郭振朋, 王曉瑜, 陳 義,2*(. 中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所, 活體分析化學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 0090; 2. 北京分子科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室, 北京 0090; . 中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院, 河南 鄭州 45000)

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(下)·研究論文

反向電滲流非水毛細(xì)管電泳法快速測(cè)定微量赤霉素

郭振朋1, 王曉瑜3, 陳 義1,2*
(1. 中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所, 活體分析化學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190; 2. 北京分子科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190; 3. 中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院, 河南 鄭州 450001)

赤霉素是一類重要的植物激素,是結(jié)構(gòu)相似的弱酸性二萜類化合物。針對(duì)毛細(xì)管電泳法分離、測(cè)定赤霉素速度慢、效率不佳等問(wèn)題,該文發(fā)展了一種可快速測(cè)定微量活性赤霉素的非水毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法。以聚環(huán)氧乙烷動(dòng)態(tài)涂布毛細(xì)管,利用正離子使電滲流反向,將含10 mmol/L醋酸銨的甲醇-水(95∶5, v/v)作為緩沖體系,在0.08%(v/v)醋酸含量下,分離8種內(nèi)源性赤霉素。結(jié)果表明,赤霉素出峰時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤2.1%(日內(nèi))或≤4.3%(日間)，峰面積的RSD≤4.5%(日內(nèi))或≤6.9%(日間)，檢出限(S/N=3)為1.04～2.20 mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.998 2～0.999 3，回收率為87.2%～93.5%。該方法簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定,以含醋酸銨的甲醇水溶液為緩沖體系,預(yù)先考慮了質(zhì)譜測(cè)定的需要,可用于實(shí)際樣品如麥芽中赤霉素的分析,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

非水毛細(xì)管電泳;電滲流;動(dòng)態(tài)涂層;赤霉素

赤霉素(GAs)是一類重要的植物激素,廣泛存在于高等植物中,并在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育中起重要的調(diào)控作用,如種子的萌發(fā)、根和莖的伸長(zhǎng)、花的發(fā)育、果實(shí)的生長(zhǎng)等[1-3]。分析植物組織或器官中GAs的含量對(duì)研究植物的生長(zhǎng)發(fā)育及其調(diào)控具有重要意義。目前對(duì)GAs的分析主要采用氣相色譜(GC)法和高效液相色譜(HPLC)法,但其操作繁復(fù)、樣品消耗量大[4-8]。研究者探索了以毛細(xì)管電泳(CE)法快速、高效地分離多種微量GAs的方法,如Ge等[9-11]建立的水相CE法可基線分離11種GAs,但其分析時(shí)間超過(guò)20 min,而出峰時(shí)間窗口只有4 min。主要原因是GAs為結(jié)構(gòu)相似的含羧基的化合物,需利用其在酸性緩沖液中離解度的差異實(shí)現(xiàn)分離,而采用正向電滲流(EOF)的CE法難以實(shí)現(xiàn)其快速分離。因此,可發(fā)展反向EOF的CE法來(lái)加速分離GAs,其中,陽(yáng)離子涂層的水相CE法是一種選擇,但其不易調(diào)控反向EOF的大小，且難以與高靈敏的質(zhì)譜聯(lián)用;相比而言,非水毛細(xì)管電泳(NACE)法更具有研究開(kāi)發(fā)的價(jià)值。

Belder等[12]用聚乙二醇(PEG)物理涂布毛細(xì)管內(nèi)壁，在采用甲醇、乙腈等非水介質(zhì)緩沖液時(shí)，管壁上的PEG分子能吸附溶液中的陽(yáng)離子,因而改變EOF的大小甚至方向,但其操作復(fù)雜、耗時(shí),且涂層隨電泳次數(shù)的增加而逐漸剝落,重復(fù)性較差;Cottet等[13]嘗試采用聚環(huán)氧乙烷(PEO)對(duì)毛細(xì)管管壁進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附涂覆,在非水介質(zhì)中實(shí)現(xiàn)了對(duì)EOF大小和方向的調(diào)控,并考察了PEO的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)EOF的影響。

本文利用PEO動(dòng)態(tài)涂層毛細(xì)管,以含10 mmol/L醋酸銨的甲醇-水(95∶5, v/v)作為緩沖溶液,通過(guò)調(diào)節(jié)和優(yōu)化緩沖液中電解質(zhì)陽(yáng)離子的種類及濃度改變和調(diào)控EOF的方向和大小,建立了NACE分離麥芽中8種重要的內(nèi)源性赤霉素的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

P/ACE MDQ電泳儀、Allegra 64R離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司); KQ5200DE超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司); MD200-1氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)；未涂層石英毛細(xì)管(30 cm×75 μm,有效長(zhǎng)度20 cm,河北永年光纖廠); Cleanert PAX-SPE固相萃取(SPE)小柱(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

GA1、GA3、GA4、GA5、GA7、GA12、GA20和GA53標(biāo)準(zhǔn)品(純度>90%)均購(gòu)自捷克OlChemIm公司;PEO(Mr： 106)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;二甲基亞砜(DMSO)、醋酸、醋酸鉀、醋酸銨、醋酸鈉、醋酸鋰、碳酸氫銨、甲醇、乙腈(分析純)均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q(美國(guó)Millipore公司)制備的超純水。

用甲醇-水(1∶1,v/v)配制質(zhì)量濃度均為1.0 g/L的各GAs標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃儲(chǔ)存;將各GAs標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合,用甲醇-水(1∶1,v/v)稀釋成不同質(zhì)量濃度的GAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用100 mmol/L鹽酸配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的PEO涂層溶液。將1 mol/L醋酸銨(或醋酸鋰、醋酸鈉、醋酸鉀)、10%(v/v)的醋酸、超純水、甲醇(或乙腈)按所需比例混合，制備成電泳緩沖液,每日現(xiàn)用現(xiàn)配,用0.45 μm聚四氟乙烯濾膜過(guò)濾。

1.2 電泳操作

分別用1 mol/L鹽酸、PEO涂層溶液和電泳緩沖液各沖洗毛細(xì)管3 min,在1 379 Pa(0.2 psi, 2 s)壓力下將樣品引入毛細(xì)管,于25 ℃和-15 kV條件下分離,在200 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外吸收檢測(cè)。由P/ACE工作站采集并處理檢測(cè)數(shù)據(jù),樣品采集頻率為4 Hz,以DMSO為標(biāo)志物測(cè)定EOF的速度。

1.3 麥芽樣品前處理

稱取10 g小麥種子,于25 ℃用自來(lái)水浸泡24 h,使發(fā)芽。取發(fā)芽的麥種置于研缽中,用液氮冷凍并研碎后,轉(zhuǎn)移至錐形瓶中,加入50 mL甲醇-水-甲酸溶液(15∶4∶1, v/v/v),于4 ℃浸泡24 h,超聲5 min,過(guò)濾,以10 000 g離心10 min,取上清液,經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5,用10 mL乙酸乙酯萃取,共3次,合并乙酸乙酯相,用氮?dú)獯蹈珊?加入3 mL 25 mmol/L碳酸氫銨水溶液溶解,待上樣。

1.4 NACE樣品制備

依次用5 mL甲醇、25 mmol/L碳酸氫銨水溶液活化Cleanert PAX-SPE柱后,上樣,依次用5 mL碳酸氫銨水溶液、甲醇淋洗,用1 mL酸化甲醇(含0.2 mol/L甲酸)洗脫,收集洗脫液,經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?用40 μL甲醇-水(1∶1, v/v)溶解,待NACE分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細(xì)管電泳參數(shù)的優(yōu)化

本文采用相對(duì)分子質(zhì)量較高的PEO對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行動(dòng)態(tài)涂層,并系統(tǒng)地考察了緩沖液溶劑、陽(yáng)離子的種類及含量等因素對(duì)EOF大小和方向的影響,建立了在NACE中簡(jiǎn)單調(diào)控EOF的方法。

2.1.1緩沖液種類和含量的選擇

在NACE中,電泳緩沖液中有機(jī)溶劑的種類和含量對(duì)動(dòng)態(tài)涂層的穩(wěn)定性及EOF的調(diào)控具有明顯影響。如表1所示,采用不同緩沖液,其EOF的大小有明顯差異。當(dāng)電解質(zhì)不變時(shí),純甲醇或乙腈溶液容易導(dǎo)致EOF反向,但其大小均隨有機(jī)相比例的降低而減小。當(dāng)甲醇或乙腈所占比例分別低于85%(v/v)或90%(v/v)時(shí),EOF極不穩(wěn)定,檢測(cè)基線的噪聲大幅增加。原因?yàn)镻EO涂層的穩(wěn)定性隨溶劑極性的增大而降低。在有機(jī)相含量相同的情況下,采用乙腈水溶液時(shí)的電滲流大于采用甲醇水溶液,因此在多數(shù)情況下宜選用乙腈水溶液作為緩沖液。但對(duì)于GAs,其淌度在酸性非水緩沖液中均較小,EOF過(guò)大反而對(duì)其分離不利。綜合考慮EOF穩(wěn)定性與分離速度,本文選擇甲醇-水(95∶5, v/v)作為電泳緩沖液。

表1 電泳緩沖液中有機(jī)溶劑含量對(duì)EOF大小的影響Table 1 Effect of the contents of organic solvents inrunning buffer on the electroosmotic flows (EOFs)

All the running buffers contained 10 mmol/L ammonium acetate. * Base-line fluctuated drastically and EOF was not steady.

圖1 不同電解質(zhì)陽(yáng)離子對(duì)EOF的影響Fig. 1 Effect of the different electrolyte cations on EOFs Capillary dynamically coated with polyethylene oxide (PEO); running buffer was methanol-water (95∶5, v/v).

2.1.2電解質(zhì)陽(yáng)離子的選擇

圖2 緩沖液中醋酸含量對(duì)GAs標(biāo)準(zhǔn)品分離度的影響Fig. 2 Effect of the content of acetic acid in runningbuffer on the resolution of gibberellins (GAs) standard samples The volume percentages of acetic acid in running buffer: a. 0; b. 0.02%; c. 0.04%; d. 0.08%; e. 0.16%; f. 0.32%. Running buffer consisted of 10 mmol/L ammonium acetate in methanol-water (95∶5, v/v). Running voltage: -15 kV. 1. GA5; 2. GA20; 3. GA3; 4. GA7; 5. GA1; 6. GA4; 7. GA53; 8. GA12.

2.2 GAs的分離

根據(jù)2.1節(jié),本實(shí)驗(yàn)選擇醋酸銨-醋酸緩沖體系考察GAs的分離條件。利用PEO動(dòng)態(tài)涂層毛細(xì)管,以甲醇-水(95∶5, v/v)為緩沖液溶劑,固定醋酸銨的濃度為10 mmol/L,考察緩沖液中醋酸含量對(duì)8種GAs分離效果的影響。與Li+類似, H+也不與管壁的PEO涂層結(jié)合,因此在一定范圍內(nèi)改變醋酸的含量對(duì)EOF的大小沒(méi)有影響,但會(huì)影響GAs中羧基的電離。如圖2所示,通過(guò)調(diào)節(jié)醋酸含量,使結(jié)構(gòu)類似、淌度相近的GAs在非水條件下表現(xiàn)出不同的解離度或表觀淌度,從而調(diào)節(jié)其分離度。8種GAs的出峰時(shí)間隨醋酸含量的增加而增加;但分離度隨醋酸含量的增加先逐漸增大(見(jiàn)圖2a～2d),而后有部分GAs的分離度下降(如圖2e中GA7與GA1,圖2f中GA7與GA1、GA53與GA12)。當(dāng)醋酸含量為0.08%(v/v)時(shí),8種GAs分離情況最好,能在9 min內(nèi)達(dá)到基線分離(見(jiàn)圖2d)。而利用非涂層的正向電滲NACE法分離8種GAs時(shí),在正分離電壓條件下,120 min內(nèi)只能分離得到5種GAs(見(jiàn)圖3);在負(fù)分離電壓下,120 min內(nèi)未檢測(cè)到GAs。

圖3 未涂層時(shí)GAs標(biāo)準(zhǔn)品的NACE電泳圖Fig. 3 Electropherogram of the GAs standard samples measured by a bare capillary with nonaqueous capillary electrophoresis (NACE) Running buffer consisted of 10 mmol/L ammonium acetate and 0.08% (v/v) acetic acid dissolved in methanol-water (95∶5, v/v). Running voltage:+15 kV.

表2 GAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的日內(nèi)、日間遷移時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Intra-day and inter-day relative standarddeviations (RSDs) of migration times and peak areas for the GAs mixed standard solutions (n=6)

2.3 精密度、檢出限和回收率

按本文所述方法對(duì)GAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,各GAs遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤2.1%(日內(nèi))或≤4.3%(日間),峰面積的RSD≤4.5%(日內(nèi))或≤6.9%(日間)(見(jiàn)表2)。對(duì)系列質(zhì)量濃度的GAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)一步分析,得到方法的檢出限(LOD,S/N=3)為1.04～2.20 mg/L;各GAs在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)>0.998(見(jiàn)表3)。向剛研碎的麥芽中加入0.5 μg的GA1、GA3、GA5、GA12、GA20、GA53, 0.7 μg GA4和0.3 μg GA7的標(biāo)準(zhǔn)品,按本文所述方法處理,其加標(biāo)回收率為87.2%～93.5%, RSD<10%,符合定量分析的要求。

表3 GAs的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限和加標(biāo)回收率Table 3 Linear ranges, regression equations, correlationcoefficients (r2), limits of detection (LODs) and recoveries of the GAs spiked standard samples

y: peak area;x: mass concentration, mg/L.

2.4 實(shí)樣樣品分析

按本文所述方法對(duì)培育的麥芽進(jìn)行樣品前處理,并測(cè)定麥芽中赤霉酸的含量,其中只檢測(cè)出GA3，含量為0.475 μg。麥芽中GAs的電泳圖見(jiàn)圖4。本文所建立的反向電滲流NACE法可快速定量分析GAs,具有推廣價(jià)值。

圖4 麥芽中(a)未添加和(b)添加GAs標(biāo)準(zhǔn)品的電泳圖Fig. 4 Electropherograms of GAs for (a) not spikedand (b) spiked standard samples in germinating wheat seeds Samples were spiked with 0.5 μg GA1, GA3, GA5, GA12, GA20, GA53, 0.7 μg GA4and 0.3 μg GA7. Peaks 1-8 and separation conditions are the same as in Fig. 2d.

3 結(jié)論

本文針對(duì)目前毛細(xì)管電泳法分離、測(cè)定赤霉素速度慢、效率不佳等問(wèn)題,建立了PEO動(dòng)態(tài)涂層反向EOF非水毛細(xì)管電泳快速分離8種內(nèi)源性GAs的分析方法。所建方法簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定,能用于麥芽等實(shí)際樣品中GAs的含量測(cè)定。該方法采用含醋酸銨-醋酸的甲醇-水緩沖溶液，預(yù)先考慮了質(zhì)譜測(cè)定的需要,具有一定推廣性。

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Rapid determination of micro gibberellins by non-aqueouscapillary electrophoresis with reversed electroosmotic flow

GUO Zhenpeng1, WANG Xiaoyu3, CHEN Yi1,2*
(1.CASKeyLaboratoryofAnalyticalChemistryforLivingBiosystems,InstituteofChemistry,ChineseAcademyofSciences,Beijing100190,China; 2.BeijingNationalLaboratoryofMolecularScience,Beijing100190,China; 3.ZhengzhouTobaccoResearchInstituteofChinaNationalTobaccoCorporation,Zhengzhou450001,China)

A non-aqueous capillary electrophoresis (NACE) method for the rapid determination of micro gibberellins (GAs) was established. Dynamically poly(ethylene oxide) coated capillary was used, and electroosmotic flow (EOF) was reversed by using positive ions and adjusted by regulation the types and concentrations of the positive ions, running buffer, and pH of the buffer. With a buffer of 95% (v/v) methanol containing 10 mmol/L ammonium acetate at an acidity of 0.08% (v/v) acetic acid, the EOF was successfully reversed to separate the eight GAs in less than 10 min. Its applicability was validated by the determination of GAs in germinating wheat seeds, with relative standard deviations (RSDs) ≤2.1% (intra-day) or ≤4.3% (inter-day) for migration times, and RSDs ≤4.5% (intra-day) or ≤6.9% (inter-day) for peak areas. The limits of detection (S/N=3) were in the range of 1.10-2.20 mg/L, with correlation coefficients (r2) of 0.998 2-0.999 3. The recoveries of the spiked samples were between 87.2% and 93.5%. The established method is simple, rapid, stable, and compatible with mass spectrometry, so it is valuable to be further studied.

non-aqueous capillary electrophoresis (NACE); electroosmotic flow (EOF); dynamic coating; gibberellins (GAs)

10.3724/SP.J.1123.2016.08042

2016-08-31

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21235007,21475136,91117010).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21235007, 21475136, 91117010).

O658

:A

:1000-8713(2017)01-0065-05

*通訊聯(lián)系人.Tel:(010)62618240,E-mail:chenyi@iccas.ac.cn.