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三脈紫菀有效組分配比的平喘作用及其毒性研究

2017-01-09 01:01:44康林之朱建成劉榮華何小汝趙海平
重慶醫(yī)學 2016年36期
關鍵詞:紫菀氨茶堿豚鼠

康林之,朱建成,任 剛,羅 云,張 婧,劉榮華,楊 明,王 芳,何小汝,趙海平△

(江西中醫(yī)藥大學:1.護理學院;2.藥學院;3.現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室,南昌 330004)

三脈紫菀有效組分配比的平喘作用及其毒性研究

目的 研究三脈紫菀抗慢支組分平喘作用的最佳配比及其毒性。方法 合格豚鼠72只,體質(zhì)量(300±20)g,雄性,分為空白組、氨茶堿組(0.047 g/kg)、三脈紫菀總皂苷與總黃酮不同配比組(8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8,0.38 g/kg)。各組連續(xù)灌胃給藥3 d,每天1次,采用His-Ach霧化引喘法通過誘咳引喘儀優(yōu)選最佳配比;制備豚鼠離體氣管環(huán)標本,采用Powerlab生物信號采集系統(tǒng),考察豚鼠平滑肌條在正??耸弦簵l件下加入氯化乙酰膽堿(Ach)后的收縮變化,以及其他組分別在Ach致平滑肌收縮最明顯時,加入氨茶堿(1.25 mg/mL)后的平滑肌舒張百分率。采用經(jīng)典的小鼠急性毒性實驗方法,考察三脈紫菀總皂苷、總黃酮及其1∶2配比的急性毒性。結果 較之空白組,氨茶堿組、其他各給藥組的致喘潛伏期延長顯著(P<0.05),其中1∶1、1∶2、1∶4組與其他配比組均有顯著差異(P<0.05),但又以1∶2組引喘潛伏期最長。氨茶堿組與各配比組均能明顯松弛Ach導致收縮的豚鼠氣管平滑肌,其中氨茶堿組舒張百分率最大(24.12±1.20)%,各配比組舒張百分率不及氨茶堿組(P<0.05),但以1∶2組與之最接近。三脈紫菀總皂苷、總黃酮及其1∶2配比對小鼠的最大耐受量分別為300、345、325 g/kg。結論 在給藥總量恒定的情況下,三脈紫菀總皂苷與總黃酮1∶2平喘解痙作用明顯,其總黃酮、總皂苷及1∶2配比的急性毒性實驗未顯示明顯的毒性作用,安全性相對良好。

三脈紫菀;皂苷類;黃酮類;平喘;急性毒性

一味中藥就是由其自身有效組分構成的“小復方”,其臨床效應是“復方”體系對病變黑箱(患者)產(chǎn)生的總體效應,而組分構成比例變化是藥物總體效應強弱的關鍵。三脈紫菀(Aster ageratoides Turcz.)為菊科(Compositae)紫菀屬植物的干燥全草或根。曾在1971年被定為全國18種防治慢性氣管炎有效藥物之一[1-6]。據(jù)報道其地上部分主含黃酮苷,根部主含皂苷,此外還含有萜類、甾類等成分。其中黃酮類成分、皂苷類成分是其抗慢支的主要藥效物質(zhì)基礎[7-8]。本課題組前期從祛痰止咳角度開展了其有效組分的最佳配比研究[9],基于此,本研究擬進一步采用豚鼠探討三脈紫菀有效組分平喘的最佳配比,并初步考察其相應的安全性,以期為其抗慢支機制及創(chuàng)制新藥制提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 實驗用三脈紫菀采集于南昌市近郊,經(jīng)江西中醫(yī)藥大學中藥資源與民族藥研究中心鑒定為三脈紫菀。

1.1.2 試劑 氨茶堿片(太原市振興制藥有限責任公司,批號20111206);氯化乙酰膽堿(Ach)與磷酸組胺(His,上海楷洋生物技術有限公司,批號2012116與2012116)。改良Krebs液[10]:NaCl 7.5 g,CaCl20.24 g,MgCl20.05 g,KCl 0.35 g,NaHCO31.15 g,NaH2PO40.1 g,葡萄糖1.0 g配于1 000 mL蒸餾水。實驗前用5% O2和CO2混合氣體飽和。其他試劑均為化學純。

1.1.3 儀器 YLS-8A多功能誘咳引喘儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司);AUTOMATIC ORGAN BATH(Panlab);Powerlab生物系號采集系統(tǒng)(ML141 sptrometer,ML132 Bto Amp)。

1.1.4 動物 KM種小鼠[清潔級,江西中醫(yī)藥大學動物中心,SCXK(贛),2011-0001];豚鼠[普通級,上海生旺實驗動物養(yǎng)殖有限公司,SCXK(滬),2012-0007]。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備 參照前期三脈紫菀制備工藝[7,11-12]??傇碥詹课恢苽洌喝「?00 g,經(jīng)70%、95%乙醇浸提,大孔吸附樹脂處理濾液,濃縮干燥,得浸膏3.99%??傸S酮部位制備:取莖葉500 g,經(jīng)70%、95%乙醇浸提,大孔吸附樹脂處理濾液,濃縮干燥,得浸膏1.477%。保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 劑量設定 參照前期劑量設計方法[13-14],確定總皂苷、總黃酮部位的總量,參照藥典及其他文獻等資料設定兩類成分的配比。其中,按一定梯度一類成分遞減的同時,另一類成分遞增,反之亦然。配比如下(質(zhì)量比):總皂苷與總黃酮以8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8。

1.2.3 平喘實驗研究

1.2.3.1 豚鼠篩選實驗 72只雄性豚鼠體,質(zhì)量(300±20)g,接通多功能誘咳引喘儀后,分別對每只豚鼠進行篩選,將配制好的引喘液(2.0×10-2g/mL Ach和1.0×10-3g/mL His等體積混合液)噴入儀器7 s,每只豚鼠的引喘潛伏期一般小于150 s,如大于150 s者,不予選用組內(nèi)。豚鼠因吸入引喘液出現(xiàn)痙攣抽搐,立刻打開儀器取出,必要時人工輔助呼吸,避免窒息死亡[15]。

1.2.3.2 對豚鼠的平喘實驗 將篩選出的72只豚鼠分為9組,每組8只。灌胃給藥,每只0.2 mL/10 g,每天1次,共3 d。氨茶堿組豚鼠灌胃氨茶堿0.047 g/kg,空白組豚鼠灌胃等量的生理鹽水,各給藥組按設定劑量給藥。第3次給藥1 h后,將豚鼠放入儀器內(nèi),噴7 s引喘液,觀察記錄其出現(xiàn)哮喘性痙攣抽搐的潛伏期(即引喘潛伏期)。如2 min內(nèi)未出現(xiàn)喘息,視其潛伏期為120 s[15]。

1.2.4 對豚鼠離體氣管平滑肌的舒張實驗 用木棒擊豚鼠后腦致昏后,在頸部腹面正中切開皮膚及皮下組織,分離氣管,剪下甲狀軟骨下至氣管分叉處的部分,長約20 mm,制備平滑肌環(huán),固定于離體氣管儀器內(nèi),基值調(diào)整3 g,置換Kerb液1次/20 min,穩(wěn)定約1 h,曲線穩(wěn)定后,對9個組別分別開始實驗。對Ach組,于氣管條平衡穩(wěn)定后,加入5×10-4g/mL Ach 0.4 mL,并記錄數(shù)據(jù)。其他8組分別于Ach致收縮曲線上升至最明顯時,加入氨茶堿(1.25×10-3g/mL)及各組的配比藥液(0.02 g/mL)0.4 mL。觀察并記錄實驗數(shù)據(jù),計算舒張百分率。舒張百分率=(給藥前曲線最大值-給藥后曲線最小值)/ 給藥前曲線最大值×100%[10,15]。

1.2.5 急性毒性實驗研究

1.2.5.1 預實驗 健康KM小鼠36只,體質(zhì)量(20±2)g,雌雄各半,分成9組,每組4只。即總皂苷高、中、低組,總黃酮高、中、低組,總皂苷與總黃酮1∶2配比高、中、低組,實驗前12 h禁食不禁水。將總皂苷、總黃酮及其1∶2配比分別配制成最大濃度(0.75、0.86、0.81 g/mL),且等比(1∶0.85)稀釋,得到其他劑量。各組按最大體積0.4 mL/10 g容量,一次性灌胃,連續(xù)觀察7 d,記錄期間小鼠死亡數(shù)和一般情況[16-17]。結果表明,各組小鼠精神與活動狀態(tài)良好,無死亡。提示各組藥物的急性毒性較小,無法測得其半數(shù)致死量(LD50),故改為測定各組藥物的小鼠最大耐受量(Maximum tolerated dose,MTD) 。

1.2.5.2 MTD實驗 健康KM小鼠80只,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2)g,分為4組,每組20只,即:空白組、總皂苷組(0.75 g/mL)、總黃酮(0.86 g/mL)、總皂苷與總黃酮1∶2配比組(0.81 g/mL),實驗前12 h禁食不禁水。各組給藥1次,0.4 mL/10 g,空白組給予等體積蒸餾水。給藥后連續(xù)觀察14 d[10,16-17],期間詳細觀察記錄實驗動物每天的反應及體質(zhì)量變化、攝食量變化、中毒反應及死亡情況等。觀察期結束后,處死小鼠進行尸體解剖檢查。

2 結 果

2.1 豚鼠的平喘實驗 與空白組比較,氨茶堿組與其他各給藥組的引喘潛伏期延長顯著(P<0.05);其中1∶1、1∶2、1∶4組與其他配比組均有顯著差異(P<0.05),但又以1∶2組引喘潛伏期最長。見表1。

表1 各組對豚鼠的平喘作用

*:P<0.05,#:P<0.01,與空白組比較;△:P<0.05,與其他各給藥比較;-:此項無數(shù)據(jù)。

2.2 豚鼠離體氣管平滑肌舒張作用的實驗 氨茶堿組與各配比組均能明顯松弛Ach導致收縮的平滑肌。其中,氨茶堿組舒張百分率最大,各配比組舒張百分率不及氨茶堿組(P<0.05),但尤以1∶2組作用明顯。見表2。

2.3 急性毒性實驗 本實驗結果顯示,總皂苷、總黃酮及其1∶2配比對小鼠單次灌胃給藥的MTD分別為300、345、325g/kg。觀察期間,各給藥組灌胃后2h內(nèi)個別動物出現(xiàn)自主活動減少、反應遲鈍,其余未見異?,F(xiàn)象;給藥后第2天起,所有動物飲食正常,精神狀態(tài)良好,皮毛光澤、活動靈活積極,體質(zhì)量正常增長;繼續(xù)觀察14d后無動物死亡。處死并解剖各組小鼠,未見心、肝、脾、肺、腎等主要臟器出現(xiàn)異常。

表2 各組對豚鼠離體氣管平滑肌的影響

*:P<0.05,#:P<0.01,與氨茶堿組比較。

3 討 論

中藥有效組分配伍是目前中藥配伍的新興模式之一,而厘清各有效組分配伍間的協(xié)同、拮抗等機制,則是優(yōu)選科學配比的關鍵一環(huán)[1-6]。毒性研究是反映藥物對機體安全性的初始資料[17],在其綜合的安全性評價體系中具有極其重要的地位和作用。

本研究數(shù)據(jù)顯示,在確定三脈紫菀總皂苷、總黃酮部位總量的情況下,各配比組可使豚鼠的引喘潛伏期延長顯著(P<0.05),且平喘作用隨總黃酮比例增加而增強,1∶1、1∶2、1∶4組與其他配比組差異顯著(P<0.05),但又以1∶2組引喘潛伏期最長。表明各配比組的平喘作用與總皂苷和總黃酮的配比密切相關,且存有協(xié)同增效的可能。豚鼠氣管平滑肌分布的受體主要有H1、M和β2等,其中興奮H1、M受體可發(fā)生收縮,興奮β2受體可發(fā)生舒張。Ach致氣管平滑肌收縮模型,是由Ach作用于M受體,使鈣通道(ROC)和VDC開啟,發(fā)生鈣內(nèi)流,并水解細胞膜上磷酸肌醇,生成二酯基甘油(DAG)與肌醇三磷酸(IP3),使內(nèi)鈣釋放,氣管平滑肌收縮[18-19]。研究結果顯示氨茶堿組與各配比組均能明顯松弛Ach導致收縮的平滑肌,氨茶堿組舒張百分率最大(24.12±1.20)%,其中雖各配比組不及氨茶堿組(P<0.05),但尤以1∶2組舒張作用明顯,而抑制Ca2+內(nèi)流可能是其主要機制。三脈紫菀總皂苷、總黃酮及其1∶2配比的急性毒性實驗結果顯示,各組藥物對小鼠單次灌胃給藥的MTD分別為300、345、325g/kg(分別相當于成人用量25、28.75、27.08g/kg),各組動物活動飲食正常,觀察結束后無死亡,主要臟器肉眼觀亦未見異常。提示各組藥物對小鼠幾乎無急性毒性損害。

目前,國內(nèi)外均有文獻報道[20-21],黃酮及皂苷類物質(zhì)具有多種生物活性及藥理作用。三脈紫菀作為抗慢支的有效藥物之一,加強其有效組分配比的優(yōu)化研究,可為今后的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。然而,也有報道稱[22-23],諸如沙青子總黃酮、盾葉薯蕷皂苷及七葉皂苷等組分對實驗動物有毒性作用。可見,對于不同來源的黃酮或皂苷類物質(zhì),其安全性不能一概而論。所以,今后也有待于結合組分間相互作用、體內(nèi)轉(zhuǎn)化代謝及長毒觀察等方面深入探討。

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Study on the effective compositions of Aster ageratoides Turcz for relieving asthma and its toxicity*

KangLinzhi1,Zhujiancheng2,RenGang3,LuoYun3,ZhangJing3,LiuRonghua2,YangMing3,WangFang2,HeXiaoru3,ZhaoHaiping2△

(1.SchoolofNursing;2.CollegeofPharmacy;3.KeyLaboratoryofModernPreparationofTCM,MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang,Jiangxi330004,China)

Objective To study the effective composition of Aster ageratoides Turcz for relieving asthma and its toxicity.Methods Seventy-two qualified male guinea pigs,body mass(300±20)g,were randomly divided into the control group,aminophylline group(0.047 g/kg) and different ratio group of total saponins and total flavonoids(8∶1,4∶1,2∶1,1∶1,1∶2,1∶4,1∶8).Every group received at dose of 0.38 g/kg once a day for 3 days by intragastric administration.The effect of relieving asthma was taken as the indicators for the optimization of compositions,which was detected by observing the latent period of asthma induced by acetylcholine-histamine in guinea rats.The relaxation percentage of smooth muscle retracted by acetylcholine was detected by Powerlab biological signal collecting system when aminophylline(1.25 mg/mL) and different matching drugs(0.02 g/mL) were added in Krebs′ solution.The acute toxicities of total saponins,total flavonoids and mixture of total saponins with total flavonoids(ratio of 1∶2) were detected by classical acute toxicity test of mice.Results Compared with the control group,aminophylline group,each group latent period of inducing asthma significantly or very significantly prolonged (P<0.05),among them,1∶1,1∶2,1∶4 group and other matching group were significantly different(P<0.05),but 1∶2 group cited the longest incubation period.Aminophylline group and the ratio could significantly relaxe guinea pig tracheal smooth muscle retracted by acetylcholine.Aminophylline group diastolic percentage was the largest(24.12±1.20)%,all the groups were less than the percentage of diastolic aminophylline group(P<0.05),but in 1∶2 group with the closest.Aster ageratoides Turcz,tatarian aster total saponins,total flavonoids and the ratio of 1∶2 to mice maximum tolerance was respectively 300,345,325 g/kg.Conclusion For the same total dosage,the relieving asthma effects of proportions of 1∶2 Aster ageratoides Turcz were obvious.There are no abnormal changes in the acute toxicity trila with total flavonoids,total saponins,as well as the ratio of 1∶2,safety is relatively good.

Aster ageratoides Turcz;saponins;flavone;antiasthma;acute toxicity

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.36.005

十一五重大新藥創(chuàng)制資助項目(2009ZX09310-005);江西省科技廳資助項目(20111BBG70005-4);江西中醫(yī)藥大學?;鹳Y助項目(Y027)。 作者簡介:康林之(1979-),講師,碩士,主要從事中西醫(yī)結合的臨床研究?!?/p>

康林之1,朱建成2,任 剛3,羅 云3,張 婧3,劉榮華2,楊 明3,王 芳2,何小汝3,趙海平2△

(江西中醫(yī)藥大學:1.護理學院;2.藥學院;3.現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室,南昌 330004)

TQ461

A

1671-8348(2016)36-5056-03

2016-07-18

2016-09-26)

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