王希越, 高 鵬, 連麗麗, 婁大偉*, 許國(guó)旺(. 吉林化工學(xué)院, 吉林 吉林 30; . 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 603; 3. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市第六人民醫(yī)院, 遼寧 大連 60)

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(下)·研究論文

基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的高通量細(xì)胞表型分析方法

王希越1,2, 高 鵬2,3*, 連麗麗1, 婁大偉1*, 許國(guó)旺2
(1. 吉林化工學(xué)院, 吉林 吉林 132022; 2. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023; 3. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市第六人民醫(yī)院, 遼寧 大連 116021)

研究開發(fā)了一種基于96孔板培養(yǎng)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)的高通量細(xì)胞表型分析方法。該方法分別以48種物質(zhì)作為唯一能源對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng),利用GC-MS研究野生型和yfcC基因改造大腸桿菌對(duì)各物質(zhì)的分解代謝情況,實(shí)現(xiàn)高通量的細(xì)胞表型分析。結(jié)果顯示,野生型和yfcC基因過(guò)表達(dá)大腸桿菌對(duì)14種物質(zhì)的代謝能力有顯著差異,yfcC基因過(guò)表達(dá)大腸桿菌對(duì)甘氨酸和檸檬酸的代謝能力明顯強(qiáng)于野生型大腸桿菌,而對(duì)其他物質(zhì)的代謝能力較弱,我們推測(cè)可能是由于yfcC基因促進(jìn)乙醛酸代謝,導(dǎo)致yfcC過(guò)表達(dá)菌株對(duì)甘氨酸的代謝能力較強(qiáng);野生型和yfcC基因敲除大腸桿菌間分解有顯著差異的共16種物質(zhì),其中yfcC基因敲除大腸桿菌對(duì)丙氨酸、乳糖、肌醇和檸檬酸的代謝能力較強(qiáng)。該方法簡(jiǎn)單、高效,可以為未知基因功能研究提供更多代謝功能相關(guān)的參考數(shù)據(jù)。

氣相色譜-質(zhì)譜;高通量;表型;基因功能

在過(guò)去十幾年里,隨著基因測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,人們已經(jīng)完成了150多種生物全基因組測(cè)序,這些基因數(shù)據(jù)的獲得無(wú)疑加深了人們對(duì)生命科學(xué)的認(rèn)識(shí),但是測(cè)序完整的生物,即使是簡(jiǎn)單的細(xì)菌生物,目前仍有30%～40%的基因功能是未知的或僅分配了一個(gè)假設(shè)的功能[1]。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái),人們期望獲得更多基因的功能以深入探索生命科學(xué)的奧秘。表型是細(xì)胞在不同遺傳及環(huán)境條件下所表現(xiàn)出來(lái)的性狀,包括行為、個(gè)體形態(tài)、生長(zhǎng)、生理功能差異等等。表型是基因型與環(huán)境交互作用的最終表現(xiàn)形式,通常一個(gè)基因型的改變可能會(huì)使相應(yīng)個(gè)體中一個(gè)或多個(gè)表型發(fā)生變化,因此對(duì)基因型與表型之間關(guān)系的研究,是揭示未知基因功能的有效方法[2-5]。

表1 用于大腸桿菌培養(yǎng)的48種能源物質(zhì)Table 1 Forty-eight metabolites forE.coliculture

生物體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系需要一種“全局”分析技術(shù)。從細(xì)胞整體水平上了解其生理功能,能幫助我們更好地預(yù)測(cè)一些有意義的生物學(xué)結(jié)果,獲得基因功能相關(guān)的信息。利用DNA芯片和二維凝膠電泳分析方法可以獲得細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組(transcriptomics)和蛋白質(zhì)組(proteomics)的全局信息,近年提出利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究未知基因功能[6,7],但是某些沉默基因或蛋白質(zhì)翻譯后修飾問(wèn)題使轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平上基因功能的研究仍存在一定局限性。表型反映了基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果,所以基于細(xì)胞表型的全局分析方法在功能基因組學(xué)研究中變得越來(lái)越重要[8,9]。1989年,Bochner[10]首次提出一種利用微孔板技術(shù)實(shí)現(xiàn)高通量的全局細(xì)胞表型分析的方法。2001年,該研究團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),發(fā)明了表型微陣列(phenotype microarrays, PMs)方法來(lái)高通量地研究細(xì)胞表型[11]。這個(gè)方法利用細(xì)胞分解代謝各種碳源、氮源、磷、硫等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)產(chǎn)生自由電子,電子與四唑鹽染料發(fā)生還原反應(yīng)改變?nèi)玖项伾?通過(guò)OmniLog儀器自動(dòng)監(jiān)測(cè)記錄顏色變化情況來(lái)研究不同菌株的表型差異。該方法簡(jiǎn)單、快速,已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析,在研究不同菌株的細(xì)胞表型差異中得到廣泛應(yīng)用[12-16]。但是該法不能定量分析細(xì)胞對(duì)各物質(zhì)的利用程度差異,僅能得到有限的細(xì)胞代謝功能信息。

基因組中,yfcC基因在磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(pta)基因之后,編碼一功能未知的內(nèi)膜蛋白,我們前期研究發(fā)現(xiàn)yfcC可能促進(jìn)乙醛酸代謝[17]。本文利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)展了一種高通量細(xì)胞表型分析方法,并對(duì)yfcC基因改造過(guò)的大腸桿菌代謝表型差異進(jìn)行研究。該方法不僅可以實(shí)現(xiàn)PMs技術(shù)中的高通量分析,而且可以定量評(píng)價(jià)細(xì)胞對(duì)各物質(zhì)的代謝能力,獲得更多反映細(xì)胞分解代謝能力的數(shù)據(jù),為基因功能研究提供新的參考信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Shimadzu GC/MS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司); Labconco低溫真空離心濃縮儀(美國(guó)Labconco公司);高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司); ZHWY-211C恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱、ZHJH-1112超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器公司); LRH-150生化培養(yǎng)箱(上海一恒儀器公司)。

吡啶、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)、香草酸購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;48種標(biāo)準(zhǔn)品(見表1)包括糖類、糖醇、氨基酸、有機(jī)酸等,購(gòu)自Sigma-Aldrich公司、Alfa Aesar公司和百靈威公司;氯化鈉購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑公司;LB培養(yǎng)基購(gòu)自北京路橋技術(shù)公司;氯霉素、瓊脂粉購(gòu)自北京索萊寶科技公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水,由Milli-Q系統(tǒng)(Millipore Co., US)凈化。

1.2 實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1菌株及培養(yǎng)

AS 1.1566購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種寶藏中心,對(duì)其進(jìn)行基因重組后構(gòu)建細(xì)菌AS 1.1566/pBCTE(野生型菌,W)、AS 1.1566 ΔyfcC∶∶chl(yfcC基因敲除菌,Y-)、AS 1.1566/pBCTE-yfcC(yfcC基因過(guò)表達(dá)菌,Y+)。將甘油凍存的3株大腸桿菌放在LB培養(yǎng)基中,160 r/min、37 ℃條件下活化培養(yǎng)12 h,然后用含2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂粉的固體LB培養(yǎng)基進(jìn)行單菌落純化培養(yǎng),挑取單菌落于裝有已滅菌的10 mL生理鹽水的玻璃管中,通過(guò)麥?zhǔn)媳葷峁軐?duì)比,其含量為6×108細(xì)菌/mL。

將準(zhǔn)備好的菌液向96孔板的各孔中依次加入90 μL,因本研究中共有48種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),為方便操作,將對(duì)比菌株W和Y+、W與Y-成排交錯(cuò)加在同一板內(nèi)。48種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用高純水配制成5 mg/mL的貯存液,用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后,依次加入96孔板的各孔內(nèi),每孔加10 μL,不加任何其他營(yíng)養(yǎng)液,將96孔板置于37 ℃LRH-150生化培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)12 h。每株菌平行制作3個(gè)孔板。為防止重組菌質(zhì)粒丟失,各菌株在每種培養(yǎng)條件下均加入終濃度30 μg/mL的氯霉素。

1.2.2樣品前處理

在培養(yǎng)12 h的同株菌中每孔各定量取出20 μL菌液于1.5 mL離心管中,渦旋10 s混勻,15 000 r/min 4 ℃離心10 min,上清液再經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除殘留菌體,定量取出25%上清液于新的1.5 mL離心管中,同時(shí)加入5 μL 2 mg/mL香草酸作為內(nèi)標(biāo),放入低溫冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干。凍干樣品加50 μL吡啶溶解,渦旋10 s,加BSTFA 65 μL,超聲15 min使樣品充分溶解,75 ℃水浴條件下衍生45 min, 12 000 r/min 4 ℃條件下離心15 min,取上清液進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析,每個(gè)樣品平行分析3次。

1.2.3色譜條件

DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)(J&W, USA),載氣流量1.19 mL/min(氦氣,純度為99.999 6%),進(jìn)樣口溫度280 ℃,分流比10∶1,進(jìn)樣量1 μL,色譜柱升溫程序:70 ℃保持5 min, 5 ℃/min上升至280 ℃,保持5 min;質(zhì)譜條件:電子轟擊電離源,離子源溫度200 ℃,接口溫度280 ℃,檢測(cè)電壓1.1 kV,掃描范圍m/z33～600,掃描間隔0.5 s,溶劑切割時(shí)間7 min。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理:將采集得到的原始數(shù)據(jù)在GC-MS solution工作站中導(dǎo)成cdf格式,然后導(dǎo)入XCMS程序進(jìn)行濾噪、保留時(shí)間對(duì)齊、色譜峰匹配等處理[18]。XCMS主要參數(shù)設(shè)置如下:半峰寬(fwhm) 4 s,每個(gè)提取離子流中最大峰個(gè)數(shù)(max) 100,信噪比閾值(snthresh) 10,步長(zhǎng)(step)m/z0.1,色譜峰在樣品中占有的最小比例(minfrac) 0.25。

統(tǒng)計(jì)分析:XCMS得到的代謝物特征用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行歸一化,再用80%規(guī)則去除零值[19],偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)和S-Plot分析在SIMCA-P 11.0 (Umetrics, Umea, Sweden)軟件中完成;在PASW Statistics 18 (SPSS, Chicago, IL, USA)軟件中進(jìn)行非參數(shù)t檢驗(yàn);PLS-DA模型中，VIP (the variable importance in the project)>1且t< 0.05被認(rèn)為是顯著變化的物質(zhì);另外,為了減少差異物質(zhì)的假陽(yáng)性結(jié)果,用偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正[20,21]。篩選到的差異物質(zhì)柱狀圖在Graphpad軟件中繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS高通量分析結(jié)果

本工作中,96孔板各孔內(nèi)分別加一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后將各孔內(nèi)物質(zhì)混合制備分析樣品,利用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對(duì)各物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),實(shí)現(xiàn)高通量的細(xì)胞代謝表型分析。GC-MS分析得到的總離子流圖見圖1,從總離子流圖中可得到大腸桿菌對(duì)48種物質(zhì)分解代謝能力的信息。如果GC-MS分析結(jié)果顯示物質(zhì)的含量沒(méi)有明顯的變化,說(shuō)明細(xì)菌對(duì)該物質(zhì)分解代謝能力低或沒(méi)有代謝能力;如果物質(zhì)含量明顯降低,表明細(xì)菌對(duì)該物質(zhì)有很強(qiáng)的分解代謝能力。若擴(kuò)大能源物質(zhì)數(shù)量,利用GC-MS高通量技術(shù)進(jìn)行相對(duì)定量分析細(xì)菌對(duì)這些物質(zhì)的代謝能力,即可同時(shí)得到幾百種甚至更多代謝表型。相比于PMs分析方法,該方法可以更準(zhǔn)確地從物質(zhì)的量上反映細(xì)胞代謝表型特征。

圖1 GC-MS分析得到的野生型大腸桿菌(W菌)對(duì)48種物質(zhì)代謝的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the 48 metabolites achieved by GC-MS in wild-type E. coli (W strain) The labeled peaks were metabolites changed significantly. 1. Ala; 2. Gly; 3. oxalic acid; 4. Val; 5. Ile; 6. succinic acid; 7. itaconic acid; 8. fumaric acid; 9. 2,3-methysuccinic acid; 10. Thr; 11. 3-methylglutaric acid; 12. malic acid; 13. 4-AB; 14. xylitol; 15. homovanillic acid; 16. citric acid; 17. isocitric acid; 18. myo-inositol; 19. lactose.

圖2 W與yfcC基因敲除菌(Y-)的(a)PLS-DA得分圖及(b)相應(yīng)的S-plot圖和W與yfcC基因過(guò)表達(dá)菌(Y+)的(c)PLS-DA得分圖及(d)相應(yīng)的S-plot圖Fig. 2 (a) PLS-DA score plot and (b) S-plot between W and yfcC deletion mutant E. coli (Y-) strains, (c) PLS-DA score plot and (d) S-plot between W and yfcC over-expression mutant E. coli (Y+) strains

2.2 表型差異分析

將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)成cdf格式后,經(jīng)XCMS進(jìn)行峰過(guò)濾、鑒定、匹配等處理導(dǎo)成峰表,再經(jīng)初步處理后,導(dǎo)入SIMCA-P進(jìn)行PLS-DA模型分析,結(jié)果如圖2a、2c所示,模型參數(shù)分別為R2Y=0.995,Q2=0.98;R2Y=0.974,Q2=0.933, 999次隨機(jī)排列組合測(cè)試對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示模型沒(méi)有過(guò)擬合,說(shuō)明模型是可靠的。從圖2a、2c可以看出野生型(W)與yfcC基因過(guò)表達(dá)菌株(Y+)及yfcC基因敲除菌株(Y-)均能得到很好的區(qū)分,由此說(shuō)明遺傳改造后大腸桿菌的代謝表型發(fā)生了明顯的變化。為了找出對(duì)表型區(qū)分有顯著作用的物質(zhì),綜合S-plot和非參數(shù)顯著性分析來(lái)篩選潛在的差異物質(zhì)。S-plot圖(圖2b、2d)中紅色方框標(biāo)注的VIP > 1的變量經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)和偽錯(cuò)誤率校正后,p值小于0.05的被認(rèn)為是潛在的差異物質(zhì),經(jīng)NIST庫(kù)檢索及標(biāo)準(zhǔn)樣品驗(yàn)證,最終發(fā)現(xiàn)W與Y+間14種物質(zhì)的代謝能力有明顯的不同;W與Y-間分解代謝有顯著差異的有16種物質(zhì),結(jié)果見圖3。

圖3 W與(a) Y+和(b) Y-間有顯著差異的物質(zhì)Fig. 3 Metabolites changed significantly between W and (a) Y+ or (b) Y- strains Data were shown as mean±SEM (standard error of mean) (n=9).

從圖3a可以看出Y+對(duì)甘氨酸的代謝能力強(qiáng)于W,而對(duì)其他氨基酸的代謝能力較弱;甘氨酸通過(guò)脫氨可轉(zhuǎn)化成乙醛酸(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html),可能是Y+中乙醛酸途徑的加強(qiáng)促進(jìn)了甘氨酸的分解利用[17]。圖3a顯示Y+對(duì)檸檬酸的分解利用能力強(qiáng)于W,而對(duì)其他有機(jī)酸的分解能力均弱于W。同樣圖3b顯示Y-對(duì)丙氨酸、乳糖、肌醇和檸檬酸的代謝能力強(qiáng)于W,而對(duì)其他物質(zhì)的分解能力較弱。通過(guò)該方法同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)各物質(zhì)的分解代謝情況,實(shí)現(xiàn)高通量的代謝表型分析,可以為基因功能的研究提供新的考證資料,促進(jìn)未知基因功能的探索研究。

3 結(jié)論

本文建立了一種利用GC-MS技術(shù)高通量研究細(xì)胞代謝表型的分析方法,通過(guò)該方法高通量表征菌株對(duì)各類能源物質(zhì)分解利用能力的差異,獲得各菌株的表型特征,為未知基因功能的探索提供新的研究資料。該方法也可用于研究不同菌株對(duì)環(huán)境中污染物的降解能力,幫助篩選出高性能的菌株。相對(duì)于傳統(tǒng)的利用理化性質(zhì)或培養(yǎng)基的研究方法,該方法更加簡(jiǎn)單、快速、高效。但是由于GC-MS檢測(cè)技術(shù)的局限性,該方法僅能用于易揮發(fā)、熱穩(wěn)定好的物質(zhì)的分析,對(duì)此,今后的研究中可發(fā)展液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)來(lái)表征各物質(zhì)的分解代謝差異,結(jié)合GC-MS,擴(kuò)大物質(zhì)的檢測(cè)范圍,獲得更多的細(xì)胞代謝表型,進(jìn)而促進(jìn)該方法的應(yīng)用。

[1] Bork P. Genome Res, 2000, 10(4): 398

[2] Allen J, Davey H M, Broadhurst D, et al. Nat Biotechnol, 2003, 21(6): 692

[3] Sozzani R, Benfey P N. Genome Biol, 2011, 12(3): 219

[4] Raamsdonk L M, Teusink B, Broadhurst D, et al. Nat Biotechnol, 2001, 19(1): 45

[5] Yin W B, Baccile J A, Bok J W, et al. J Am Chem Soc, 2013, 135(6): 2064

[6] Zhou X J, Kao M-C J, Huang H, et al. Nat Biotechnol, 2005, 23(2): 238

[7] Wren J D. Bioinformatics, 2009, 25(13): 1694

[8] de Souza N. Nat Methods, 2010, 7(1): 36

[9] Rahaman M M, Chen D, Gillani Z, et al. Frontiers in Plant Science, 2015, 6. doi: 10.3389/fpls.2015.00619

[10] Bochner B R. Nature, 1989, 339(6220): 157

[11] Bochner B R, Gadzinski P, Panomitros E. Genome Res, 2001, 11(7): 1246

[12] Gupta K R, Kasetty S, Chatterji D. Appl Environ Microbiol, 2015, 81(7): 2571

[13] Zhou L, Lei X H, Bochner B R, et al. J Bacteriol, 2003, 185(16): 4956

[14] Ceapa C, Lambert J, van Limpt K, et al. Appl Environ Microbiol, 2015, 81(16): 5458

[15] Wang Y H, Guo Q L, Zhou F Z, et al. Journal of Microbes, Infections, 2016, 11(2): 94

王藝紅, 郭慶龍, 周鳳竹, 等. 微生物與感染, 2016, 11(2): 94

[16] Manganelli R, Khatri B, Fielder M, et al. PLoS One, 2013, 8(1): e52673

[17] Wang X Y, Xie Y P, Gao P, et al. Anal Biochem, 2014, 451: 48

[18] Smith C A, Want E J, O′Maille G, et al. Anal Chem, 2006, 78(3): 779

[19] Bijlsma S, Bobeldijk I, Verheij E R, et al. Anal Chem, 2006, 78(2): 567

[20] Storey J D. J Roy Stat Soc Ser B (Stat Method), 2002, 64(3): 479

[21] Storey J D, Taylor J E, Siegmund D. J Roy Stat Soc Ser B (Stat Method), 2004, 66(1): 187

High-throughput method for cell phenotype analysis bygas chromatography coupled with mass spectrometry

WANG Xiyue1,2, GAO Peng2,3*, LIAN Lili1, LOU Dawei1*, XU Guowang2
(1.JilinInstituteofChemicalTechnology,Jilin132022,China; 2.DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China; 3.DalianSixthPeoplesHospitalAffiliatedofDalianMedicalUniversity,Dalian116021,China)

A high-throughput method for cell phenotype analysis was developed based on 96-well plate culture and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS). Forty-eight metabolites were selected as the sole energy for wild-type and itsyfcCmutationE.coli(yfcCover-expression andyfcCdeletion mutants) culture. The high-throughput phenotype analysis was achieved by investigating the catabolism difference of these metabolites among the three strains by GC-MS. The results showed that there were 14 metabolites changed significantly between wild-type andyfcCover-expression mutantE.coli. The metabolism ability ofyfcCover-expression mutantE.colifor glycine and citric acid was much stronger than wild-typeE.coli. For other metabolites, the wild-type strain showed stronger capabilities in metabolism. Among the 16 metabolites metabolized differentially between wild-typeE.coliand itsyfcCdeletion mutant, metabolism ability of alanine, lactose, myo-inositol and citric acid inyfcCdeletion mutant was much stronger. Other metabolites displayed the opposite results. Among the results acquired, we speculated that the faster metabolism of glycine inyfcCover-expression mutantE.colimight be caused by its promoted glyoxylate shunt. This high-throughput method for cell phenotype analysis was simple and efficient. It could provide more useful information about metabolism for gene study with unknown function.

gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); high-throughput; phenotype; gene function

10.3724/SP.J.1123.2016.10004

2016-10-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21375046,201605056);吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20140203013GX).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21375046, 201605056); Science and Technology Development of Jilin Province (No. 20140203013GX).

O658

:A

:1000-8713(2017)01-0075-05

*通訊聯(lián)系人.E-mail:gaop@dicp.ac.cn (高鵬);E-mail:dwlou@hotmail.com (婁大偉).