王回 石晶 卞合濤 閆中瑞

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是目前認為是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其臨床特征為進行性記憶喪失、行為與學(xué)習(xí)障礙和認知功能障礙，老年人中最常見的癡呆癥[1-3]。AD的病理特征包括細胞外以β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積為核心老年斑、細胞內(nèi)聚集的神經(jīng)纖維纏結(jié)、tau蛋白過度磷酸化、突觸功能障礙以及顳葉神經(jīng)元喪失為主[1-3]。目前，對于AD尚沒有效的治療方法。其中細胞移植替代丟失的神經(jīng)元使之功能恢復(fù)為AD等神經(jīng)變性疾病的治療提供了一個嶄新的思路。

一、骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 的概述。

BMSCs具有自我復(fù)制及分化潛能。這些細胞表達間充質(zhì)細胞或內(nèi)皮細胞標志物以及粘附分子，如CD105、CD73、CD90、CD106、CD166、CD29，但不表達造血干細胞標志物，如CD11、CD14、CD34、CD45、CD79，CD19和HLA-DR等。近年來很多研究表明BMSCs在體內(nèi)外由多種因子誘導(dǎo)下可以跨胚層向神經(jīng)樣細胞分化[4]。BMSCs治療AD似乎是一個非常有吸引力的選擇。BMSCs移植治療一般來自自體組織，無倫理爭議。BMSCs具有體外很容易培養(yǎng)、擴增簡單、免疫原性弱、安全性好和基因突變性弱等優(yōu)點，被認為是細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病理想的種子細胞[4，5]。

二、BMSCs移植方法

目前BMSCs移植多在動物實驗，使用Aβ、藥物及轉(zhuǎn)基因技術(shù)制作AD動物模型，移植方法有立體定向途徑，直接注入病變部位。經(jīng)靜脈移植途徑，創(chuàng)傷小、風(fēng)險低易操作，但有部分細胞滯留在外周器官，到達病灶的細胞量偏少，還有側(cè)腦室注射、動脈移植、腰椎穿刺移植、鼻內(nèi)移植等移植方法，在動物模型中以側(cè)腦室、靜脈移植使用較多。其中經(jīng)鼻內(nèi)途徑移植作為一種新興的移植手段越來越受到關(guān)注,為非侵害性的方法，因鼻部解剖結(jié)構(gòu)距離腦部較近，移植細胞不必經(jīng)過較長的路徑即可接近腦組織，而且腔黏膜具有豐富的血管和淋巴管，吸收面積大，具有進入顱內(nèi)的便利條件[6-9]。直接移植BMSCs可以遷移到病灶，Li等[10]將PKH26標記BMSCs經(jīng)尾靜脈注射AD大鼠14 d后，在大鼠海馬區(qū)可以發(fā)現(xiàn)PKH26陽性BMSCs，在AD動物模型中的 PKH26陽性細胞明顯多于正常對照組。說明移植BMSC不僅能通過血腦屏障，而且能在AD大鼠海馬存活，并能改善AD大鼠的學(xué)習(xí)障礙。另外移植經(jīng)基因修飾過BMSCs，或者在體外誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)細胞再植入大腦，可提高移植BMSCs存活率，并提供多種免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護作用[11]。較早期時Kopen 等[12]在新生鼠側(cè)腦室內(nèi)注入標記的BMSCs后，發(fā)現(xiàn)逐漸遷移至小腦及前腦并表達膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fiber acidic protein，GFAP)，GFAP主要存在于星形細胞內(nèi)，提示BMSCs有分化為神經(jīng)細胞的功能。隨后Deng等[13]報道在體外成功將人BMSCs定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細胞。

三、BMSCs可分化為神經(jīng)細胞

理論上在體外將BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞，再移植入AD動物模型腦內(nèi)可避免外BMSCs不恰當(dāng)分化，提高存活率，體外實驗常用抗氧化劑、神經(jīng)細胞生長因子、神經(jīng)細胞共培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染、中藥制劑等定向分化誘導(dǎo)方法[11-16]。Joe等[14]近期使用白藜蘆醇誘導(dǎo)可促進人BMSCs分化為神經(jīng)元，經(jīng)其處理的BMSCs顯著增加表達神經(jīng)前體細胞標記物巢蛋白、CD133和 GFAP。這種作用是通過去乙?；敢种苿〆x527處理后消失，其機制可能是白藜蘆醇激活乙?；浮０邹继J醇有抗氧化、抗自由基、抗菌、抗癌的等多種藥理生物活性作用。抗氧化劑咯利普蘭抑制抑制磷酸二酯酶4 (phosphodiesterases 4，PDEs4)可促進人BMSCs分化為神經(jīng)元，其通過抑制PDEs4的活性，增加細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine phosphate, cAMP)濃度，可以促進軸突的伸長，促進神經(jīng)元的修復(fù)[15]。近期一項研究，粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)聯(lián)合缺氧預(yù)處理可調(diào)節(jié)提高BMSCs的增殖、神經(jīng)分化和遷移能力，提高移植細胞的存活率[16]，G-CSF是臨床上常用的藥物，具有促進細胞增殖和分化等重要藥理作用。缺氧預(yù)處理BMSCs及使用抗炎、抗氧化等藥物培養(yǎng)BMSCs可能成為未來細胞移植治療AD的一個新的方法。

四、BMSCs減少可AD腦內(nèi)Aβ沉積并逆轉(zhuǎn)AD病理變化

既往研究AD動物模型海馬區(qū)Aβ的減少可能預(yù)防和治療AD[3]。Lee等[17]通過將BMSCs直接注射在AD動物模型海馬齒狀回附近有效減少腦組織Aβ累積，這表明BMSCs具有清除Aβ沉積和/或阻斷Aβ沉積形成。Babaei等[18]觀察到腦移植BMSCs可改善淀粉樣前體蛋白和早老素雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型的認知功能。此外，發(fā)現(xiàn)在移植BMSCs的小鼠大腦內(nèi)tau蛋白過度磷酸化水平降低，其中tau蛋白過度磷酸化被認為是AD的病理特征。同時證明腦內(nèi)注射骨髓的MSCs也改善化學(xué)劑和年齡誘導(dǎo)的AD模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶[18]。此外，Kim等[19]研究發(fā)現(xiàn)在人臍帶血來源的間充質(zhì)干細胞和小膠質(zhì)細胞的作用下釋放細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule, sICAM-1)，誘導(dǎo)Aβ降解酶的表達，提示這是間充質(zhì)干細胞參與誘導(dǎo)Aβ降解的一種機制。Bae等[20]研究也證實BMSCs降低腦內(nèi)Aβ沉積，同時發(fā)現(xiàn)在AD患者的大腦蛋白動力蛋白1和突觸蛋白1的表達通常會下降，在BMSCs治療AD動物模型的大腦則增加，這兩種蛋白是神經(jīng)突觸傳遞的關(guān)鍵蛋白，對維持突觸的功能用重要意義。最近一項研究，在APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠經(jīng)尾靜脈注入BMSCs 28 d后，海馬區(qū)Aβ斑塊面積減少，發(fā)現(xiàn)斑塊數(shù)量增加與降低BMSCs治療量相關(guān)，表明靜脈全身移植BMSCs可降解Aβ和減輕Aβ的神經(jīng)毒性，逆轉(zhuǎn)AD的病理進展[21]。Liu等[22]采用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，將反義寡核苷酸937修飾的BMSCs移植AD小鼠，顯著降低Aβ沉積，增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor， BDNF)表達的水平，智能及行為學(xué)檢測BMSCs治療組AD小鼠認知功能與對照組明顯改善，水迷宮檢測提示AD小鼠記憶力提高，同時檢測到Brn-4蛋白水平升高，提示經(jīng)修飾過的BMSCs移植可大幅提高對AD的治療效果，可能通過的提高Brn-4蛋白表達水平。目前研究認為Brn-4是一種轉(zhuǎn)錄因子，可參與神經(jīng)細胞生長和分化，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[23]。

五、BMSCs參與調(diào)控小膠質(zhì)細胞的激活及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)

很多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Aβ可引發(fā)小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)，炎癥反應(yīng)已證明在AD的病理進展中有重要作用[3]， Babae等[17]發(fā)現(xiàn)移植后的AD小鼠動物模型海馬區(qū)Aβ沉積的減少伴隨著小膠質(zhì)細胞的激活，小膠質(zhì)細胞常常出現(xiàn)在Aβ沉積的附近，提示BMSCs在以小膠質(zhì)細胞激活為主的炎癥反應(yīng)過程中扮演重要角色。早期時Malm等[24]等發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子從而起到神經(jīng)保護作用，此外它還通過吞噬作用消除腦內(nèi)Aβ沉積。最近Naaldijk等[21]將BMSCs經(jīng)小鼠尾靜脈移植后，皮層的小膠質(zhì)細胞數(shù)量、大小減少，檢測到腫瘤壞死因子α，白介素-6、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein, MCP-1)和神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor， NGF)基因表達降低。另外，發(fā)現(xiàn)IL-10、趨化因子CCR5、BDNF、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)的表達沒有變化，海馬區(qū)Aβ斑塊體積縮小。此研究結(jié)果推測BMSCs移植可能通過對小膠質(zhì)細胞激活的免疫調(diào)節(jié)作用改變AD的病理變化[21]。同時觀察到BMSCs治療后的小鼠皮層前列腺素E2受體(prostaglandin E2 receptor, PTGER2)表達減少，而在海馬區(qū)則增加。標志著BMSCs調(diào)節(jié)腦內(nèi)炎癥及免疫作用的復(fù)雜性[21]。具體機制和原因還需要進一步的研究。PTGER2有神經(jīng)毒性，早期研究Yang等[25]發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶-2(cyclooxgenase 2，COX-2)和前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)可能參與IL-13誘導(dǎo)活化的小膠質(zhì)細胞死亡，推測是神經(jīng)炎癥的消除和結(jié)局的一種內(nèi)源性機制。

六、BMSCs的神經(jīng)保護作用

早期研究發(fā)現(xiàn)BSMCs或其上層清液可以顯著提高神經(jīng)細胞的存活率和抑制細胞凋亡[26，27]。Hokari等[28]發(fā)現(xiàn)BMSCs可以旁分泌BDNF、VEGF、胰島素樣生長因子-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β1等因子，推測神經(jīng)因子作為胞外的分子信號進一步發(fā)揮修復(fù)神經(jīng)元作用及調(diào)節(jié)BMSCs的分化。在AD神經(jīng)元BDNF和磷酸化酪氨酸蛋白激酶B(phosphorylated tyrosine kinase B, pTrkB)減少，提示在AD神經(jīng)元的Aβ過度產(chǎn)生可能會觸發(fā)細胞死亡信號通路，部分是通過下調(diào)BDNF/TrkB信號通路中的TrkB而激活的[11]。其中BDNF是腦內(nèi)最普遍的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對認知、學(xué)習(xí)和記憶的形成起著至關(guān)重要的作用，可促進神經(jīng)再生和突觸的形成，降低氧化應(yīng)激和抑制細胞凋亡等[29]。Song等[11]檢測到AD神經(jīng)元突觸損傷時，線粒體功能障礙和缺乏生長因子，如NGF、BDNF，致使神經(jīng)元細胞活力和突觸完整性下降，經(jīng)移植BDNF修飾的BSMCs后，可以通過BSMCs對提供持續(xù)的BDNF并促進受損神經(jīng)元和突觸修復(fù)，增強BSMCs的治療作用，逆轉(zhuǎn)AD的病理改變，BSMCs表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)保護作用。Zhang等[30]發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35處理后在PC12細胞內(nèi)瞬變軸突糖蛋白1 (transient axonal glycoprotein-1, TAG1)基因表達上調(diào)，Aβ前體蛋白(Amyloid β precursor protein, APP)和APP胞內(nèi)剪切片段(APP intracellular domain, AICD)也上調(diào)，提示TAG1/APP/AICD途徑在AD發(fā)展中起重要的作用，BSMCs可降低TAG1、AICD、p53、APP表達水平，并且降低凋亡相關(guān)蛋白Bax和升高抗凋亡因子Bcl-2的表達水平，降低半胱天冬酶3 (caspase 3)活性，半胱天冬酶是細胞凋亡中的重要分子，提示阻斷AICD/p53/Bax/Caspase 3信號通路可以抑制細胞凋亡。BSMCs保護神經(jīng)細胞抑制其凋亡作用，可能通過調(diào)控TAG1/APP/AICD信號通路有關(guān)[30]，此外Aβ降解酶依賴AICD通路[31]的調(diào)控。APP信號通路在AD病程發(fā)展中有重要作用，AICD可以成為治療AD的新靶點[32]。

七、BMSCs與外泌體

外泌體為細胞分泌的膜狀結(jié)構(gòu)，可細胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中，其功能是細胞間的信息交流載體，不同的組織的外泌體不僅具有其特異性蛋白分子，而且還包含其行使功能的關(guān)鍵分子，如mRNA和miRNA，以及功能蛋白，目前具體機制不明確，近年來成為研究熱點[33]。BMSCs外泌體內(nèi)還含有miR22、miR-1et-7a，這兩者也參與相關(guān)免疫通路。這些特性提示BMSCs在臨床上作為免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用，可促進神經(jīng)元的生長和存活，其調(diào)節(jié)作用可能是通過旁分泌機制介導(dǎo)的，BMSCs分泌外泌體具有調(diào)節(jié)靶細胞RNA、mRNA、蛋白質(zhì)和脂類的功能，對AD等神經(jīng)退行性病變有潛在治療作用[33-35]。 近期Lopez等[34]研究顯示BMSCs來源的外泌體促進AD小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元的軸突生長。最近一項研究，Nakano等[36]在小鼠側(cè)腦室注射BMSCs的外泌體，治療后小鼠認知障礙得到改善，發(fā)現(xiàn)BMSCs及BMSCs來源的外泌體可抑制氧化應(yīng)激和增加神經(jīng)元突觸密度，認為BMSCs來源的外泌體可以恢復(fù)種原因引起神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞損傷，可能是BMSCs旁分泌機制介導(dǎo)的。

八、小結(jié)

AD患病率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅人們生活質(zhì)量，給社會和家庭帶來了沉重的負擔(dān)。BMSCs治療AD顯示發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。隨著研究機制逐漸明了，BMSCs 將在臨床治療AD等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮更大的作用。