何明駿 姚高峰 張理義 孔令明 牛威 陳升東 仲愛(ài)芳

精神分裂癥(schizophrenia，SZ)是一組病因未明的精神病，常伴有感知、思維、情感、行為等多方面的障礙和精神活動(dòng)不協(xié)調(diào)[1]。目前全球精神分裂癥患病率呈上升趨勢(shì)[2]。大多研究認(rèn)為精神分裂癥基于基因和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果[3]，所以研究者從不同角度展開(kāi)了精神分裂癥的致病因素探索，如依據(jù)神經(jīng)影像學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等技術(shù)對(duì)精神分裂癥病因?qū)W展開(kāi)探究[3-6]。有研究[7-10]證實(shí)了遺傳因素在精神分裂癥發(fā)病過(guò)程中的作用，但確切的分子遺傳機(jī)制尚不清楚，病因尚未明了[11]。2002年Okazaki等[12]首次發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，這是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200nt的RNA分子，廣泛存在于動(dòng)物，植物，酵母菌，甚至原核生物和病毒中[13-15]，通過(guò)結(jié)合啟動(dòng)子等方式來(lái)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[16,17]，并與MicroRNA相互作用發(fā)揮生物學(xué)功能[18]。故其在精神分裂癥中是否具備調(diào)控作用，值得進(jìn)一步探究。據(jù)報(bào)道[19]遺傳因素在精神分裂癥發(fā)生過(guò)程中占重要作用，高達(dá)70%～85%。迄今尚未見(jiàn)lncRNA與精神分裂癥，尤其與精神分裂癥陽(yáng)性、陰性癥狀量表關(guān)系的研究。

為此，我們采用lncRNA芯片技術(shù)在精神分裂癥患者中篩選出有差異表達(dá)的lncRNA，對(duì)其中有差異表達(dá)的lncRNA采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)進(jìn)行驗(yàn)證，并使用陽(yáng)性與陰性癥狀量表(positive and negative symptom scale, PANSS)對(duì)臨床癥狀進(jìn)行評(píng)估與分析?，F(xiàn)報(bào)道如下。

資料和方法

一、 臨床資料

本研究獲得中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)臨床醫(yī)院第102醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所、有受試者或受試家屬(監(jiān)護(hù)人)均簽署知情同意書(shū)。

1.病例組：2012年8月至2014年6月于解放軍第102醫(yī)院門(mén)診以及精神科病房連續(xù)收治的患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國(guó)精神疾病診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第4版精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首發(fā)患者或入組前3個(gè)月未服抗精神病藥物。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他精神疾??；②患有腦外傷等軀體或神經(jīng)系統(tǒng)疾??；③有酗酒或藥物濫用史；④入組前1個(gè)月內(nèi)有輸血史；⑤入組前3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)無(wú)抽搐電休克治療者。共入組96例患者，其中男性46例，女性50例，年齡16～63歲，平均年齡(30.49±5.38)歲。

2.對(duì)照組：來(lái)自解放軍第102醫(yī)院工作人員、健康體檢人員。納入標(biāo)準(zhǔn):①無(wú)精神疾病家族史；②近1個(gè)月內(nèi)無(wú)重大創(chuàng)傷事件；③近1月內(nèi)無(wú)輸血史。共入組44例，其中男性21例，女性23例,年齡16～64歲，平均年齡(29.61±7.35)歲。

二、方法

1.研究工具

精神分裂癥PANSS：評(píng)定采用30個(gè)基本條目，組成3個(gè)分量表：陽(yáng)性、陰性和一般精神病理量表。每個(gè)條目均為7級(jí)評(píng)分，從1到7，按精神病理水平遞增排列。本研究中使用PANSS量表的中文版本進(jìn)行評(píng)估，該版本經(jīng)信效度檢驗(yàn)分析，達(dá)到心理測(cè)量學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[20]。

量表評(píng)估工作由3名精神科主治醫(yī)師或醫(yī)師專職進(jìn)行，評(píng)定前，3名醫(yī)師進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn)，統(tǒng)一指導(dǎo)語(yǔ)。量表由患者自行填寫(xiě)后當(dāng)場(chǎng)收回。

2.主要試劑和耗材

LowInput Quick-Amp Labeling Kit，one-color(24*)(Agilent，貨號(hào)：5190-2305)；Gene Expression Wash Pack(Agilent，5188-5327)；Gene Expression Hybridization Kit(5188-4242)；RNA Spike In Kit，one-color(5188-5327)；熒光定量PCR引物：Custom Plus TQMN RNA Assays (美國(guó)ABI公司)；熒光定量PCR試劑：TaqMan通用混合試劑盒Ⅱ(美國(guó)ABI公司，貨號(hào)：4440047)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：QuantiTect Rev. Transcription Kit (QIAGEN，貨號(hào)：205311)。

3.主要儀器

掃描儀(Affymetrix，Scanner 3000)；雜交爐(Affymetrix，Hybridization Oven 640)；洗滌工作站(Affymetrix，F(xiàn)luidics Station 450)；2100(Agilent，G2939A)；2100振蕩器(Agilent，9600)；NanoDrop(Thermo，2000)；PCR儀(ABI，9700)；離心機(jī)(eppendorf，5418)；濃縮儀(eppendorf，5301)；離心機(jī)(其林貝爾，LX-200)；離心機(jī)-1(其林貝爾，LX-300)；振蕩器-1(其林貝爾，GL-88B)；磁力攪拌器(其林貝爾，GL-3250B)；金屬浴-2(博日，HB-100)；金屬浴-3(博日，CHB-100)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備，XMTD-8222)；冰箱(榮事達(dá)，BCD-265F)；ABI9700型PCR儀(美國(guó)ABI公司)；天美CT14RD型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司)；NanoDrop1000超微量紫外分光光度計(jì)(附電腦1套)(美國(guó)Thermo公司)；ABI 7900HT Fast Read-Time PCR System(附電腦1套)(美國(guó)ABI公司)；WH-2微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；JS-400A恒溫金屬浴(上海培清科技有限公司)；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺(tái)(蘇凈凈化設(shè)備有限公司)；-81℃超低溫冰箱(日本三洋公司)。

4.基因芯片篩查、總RNA抽提與熒光定量PCR

基因芯片篩查：用Agilent Human lncRNA芯片,對(duì)SZ患者5例，正常對(duì)照5人，共10個(gè)樣本檢測(cè)和分析。樣品總RNA利用NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific)定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)檢測(cè)RNA完整性。RNA質(zhì)檢合格后，樣本的標(biāo)記、芯片的雜交以及洗脫參照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程。首先，總RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，再進(jìn)一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)標(biāo)記的cRNA。標(biāo)記好的cRNA和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)掃描得到原始圖像。

數(shù)據(jù)分析：采用Feature Extraction 軟件 (version10.7.1.1, Agilent Technologies)處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)。接著利用Genespring軟件(version 12.5; Agilent Technologies)進(jìn)行quantile標(biāo)準(zhǔn)化和后續(xù)處理。標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，用于比較的每組樣本中至少有一組100%標(biāo)記為“P”的探針留下進(jìn)行后續(xù)分析。利用t檢驗(yàn)的P值和倍數(shù)變化值進(jìn)行差異基因和差異lncRNA篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P<0.05。

總RNA抽提與熒光定量PCR：對(duì)芯片篩查結(jié)果中的10種差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行后續(xù)的PCR驗(yàn)證。所有被試使用EDTA抗凝管采肘靜脈血5 ml，采血后輕輕搖動(dòng)抗凝管使抗凝劑與血液混勻，所有血樣在采血后2 h內(nèi)進(jìn)行RNA提取。先將Ficoll-Paque PLUS液室溫(15～20℃)放置，所有離心過(guò)程也應(yīng)在室溫完成。取2 ml 乙二胺四乙酸抗凝血與等體積平衡液在15 ml離心管中用移液管(或移液器)充分混勻(總體積4 ml)。用針管抽取3 ml Ficoll Paque PLUS溶液到新的15 ml離心管中，輕輕用移液管(或移液器)沿管壁緩慢滴加準(zhǔn)備好的樣品(4 ml)于分層液面上，注意保持清楚的液面。室溫(18～20℃)以400×g離心30～40 min。用新移液管(或移液器)吸取最上層的血漿與血小板。將單核淋巴細(xì)胞置于凍存管中，-80℃保存?zhèn)溆?。由?shí)驗(yàn)員每天定時(shí)記錄冰箱溫度。TRIzol(Invitrogen?, USA )法提取出血液?jiǎn)魏肆馨图?xì)胞中的總RNA(包括lncRNA)，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaqMan RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國(guó)ABI公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)總體積為15 μl(總RNA5 μl，TaqMan MicroRNA Assay 3 μl, 核酸酶free水4.16 ul，RNase抑制劑0.19 μl，緩沖液1.5 μl，Multiscribe逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl和dNTP 0.15 μl)，在不同溫度下(16℃，42℃，85℃，4℃)進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)(30mins，30mins，5mins，10 mins)反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照TaqMan試劑盒(TaqMan通用混合試劑盒II，美國(guó)ABI公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增體系總體積為10 μl，反應(yīng)共40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)Ct值通過(guò)7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)測(cè)定，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)兩次。 使用SDS 2.4和DataAssist v3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取和分析，選擇β-Actin為內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)使用Excel 2010建立數(shù)據(jù)庫(kù)文件，以SPSS v17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以lncRNA與內(nèi)參β-Actin之間閾值環(huán)(threshold cycle, Ct)之差(ΔCt)表示lncRNA的相對(duì)表達(dá)水平。以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析病例組與對(duì)照組10種lncRNA是否有差異；lncRNA表達(dá)量與PANSS的關(guān)系用Pearson相關(guān)分析。所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精神分裂癥lncRNA芯片篩查結(jié)果

基因芯片結(jié)果顯示，125種非編碼RNA的表達(dá)在精神分裂癥患者和正常人之間存在差異。表1列出了本研究中用于PCR驗(yàn)證的10種LncRNA的芯片篩查結(jié)果，其中5種表達(dá)上調(diào)，5種下調(diào)。

二、病例組和對(duì)照組lncRNA比較

病例組外周血單核細(xì)胞中4種lncRNA(PR1、PR4、PR6和PR7)表達(dá)水平顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=-2.460～-2.038，P<0.05)，見(jiàn)表2。

三、病例組lncRNA與PANSS量表分的相關(guān)分析

精神分裂癥中有差異表達(dá)的lncRNA與精神分裂癥陽(yáng)性、陰性癥狀量表分的相關(guān)分析顯示，有差異表達(dá)的PR1～PR10均與精神分裂癥陽(yáng)性癥狀量表分顯著正相關(guān)(r=0.231～0.276,P均<0.05)，見(jiàn)表3。

四、病例組lncRNA與PANSS量表各癥狀群的相關(guān)分析

表4中精神分裂癥中有差異表達(dá)的lncRNA與精神分裂癥各因子分的相關(guān)分析提示，有差異表達(dá)的PR1～PR10均與激活性顯著正相關(guān)(r=0.243～0.352,P均<0.05);PR2、PR5、PR8、PR9及PR10與偏執(zhí)顯著正相關(guān)(r=0.201～0.223,P<0.05);PR1～PR10均與攻擊性顯著正相關(guān)(r=0.207～0.259,P<0.05)

五、病例組lncRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組陽(yáng)性、陰性癥狀的比較

計(jì)算出研究對(duì)象NONHSAT089447、NONHSAT021545和NONHSAT041499表達(dá)水平的四分位數(shù)，將表達(dá)水平低于或等于第一四分位數(shù)(QL=P25)者歸于各自的低表達(dá)組，高于或等于第三四分位數(shù)(QU=P75)者歸于各自高表達(dá)組，對(duì)高表達(dá)與低表達(dá)組的陽(yáng)性、陰性癥狀進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NONHSAT021545、NONHSAT041499高表達(dá)組的激活性和攻擊性得分顯著低于低表達(dá)組(P均<0.05)，其他認(rèn)知因子在lncRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5。

表1 芯片中篩查中差異表達(dá)的10種lncRNA

注：lncRNA為長(zhǎng)鏈非編碼RNA

表2 病例組與對(duì)照組lncRNA比較(ΔCt±SD)

注:PR1=ENST00000394742,PR2=TCONS_l2_00025502,PR3=NONHSAT098126,PR4=NONHSAT089447,PR5=ENST00000563823,PR6=NONHSAT021545,PR7=NONHSAT041499,PR8=ENST00000521622,PR9=TCONS_l2_00021339,PR10=NONHSAT104778，lncRNA為長(zhǎng)鏈非編碼RNA

表3病例組lncRNA與PANSS量表分的相關(guān)分析(n=96)

lncRNA陽(yáng)性量表陰性量表一般病理量表復(fù)合量表ENST000003947420.244a-0.004-0.006 0.000TCONS_l2_000255020.276b-0.019-0.023 0.014NONHSAT0981260.252a 0.012-0.026-0.006NONHSAT0894470.258a-0.009-0.018 0.030ENST000005638230.257a 0.011-0.007 0.030NONHSAT0215450.249a-0.025-0.027 0.008NONHSAT0414990.231a 0.002 0.011-0.041ENST000005216220.247a 0.007 0.020 0.028TCONS_l2_000213390.260a 0.009 0.002 0.055NONHSAT1047780.247a-0.007-0.006 0.021

注：aP<0.05，bP<0.01;lncRNA為長(zhǎng)鏈非編碼RNA，PANSS為陽(yáng)性與陰性癥狀量表

表4 病例組lncRNA與PANSS量表各癥狀群的相關(guān)分析(n=96)

注：aP<0.05，bP<0.01;PR1=ENST00000394742, PR2=TCONS_l2_00025502, PR3=NONHSAT098126, PR4=NONHSAT089447, PR5=ENST00000563823, PR6=NONHSAT021545, PR7=NONHSAT041499, PR8=ENST00000521622, PR9=TCONS_l2_00021339, PR10=NONHSAT104778,lncRNA為長(zhǎng)鏈非編碼RNA，PANSS為陽(yáng)性與陰性癥狀量表

討 論

精神分裂癥的病因不明，目前診斷精神分裂癥仍以精神癥狀的判定為主要依據(jù)。由于判定標(biāo)準(zhǔn)的主觀性太大，難免會(huì)造成精神分裂癥的誤診或漏診。尋求客觀的生物學(xué)診斷標(biāo)記一直是精神分裂癥診斷的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來(lái)對(duì)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行研究為精神疾病的治療提供了廣闊的空間[21,22]，其中有一些RNA已被證實(shí)與精神分裂癥有關(guān)，例如Gomafu/MIAT/Rncr2(一種lncRNA)參與精神分裂癥相關(guān)基因的細(xì)胞特異化、干細(xì)胞分化、選擇性剪接和神經(jīng)系統(tǒng)功能，其異常表達(dá)模式可能會(huì)導(dǎo)致某些神經(jīng)發(fā)育異常[23,24]。單純使用生物信息學(xué)的方法尋找lncRNA的靶基因，雖其預(yù)測(cè)特異性和敏感度較高，但預(yù)測(cè)結(jié)果的一致性往往較低，假陽(yáng)性率也較高[25]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)結(jié)合生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法，利用熒光定量 PCR 檢測(cè)過(guò)表達(dá)或干擾 lncRNA 后細(xì)胞中其靶基因RNA水平的變化, 從而確定 lncRNA與靶基因的相互作用關(guān)系。

基因芯片篩查結(jié)果表明lncRNA在精神分裂癥患者中存在明顯的差異表達(dá)，125種非編碼RNA在精神分裂癥患者與正常人之間存在差異，對(duì)其中的10種lncRNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，其中3種表達(dá)上調(diào)。這提示精神分裂癥可能涉及到lncRNA的異常表達(dá)。某些lncRNA定位于與精神疾病相關(guān)的染色體區(qū)域[26]，如Gomafu/MIAT/Rncr2[27,28]以細(xì)胞特異化、干細(xì)胞分化、選擇性剪接等方式參與精神分裂癥相關(guān)基因的表達(dá)，若異常表達(dá)，其可能會(huì)通過(guò)神經(jīng)發(fā)育異常最終誘發(fā)精神分裂癥。而本研究說(shuō)明在精神分裂癥患者中有異常表達(dá)的lncRNA，其在生理功能上可能存在一定的聯(lián)系，可能由于lncRNA可以影響到神經(jīng)元可塑性，例如Malat1與突觸形成相關(guān)，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和成熟中起到了重要作用，lncRNA的過(guò)度表達(dá)可能影響了神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育過(guò)程，并通過(guò)CNS與環(huán)境的交互作用，誘發(fā)精神分裂癥。目前如此lncRNA相關(guān)的疾病和功能方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，故是否確定其與精神分裂癥有關(guān)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

表5 病例組lncRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組陽(yáng)性、陰性癥狀的比較

注：lncRNA為長(zhǎng)鏈非編碼RNA

本結(jié)果顯示精神分裂癥中有差異表達(dá)的10種lncRNA均與精神分裂癥陽(yáng)性癥狀量表分呈正相關(guān)關(guān)系。精神分裂癥的發(fā)生和發(fā)展與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育障礙及損傷有明顯的關(guān)聯(lián)。神經(jīng)系統(tǒng)功能的行使主要依靠神經(jīng)通路，神經(jīng)通路是神經(jīng)系統(tǒng)功能的體現(xiàn)，而完整的神經(jīng)通路不僅僅需要神經(jīng)元細(xì)胞，更需要依賴傳遞過(guò)程中產(chǎn)生的一系列復(fù)雜動(dòng)態(tài)變化的介質(zhì)和信使。在對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的基因研究中發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA在特定的時(shí)間和空間進(jìn)行正確的表達(dá)則對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育可起到重要的作用，LncRNA作為非編碼RNA的重要組成部分參與了神經(jīng)元分化、腦發(fā)育、突觸可塑性。2014年首見(jiàn)報(bào)道精神分裂癥的靶基因相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)[29]，所以有關(guān)位點(diǎn)的功能尚不明確，看來(lái)其可能對(duì)精神分裂癥的陽(yáng)性癥狀起調(diào)控作用。但與陰性癥狀量表分相關(guān)性不顯著，這可能是由于陰性癥狀為精神分裂癥狀譜系的臨床特征，有更多的指向性，并非特異性癥狀，如分裂樣人格障礙、偏執(zhí)型人格障礙等[30]。

PANSS按癥狀群分可分為：反應(yīng)缺乏：由N1，N2，G7，G10組成；思維障礙：由P2，P3，P5，G9組成；激活性：由P4，G4，G5組成；偏執(zhí)：由P6，P7，G8組成；抑郁：由G1，G2，G3，G6組成；攻擊性：由P4，P7，G6，S1，S2，S3組成(P為陽(yáng)性癥狀量表因子，N為陰性癥狀量表因子，G為一般病理量表因子，S為復(fù)合量表因子)。表4表明，有差異表達(dá)的10種lncRNA均與激活性關(guān)系密切; TCONS_l2_00025502、ENST00000563823、ENST00000521622、TCONS_l2_00021339及NONHSAT104778與偏執(zhí)有顯著關(guān)聯(lián);這10種lncRNA均與攻擊性有關(guān)。從以上可推導(dǎo)出這幾種lncRNA對(duì)精神分裂癥癥狀群相關(guān)，并認(rèn)為lncRNA對(duì)精神分裂癥的各種癥狀起調(diào)控作用。目前對(duì)lncRNA表達(dá)水平與PANSS各癥狀群的關(guān)系尚缺乏充分認(rèn)識(shí)，但本研究的結(jié)果似可表明lncRNA廣泛參與精神分裂癥發(fā)生及發(fā)展的病理調(diào)節(jié)過(guò)程，未來(lái)研究可進(jìn)一步就lncRNA對(duì)癥狀的特異性和敏感性展開(kāi)深入探討，從而為精神分裂癥的診斷和個(gè)體化治療提供參考。

綜上所述，依據(jù)目前的研究，lncRNA與基因調(diào)節(jié)和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和修復(fù)過(guò)程作用顯著，精神分裂癥可能與lncRNA的異常表達(dá)有關(guān)，某些異常表達(dá)的lncRNA與特定的陽(yáng)性、陰性癥狀特征關(guān)系密切，似可作為精神分裂癥的一種生物學(xué)診斷指標(biāo)。