cellulose metabolism by the giant panda gut microbiome[J].Chinese Journal of Microecology,2014,26(2):225-228.DOI:10.13381/j.cnkicjm.201402028.

[4] 譚志，鮑楠，賴翼，等.野外放歸大熊貓和圈養(yǎng)大熊貓腸道正常菌群的研究[J].四川大學學報(自然科學版)，2004，41(6)：1276-1279.DOI:10.3969/j.issn.0490-6756.2004.06.039.

TAN Z,BAO N,LAI Y,et al.The study on the normal intestinal microflora of the giant panda returned to wild and the giant panda in captivity[J].Journal of Sichuan University (Natural Science Edition),2004,41(6):1276-1279.DOI:10.3969/j.issn.0490-6756.2004.06.039.

[5] 魯海峰，魏桂芳，李仲逵，等.ERIC-PCR分子雜交技術分析大熊貓腸道菌群結構[J].中國微生態(tài)學雜志，2005，17(2)：81-84.DOI:10.3969/j.issn.1005-376X.2005.02.001.

LU H F,WEI G F,LI Z K,et al.ERIC-PCR based fingerprinting and molecular hybridization to analyze the characteristics of intestinal microflora of giant panda[J].Chinese Journal of Microecology,2005,17(2):81-84.DOI:10.3969/j.issn.1005-376X.2005.02.001.

[6] 馬清義，任建設，史懷平.人工飼養(yǎng)大熊貓消化道正常菌群分離與鑒定研究[J].北京農(nóng)業(yè)，2009，21：56-57.DOI:10.3969/j.issn.1000-6966.2009.21.015.

MA Q Y,REN J S,SHI H P.Isolation and identification of intestinal flora in giant panda[J].Beijing Agriculture,2009，21:56-57.DOI:10.3969/j.issn.1000-6966.2009.21.015.

[7] 馬海玲.基于動物糞便的纖維素分解菌篩選及分解纖維素能力研究[D].北京：中國地質(zhì)大學，2012.

MA H L.Screening cellulose degradating microorganisms from animal wastes and studying of the capable of degradation cellulose[D].Beijing:China University of Geosciences,2012.

[8] WEI F,WANG X,WU Q.The giant panda gut microbiome[J].Trends Microbiol,2015,23(8):450-452.DOI:10.1016/j.tim.2015.06.004.

[9] 祝小，王振華，潘康成，等.產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌篩選及發(fā)酵條件的初步研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2006，11：122-124.DOI:10.3969/j.issn.1007-5739.2006.21.082.

[10] 陳麗燕，張光祥，黃春萍，等.兩株高產(chǎn)纖維素酶細菌的篩選、鑒定及酶學特性[J].微生物學通報，2011，38(4)：531-538.DOI:10.13344/j.microbiol.china.2011.04.017.

CHEN L Y,ZHANG G X,HUANG C P,et al.Isolation,identification and enzymatic characteristics of cellulose-producing strains with high cellulase activity[J].Microbiology China,2011,38(4):531-538.DOI:10.13344/j.microbiol.china.2011.04.017.

[11] 朱順妮，王聞，亓偉，等.纖維素酶的研究進展[J].新能源進展，2013，1(1)：45-52.DOI:10.3969/j.issn.2095-560X.2013.01.005.

ZHU S N,WANG W,QI W,et al.Research progress in cellulase[J].Advances in New and Renewable Energy,2013,1(1):45-52.DOI:10.3969/j.issn.2095-560X.2013.01.005.

[12] 朱亞靜.鵝腸道纖維素酶和蛋白酶活性分析以及纖維素降解菌的篩選[D].南寧：廣西大學，2013.

ZHU Y J.Analysis of cellulase and protease and activity of goose intestine and screen on bacteria capable of degrading[D].Nanning:Guangxi University,2013.

[13] 胡艷平，王磊，曹平華，等.纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、其酶學性質(zhì)及對飼料粗纖維降解效果的研究[J].飼料工業(yè)，2013，34(8)：21-27.DOI:10.3969/j.issn.1001-991X.2013.08.005.

HU Y P,WANG L,CAO P H,et al.Study of screening of a strain producing cellulase,its enzymatic properties and the degradation rate of crude fiber in the feed[J].Feed Industry,2013,34(8):21-27.DOI:10.3969/j.issn.1001-991X.2013.08.005.

[14] 吳敏峰，耿秀蓉，祝小，等.產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的分離鑒定[J].飼料工業(yè)，2006，27(20)：21-24.DOI:10.3969/j.issn.1001-991X.2006.20.007.

[15] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：北京科學出版社，2001.

[16] B.施特馬赫.酶的測定方法[M].錢嘉淵譯.北京：中國輕工業(yè)出版社，1992：103-177.

[17] J.G 霍爾特主編.簡明第八版伯杰細菌鑒定手冊[M].劉復今編譯.濟南：山東大學出版社，1988.

[18] KIM S B,YOON J H,KIM H,et al.A phylogenetic analysis of the genussaccharomonosporaconducted with 16S rRNA gene sequences[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1995,45(2):351-356.

[19] RAINEY F A,WARD-RAINEY N,KROPPENSTEDT R M,et al.The genus nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage:proposal of nocardiopsaceae fam[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1996,46(4):1088-1092.DOI:10.1099/00207713-46-4-1088.

[20] HALL B G.Building phylogenetic trees from molecular data with MEGA[J].Molecular Biology and Evolution,2013,30(5):1229-1235.DOI:10.1093/molbev/mst012.

[21] 榮華，邱成書，胡國全，等.一株大熊貓腸道厭氧纖維素菌的分離鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析及生物學特性的研究[J].應用與環(huán)境生物學報，2006，12(2)：239-242.DOI:10.3321/j.issn:1006-687X.2006.02.021.

RONG H,QIU C S,HU G Q,et al.Isolation of cellulolytic anaerobic strain from giant panda′s intestines and its biological characteristics and phylogeny[J].Chinese Journal of Applied & Environmental Biology,2006,12(2):239-242.DOI:10.3321/j.issn:1006-687X.2006.02.021.

[22] 曹涵文，吳瓏韜，甘乾福，等.熊貓糞便中纖維素降解菌的篩選與鑒定[J].家畜生態(tài)學報,2015,06:19-25.DOI:10.3969/j.issn.1673-1182.2015.06.005.

CAO H W,WU L T,GAN Q F,et al.Isolation and identification of cellulose-degradation bacteria from panda dung[J].Journal of Domestic Animal Ecology,2015,06:19-25.DOI:10.3969/j.issn.1673-1182.2015.06.005.

[23] 樊程，李雙江，李成磊，等.大熊貓腸道纖維素分解菌的分離鑒定及產(chǎn)酶性質(zhì)[J].微生物學報，2012，52(9)：1113-1121.DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.2012.09.004.

FAN C,LI S J,LI C L,et al.Isolation,identification and cellulase production of a cellulolytic bacterium from intestines of giant panda[J].Acta Microbiologica Sinica,2012,52(9):1113-1121.DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.2012.09.004.

[24] 周瀟瀟，何廷美，彭廣能，等.大熊貓腸道芽孢桿菌的分離鑒定及其抗逆性研究[J].中國獸醫(yī)科學，2013，43(11)：1115-1121.

ZHOU X X,HE T M,PENG G N,et al.Isolation,identification and resistance analysis of 7Bacillusstrains from the intestinal tract of giant panda[J].Chinese Veterinary Science,2013,43(11):1115-1121.

[25] 趙珊，呂雯婷，劉杰，等.1株大熊貓腸道纖維素降解菌的分離鑒定及其酶學性質(zhì)[J].微生物學雜志，2015，35(1)：73-78.DOI:10.3969 / j.issn.1005-7021.2015.01.014.

ZHAO S,Lü W T,LIU J,et al.Isolation of cellulose Degradable-Bacteria from Giant Panda′s intestines and its enzymatic characterization[J].Journal of Microbiology,2015,35(1):73-78.DOI:10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.014.

[26] RUIZ GARCIA C,QUESADA E,MARTINEZ CHECA F,et al.Bacillusaxarquiensissp.nov.andBacillusmalacitensissp.nov.,isolated from river-mouth sediments in southern Spain[J].Int J Syst Evol Microbiol,2005,55(3):1279-1285.DOI:10.1099/ijs.0.63567-0.

[27] 馮志珍，李金嶺，陳太春，等.番茄疫霉根腐病拮抗細菌 FC12-05 的篩選、鑒定及其抑菌活性初探[J].西北農(nóng)林科技大學學報 (自然科學版)，2012，40(4)：107-114.DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2012.04.021.

FENG Z Z,LI J L,CHEN T C,et al.Screening,identification and antibacterial activity of antagonistic bacteria FC12-05 against phytophthora root rot of tomato[J].Journal of Northwest A & F University(Natural Science Edition),2012,40(4):107-114.DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2012.04.021.

[28] 紀學芳，師俊玲，張錦華.檸檬苦素降解菌的分離篩選與分類鑒定[J].食品科學，2011，32(15)：177-181.

JI X F,SHI J L,ZHANG J H.Isolation and identification of limonin-degrading strains isolated from fermented grains during vinegar fermentation[J].Food Science,2011,32(15):177-181.

(責任編輯：趙藏賞)

Isolation and identification ofBacilluscapable of degrading cellulose from the feces captive giant panda of in north China

WU Hongmin,GUO Wei,GUO Xiaojun,ZHOU Xian,ZHU Baocheng

(College of Life Sciences,Agriculture University of Hebei,Baoding 071001,China)

This study aimed at screening strains ofBacillussp.capable of degrading cellulose and identifying the species of purpose strains.8 dung samples of giant panda were treated in water bath at high temperature.Congo red decolorizing ring method was used to screen the strains before DNS method to test the highest enzyme activity.The results showed that 8 strains of 126 strains isolated in dung of giant panda had highly efficient cellulose-degrading capability.Through morphological,physiological and biochemical analysis and the sequence analysis of 16S rDNA gene,8 strains were identified.The strains are allBacillussp.,including 1Bacillussubtilis(2N-14),1B.axarquienis(2N-12),2B.siamensis(Y-6、Y-10),and 4B.methylotrophicus(2N-10、2L-9、2L-24、3X-10).The test shows that there were many strains (Bacillussp.) capable of cellulose degradation in the dung of giant panda.The giant panda-derivedB.axarquienis,B.siamensiswere isolated and cultivated for the first time,which enriched the research of giant panda intestinal flora and provided new sources of strains for efficient production of cellulose.Exploring the efficiency of cellulose degradation bacteria in the digestive tract of panda is beneficial for the resource utilization of high fiber feed.

giant panda;feces;bacillus;cellulose

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.06.010

2015-12-22

河北省科技計劃項目(12236606)；保定市科學研究與發(fā)展計劃項目(15ZN017)

武紅敏(1990—)，女，河北藁城人，河北農(nóng)業(yè)大學在讀碩士研究生.E-mail:873659445@qq.com

朱寶成(1962—)，男，河北滄州人，河北農(nóng)業(yè)大學教授，博士生導師，主要從事農(nóng)牧微生物應用技術研究.E-mail:zhu2222@126.com

S858.9

A

1000-1565(2016)06-0623-12