王成云，劉彬彬，尹麗娟，林君峰，沈雅雯

（1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 深圳 518067；

2.深圳大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東 深圳 518060）

超高效液相色譜/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速測定紙質(zhì)食品接觸材料中的5種異噻唑啉酮類防腐劑

王成云1，劉彬彬1，尹麗娟1，林君峰1，沈雅雯2

（1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 深圳 518067；

2.深圳大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東 深圳 518060）

建立了一種快速測定紙質(zhì)食品接觸材料中5種異噻唑啉酮類防腐劑的超高效液相色譜/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC/Orbitrap HRMS）分析方法。該方法以甲醇為萃取溶劑，超聲萃取紙質(zhì)食品接觸材料中的異噻唑啉酮類防腐劑，萃取液經(jīng)濃縮定容后，進(jìn)行UPLC/Orbitrap HRMS分析。采用Hypersil GOLD色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）對5種異噻唑啉酮類防腐劑進(jìn)行色譜分離，流動相為甲醇-φ（甲酸）=0.1%水溶液，洗脫方式為梯度洗脫。質(zhì)譜分析采用電噴霧正離子（ESI+）模式，一級質(zhì)譜全掃描范圍為m/Z100～300，5種異噻唑啉酮類防腐劑的質(zhì)量準(zhǔn)確度誤差均小于2×10-6。利用目標(biāo)分析物的保留時(shí)間和準(zhǔn)分子離子的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性，利用提取離子色譜峰面積進(jìn)行外標(biāo)法定量。在0.2～100.0 μg/L范圍內(nèi)，5種異噻唑啉酮類防腐劑的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.998，方法檢出限為0.1 μg/kg。在3個不同加標(biāo)濃度水平下，平均加標(biāo)回收率為81.8%～94.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～9.8%。該方法定性可靠，定量準(zhǔn)確，檢出限低，可完全滿足紙質(zhì)食品接觸材料中異噻唑啉酮類防腐劑檢測工作的需要。

超高效液相色譜/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜；紙質(zhì)食品接觸材料；異噻唑啉酮；超聲萃?。豢焖贉y定

紙質(zhì)食品接觸材料是一類重要的食品包裝材料[1]，品種豐富，且綠色環(huán)保，但作為原料的紙為微生物的繁殖提供了良好的環(huán)境，易導(dǎo)致紙的質(zhì)量降低，甚至影響正常生產(chǎn)，企業(yè)往往使用防腐劑來控制微生物的生長繁殖[2]。異噻唑啉酮類防腐劑是一類高效廣譜殺菌劑，大量用于造紙工業(yè)中的殺菌防霉[3-7]。異噻唑啉酮類防腐劑是一類非氧化性殺菌劑，能透過細(xì)胞膜和細(xì)胞壁進(jìn)入菌體分子，并與菌體分子內(nèi)含有巰基的成分發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]。但是異噻唑啉酮類防腐劑具有一定的細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性，能引起接觸性皮炎[9-12]，因此各國紛紛立法限制其使用[13]，限制使用的異噻唑啉酮類防腐劑共有5種：2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MI）、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（CMI）、1，2-苯并異噻唑啉-3-酮（BIT）、2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮（OI）和4，5-二氯-2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮（DCOI）。紙質(zhì)食品接觸材料在生產(chǎn)加工過程中如果殘留有異噻唑啉酮類防腐劑，當(dāng)其與食品長時(shí)間接觸時(shí)，就會轉(zhuǎn)移至食品中，污染食品，并最終隨食品攝入而進(jìn)入人體，危害人體健康。因此，有必要對紙質(zhì)食品接觸材料中異噻唑啉酮類防腐劑的殘留量進(jìn)行監(jiān)控。

本文采用超聲萃取技術(shù)提取紙質(zhì)食品接觸材料中的異噻唑啉酮類防腐劑，提取產(chǎn)物進(jìn)行超高效液相色譜/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)量（UPLC/Orbitrap HRMS）分析，從而建立了一種快速測定紙質(zhì)食品接觸材料中異噻唑啉酮類防腐劑含量的液質(zhì)聯(lián)用方法，并用于市售產(chǎn)品的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

5210超聲波清洗器（美國Bransonic公司）；Dionex Ultimate 3000-Q Exactive超高效液相色譜/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司）；0.22 μm濾膜（德國CNW技術(shù)公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；氮吹儀（北京康林科技有限責(zé)任公司）；SmarVaporRE501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Dechem-Tech公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品CMI（純度99.0%），由德國Dr.Ehrenstorfer GbmH公司提供；BIT（純度99.2%）、MI（純度100.0%）、OI（純度 99.9%），均由美國 Sigma-Aldrich公司提供；DCOI（純度99.8%），由日本東京化成株式會社提供。用甲醇配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液，其中MI、CMI、BIT、OI和 DCOI的質(zhì)量濃度分別為 4.844、4.854、4.814、4.858和4.896 μg/mL。使用時(shí)，用甲醇逐級稀釋成標(biāo)準(zhǔn)溶液工作液。

甲醇（色譜純），由美國Tedia公司提供；甲酸（純度98.0%），由德國CNW技術(shù)公司提供；分析純試劑均由廣州化學(xué)試劑廠提供，實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Q純水系統(tǒng)處理的二級水。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.0 g剪碎后的樣品，置于150 mL磨口錐形瓶中，加入20 mL甲醇，溫度45℃下超聲萃取30 min，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，轉(zhuǎn)移至氮吹儀中，用干燥氮?dú)饩徛蹈?，? mL甲醇溶解殘留物，所得溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行UPLC/Orbitrap HRMS分析。必要時(shí)，先進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

1.3 陽性樣品的制備

ZK1號孔共進(jìn)行了多次系統(tǒng)測溫，終孔時(shí)系統(tǒng)測溫結(jié)果顯示，孔內(nèi)水溫由22.9 ℃逐步增加至68.7 ℃(測溫段為孔深5～870 m，每5m測量一次)，測溫曲線呈“分段線性遞增”，見圖1，其中孔深70～480 m地溫梯度約每100 m 6.15 ℃，孔深480～600 m地溫梯度約每100 m 5.12 ℃，孔深600～830 m地溫梯度約每100 m 4.61 ℃，孔深830～870 m地溫梯度約每100 m 2.5 ℃，全孔地溫梯度整體較高，雖然深部830～870 m地溫梯度有所降低，該測溫段僅有40 m厚，不具有代表性，也有可能往深部地溫梯度回升。

將市售紙質(zhì)食品接觸材料剪碎，在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中密閉浸泡24 h，取出后晾干。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜分離在Hypersil GOLD色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）上進(jìn)行，流速為0.3 mL/min，流動相為甲醇（A）-φ（甲酸）=0.1%水溶液（B），采用梯度洗脫模式，0.00 min時(shí)，流動相為40%A/60%B（V/V），1.90 min時(shí)，流動相線性遞變?yōu)?0%A/10%B（V/V），該流動相保持至6.00 min，6.01 min時(shí)，流動相變?yōu)?0% A/60%B（V/V），并保持至9.00 min；色譜柱溫度為40℃，樣品室溫度為7℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件

可加熱的電噴霧離子源，采用正離子電離（ESI+）模式，噴霧電壓為3 500 V，毛細(xì)管溫度為320℃，輔助氣加熱溫度為350℃；鞘氣流速為30 mL/min，輔助氣流速為10 mL/min；采用全掃描方式，掃描范圍為m/Z100～300；離子提取窗口寬度為5×10-6。表1給出了5種異噻唑啉酮類防腐劑的質(zhì)譜分析參數(shù)。

表1 5種異噻唑啉酮類防腐劑的質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲萃取條件的優(yōu)化

通過對市售紙質(zhì)食品接觸材料中的異噻唑啉酮類防腐劑含量的監(jiān)測，未發(fā)現(xiàn)陽性樣品，因此以自制的陽性樣品來進(jìn)行萃取條件的優(yōu)化。

超聲萃取效率受萃取溫度、萃取時(shí)間和萃取溶劑種類及溶劑用量影響，以甲醇為萃取溶劑，分別考慮萃取時(shí)間（因素A）、萃取溫度（因素B）和萃取溶劑用量（因素C）對超聲萃取效率的影響，以5種異噻唑啉酮類防腐劑的總萃取量作為判斷萃取效果的依據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)萃取時(shí)間為30 min、萃取溫度為45℃、萃取溶劑體積為20 mL時(shí)，總萃取量分別達(dá)到最大值。為考慮這3個因素的綜合影響，按表2設(shè)計(jì)進(jìn)行了正交試驗(yàn)，測定每個條件下各目標(biāo)化合物的萃取量及總萃取量，并根據(jù)總萃取量計(jì)算各因素的k值、極差和最優(yōu)方案。

表2的數(shù)據(jù)表明，萃取時(shí)間（因素A）對總萃取量影響最大，其次是萃取溶劑用量（因素C），萃取溫度（因素B）影響最小，確定的優(yōu)方案為A1B1C1。根據(jù)此方案，分別以甲醇、二氯甲烷、乙醇、三氯甲烷、乙腈、叔丁基甲醚、丙酮/二氯甲烷（1∶1，V/V）、丙酮、丙酮/正己烷 （1∶1，V/V）和石油醚等10種常見溶劑為萃取溶劑，對自制陽性樣品進(jìn)行萃取，測定各組分的萃取量，并計(jì)算總萃取量，結(jié)果見表3。

從表3數(shù)據(jù)可知，甲醇的萃取效果最好。超聲萃取條件最終優(yōu)化如下：以20 mL甲醇為萃取溶劑，溫度45℃下超聲萃取30 min。

2.2 分析條件的優(yōu)化

液質(zhì)分析時(shí)通常使用甲醇/水和乙腈/水2種流動相，分別采用這2種流動相對5種異噻唑啉酮類防腐劑進(jìn)行分離，結(jié)果均能將各組分完全分離，但使用甲醇/水作為流動相時(shí)，各組分的信號明顯較強(qiáng)，故選擇甲醇/水作為流動相。在水中加入一定濃度的甲酸可促進(jìn)離子化，改善譜峰的形狀，并進(jìn)一步增強(qiáng)信號強(qiáng)度[24]。在水中添加0.05%～1.00%體積分?jǐn)?shù)的甲酸，觀察各組分提取離子色譜峰面積的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲酸加入量為0.1%體積分?jǐn)?shù)時(shí)，提取離子色譜峰總面積最大。因此，選擇甲醇-φ（甲酸）=0.1%水溶液作為流動相。改變流動相的初始組分和洗脫梯度，觀察各提取離子色譜峰面積的變化以及各組分間的分離度變化，最終確定的色譜分離條件（見1.4.1）。在此條件下對5種異噻唑啉酮類防腐劑法混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，得到圖1所示的總離子流圖。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果和極差分析

表3 不同溶劑的萃取效果 mg/kg

圖1 5種異噻唑啉酮類防腐劑的總離子流圖

2.3 方法的線性關(guān)系和檢出限

用甲醇將混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液逐級稀釋，配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上述方法進(jìn)行測定，用各組分提取離子色譜峰面積對其質(zhì)量濃度作圖，結(jié)果表明，5種異噻唑啉酮類防腐劑的提取離子色譜峰面積在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均與其質(zhì)量濃度線性相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.998。表4給出了5種異噻唑啉酮類防腐劑的保留時(shí)間（tR）及線性關(guān)系。按信噪比（S/N）為3確定各組分的檢出限，也列于表4中。

2.4 方法的回收率和精密度

以不含目標(biāo)分析物的白紙為空白基質(zhì)，按表5分別添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備3個不同添加濃度水平的加標(biāo)測試樣，每個添加濃度水平均制備9個平行樣，按上述方法進(jìn)行測試，計(jì)算方法的平均加標(biāo)回收率和精密度[以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

由表5可見，方法的平均加標(biāo)回收率為81.8%～94.5%，精密度為3.6%～9.8%。

表4 方法的線性關(guān)系和檢出限

表5 方法的加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

2.5 實(shí)際樣品測試

采用本文建立的方法對市售紙質(zhì)食品接觸材料進(jìn)行測試，測試樣品中包括快餐包裝紙盒、方便面包裝紙盒、紙杯、包裝紙袋、快餐紙墊、水果包裝紙箱和蛋糕包裝紙盒等7類共56個樣品，測試結(jié)果均小于0.1 μg/kg，低于方法檢出限。

3 結(jié)束語

建立了一種快速測定紙質(zhì)食品接觸材料中5種異噻唑啉酮類防腐劑含量的分析方法，該方法以甲醇為萃取溶劑，超聲萃取紙質(zhì)食品接觸材料中的異噻唑啉酮類防腐劑，萃取液經(jīng)濃縮定容后進(jìn)行UPLC/ Orbitrap HRMS分析，外標(biāo)法定量。該方法分析耗時(shí)短，定性可靠，定量準(zhǔn)確，靈敏度高，檢出限低至0.1 μg/kg，完全滿足異噻唑啉酮類防腐劑檢測的技術(shù)要求，適用于紙質(zhì)食品接觸材料中異噻唑啉酮類防腐劑含量的測定。

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Rapid Determination of Five Isothiazolinone Preservatives in Paper Packaging Materials Intended to Come into Contact with Foodstuffs by UPLC/Orbitrap HRMS

WANG Cheng-yun1，LIU Bin-bin1，YIN Li-juan1，LIN Jun-feng1，SHEN Ya-wen2
（1.Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen 518067，China；2.College of Chemistry and Environmental Engineering，Shenzhen University，Shenzhen 518060，China）

An effective method was established for rapid determination of five isothiazolinone preservatives in paper packaging materials intended to come into contactwith foodstuffs using ultra-high performance liquid chromatography/orbitrap high resolution mass spectrometry（UPLC/Orbitrap HRMS）technique.Isothiazolinone preservatives in paper packaging materials intended to come into contact with foodstuffs were ultrasonically extracted by using methanol as the extraction solvent.The extract was concentrated and analyzed by UPLC/Orbitrap HRMS.The chromatographic separation of five isothiazolinone preservatives was performed on a Hypersil GOLD column（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）with a gradient elution of methanol and 0.1%（volume）aqueous formic acidsolution.Five isothiazolinone preservatives were detected by orbitrap HRMS in ESI positive mode.Full-scan experiment was performed in the range fromm/Z100 tom/Z300.Five isothiazolinone preservatives were routinely detected with mass accuracy error below 2×10-6.The qualitative analysis was carried out by the retention time and the exact mass of quasi-molecularion.The quantitative analysis was carried out by the peak area external standards in extracted chromatograms.The correlation coefficients（r）were all larger than 0.998，and the limits of detection（LODs）were 0.1 μg/kg for all five isothiazolinons in the range from 0.2 μg/L to 100.0 μg/L.The blank samples were spiked at three different spiked levels and the spiked average recoveries varied from 81.8%to 94.5% while the relative standard deviation（RSD）varied from 3.6%to 9.8%.The proposed method was reliable，accurate and sensitive，and could completely satisfy the demand on the analysis of isothizolinones in paper packaging materials intended to come into contact with foodstuffs.

ultra-high performance liquid chromatography/orbitrap high resolution mass spectrometry；paper packaging materials intended to come into contact with foodstuffs；isothiazolinne；ultrasonic extraction；rapid determination

O657.7+2

A

1007-2225（2016）05-0024-06

王成云先生（1969-），博士，研究員；主要從事輕紡產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)分析；E-mail：wangchengyun 2009@126.com。

2016-08-09（修回）

深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（SZ2014102）

本文文獻(xiàn)格式：王成云，劉彬彬，尹麗娟，等.超高效液相色譜/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速測定紙質(zhì)食品接觸材料中的5種異噻唑啉酮類防腐劑[J].造紙化學(xué)品，2016，28（5）:24-29.