曹麗君，程正軍，李 田，蔣曉慧

(西華師范大學 a.化學化工學院;b.四川省化學合成與污染控制重點實驗室，四川 南充 637009)

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基于光譜法的酸性紅92結合牛血清白蛋白的研究

曹麗君，程正軍，李 田，蔣曉慧

(西華師范大學 a.化學化工學院;b.四川省化學合成與污染控制重點實驗室，四川 南充 637009)

通過熒光光譜、紫外-可見光譜(UV-vis)及傅里葉變換紅外光譜法(FT-IR)研究牛血清白蛋白(BSA)與酸性紅92(AR92)之間的相互作用。研究表明AR92對BSA的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅。位點標記實驗證明AR92結合于BSA上的位點Ⅰ(子域ⅡA)。 熱力學參數△G0<0，△H0<0，△S0>0暗示BSA與AR92間結合是以靜電力為主要驅動力的自發(fā)放熱過程。而且，還探討不同鹽濃度和乙醇對其結合作用的影響。此外，分析AR92誘導BSA的構象變化。

光譜法；牛血清白蛋白；酸性紅92；熒光猝滅；構象變化

酸性紅92(AR92，圖1)是一種人造呫噸著色劑，它已被用在食品、藥物和化妝品等領域[1]。 Qi等[2]研究發(fā)現，過量的AR92會誘導細胞壞死和引發(fā)炎癥反應。 因此，研究AR92與蛋白質的相互作用具有重要意義。 血清白蛋白(SA)是循環(huán)系統(tǒng)中的主要可溶性蛋白成分，作為轉運蛋白來轉運藥物、脂肪酸和末端氨基樹枝狀聚合物等多種物質[3]。 由于牛血清白蛋白(BSA)易于純化和成本低，并且它與人血清白蛋白(HSA)有76%的相似性，因此，BSA已被廣泛用作一個模型來評估蛋白質與有機小分子間的相互作用[4]。近年來，關于有機小分子與蛋白質相互作用的研究已成為化學生物界研究熱點之一。 然而，AR92與BSA結合特性尚不明確。 故本文運用多光譜法探討B(tài)SA和AR92間相互作用，該研究可能為AR92作為食品著色劑等方面提供有用信息。

1 實驗部分

1.1 材料

牛血清白蛋白(BSA，純度98%，Mr=68000)購自Ruibio公司，使用時未純化。 BSA溶液用0.05 M磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)配制。 AR92購自麥克林生物化學有限公司(中國，上海)。 其它化學品均為分析純。 所有溶液均在4 ℃下儲存，整個實驗使用的水均為二次蒸餾水。

1.2 方法

所有熒光光譜均用配有恒溫槽的Cary Eclipse型熒光分光光度計(美國，瓦里安)進行測定。 BSA的濃度為2.0 μM，AR92的濃度從0增加到1.94 μM。 激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm，激發(fā)波長280 nm，波長范圍300～500 nm。 所有熒光滴定實驗均用50 μL手動微量注射器完成。

在存在和不存在鹽(0.30、0.60、0.90 M)或乙醇(5%和10%，V/V)的磷酸鹽緩沖液(0.05 M，pH=7.4)中進行鹽和乙醇對BSA與AR92相互作用影響的熒光滴定實驗。

同步熒光光譜激發(fā)和發(fā)射波長的間隔Δλ分別為15 nm和60 nm，波長范圍均為250～350 nm。 其它掃描參數與以上熒光滴定實驗相同。

采用熒光滴定法研究AR92與BSA結合的位點競爭實驗，即在3種位點標記物保泰松(phenylbutazone，PB)、氟芬那酸(flufenamic，FA) 和洋地黃毒苷(digitoxin,DIG)的存在下探討它們間的相互作用。 BSA和位點標記物的濃度均為2.0 μM(pH 7.4)。

所有UV-vis吸收和FT-IR光譜分別通過UV-3600分光光度計(日本，島津)和Nicolet-6700 FT-IR光譜儀測定。

2 結果與討論

2.1 AR92與BSA間相互作用

2.1.1 熒光猝滅機制

BSA與AR92的結合熒光猝滅圖譜見圖2(a)。 圖2(a)顯示，BSA的熒光強度隨AR92濃度的增加逐漸下降，且最大發(fā)射波長有輕微藍移，表明AR92與BSA發(fā)生相互作用，從而導致BSA中色氨酸殘基周圍微環(huán)境發(fā)生變化。

AR92與BSA相互作用所產生的內濾效應不能忽略。 為了消除內濾效應帶來的影響，需對所有熒光強度進行校正，校正系數η由下式[5]計算：

(1)

其中，Ax0和Ay0分別表示熒光團的吸光度，Axi=Ax0+△Axi和Ayi=Ay0+△Ayi分別是熒光團和猝滅劑(△Axi和△Ayi)在激發(fā)和發(fā)射波長的總吸光度。 校正的Stern-Volmer方程如下：

(2)

式中，測得熒光比(F0/F)m乘以校正系數η得到校正的熒光比F0/F；F0和F分別是未加入和加入AR92后BSA的熒光強度；KSV為Stern-Volmer猝滅常數；Kq為雙分子猝滅速率常數；τ0是不存在AR92時BSA熒光團的平均壽命，通常對于大多數熒光蛋白分子τ0為10-8s；[Q]為AR92的濃度。 熒光猝滅通常分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，動態(tài)猝滅或碰撞猝滅是激發(fā)態(tài)熒光分子與猝滅劑碰撞引起的熒光猝滅，而基態(tài)熒光分子與猝滅劑結合形成復合物猝滅熒光的現象稱為靜態(tài)猝滅。 若F0/F對[Q]的Stern-Volmer曲線顯示出良好的線性關系，通常暗示該熒光猝滅為動態(tài)或靜態(tài)猝滅。 然而，Stern-Volmer曲線顯示出正偏差(圖2(b))，這表明BSA與AR92的結合可能是動態(tài)和靜態(tài)聯合猝滅機制。

若該結合過程是一個聯合猝滅，那么它們對應的熒光數據可用下式分析[6]：

F0/F=(1+KD[Q])(1+KS[Q])，

(3)

F0/F=1+Kapp[Q]，

(4)

Kapp=[F0/F-1]/[Q]=(KD+KS)+KDKS[Q]，

(5)

其中，Kapp是表觀猝滅常數;KD和KS分別是動態(tài)和靜態(tài)猝滅常數, 它們的值由Kapp對[Q]線性擬合的 截距和斜率來計算。 結果發(fā)現BSA-AR92體系的KD和KS值均為虛數(分別為0.2119+1.4343i和0.2119-1.4343i)，表明該作用過程不可能是聯合猝滅機制。 故該熒光數據可以用改進的Stern-Volmer等式進行處理：

(6)

式中V是靜態(tài)猝滅常數。 相應的參數列于表1。 從表1可知，BSA-AR92體系的KSV值與溫度呈負相關，且它們的Kq值均大于猝滅劑與生物分子的最大散射碰撞猝滅常數(2.0×1010L·mol-1·s-1)，表明BSA與AR92間相互作用導致的熒光猝滅不是動態(tài)猝滅，而是靜態(tài)猝滅[7]。

表1 BSA-AR92體系的Stern-Volmer參數

注：R和SD分別是S-V曲線的相關系數和標準偏差。

2.1.2 結合常數和結合位點數

結合常數K和結合位點數n由下式計算：

(7)

對應的值列于表2。BSA-AR92體系的結合常數K值隨溫度升高而減小，這表明隨溫度的升高，BSA與AR92間結合作用減弱。 它們間的結合位點數n值近似等于1，表明AR92與BSA間的相互作用存在一個結合位點。

表2 BSA-AR92體系結合常數K、結合位點n和熱力學參數

續(xù)表2

注：Ra和Rb分別是K值和Van’tHoff曲線的相關系數。

2.1.3 位點標記物競爭實驗

為了確定BSA與AR92間的精確綁定位點，我們進行位點競爭實驗。BSA是由585個氨基酸殘基組成的單一多肽鏈，具有三個同源α-螺旋結構域(Ⅰ-Ⅲ)，每個域包含兩個子域(A和B)。它含兩個具有固有熒光的色氨酸殘基，即Trp134和Trp212，分別位于子域ⅠB的表面和子域ⅡA的疏水結合腔。BSA的內源性和外源性配體主要結合于蛋白質的子域ⅡA或ⅢA的疏水腔。 許多配位體可以與BSA結合，如保泰松(phenylbutazone，PB)和華法林(warfarin，WF)結合于位點Ⅰ，布洛芬(ibuprofen，IP)和氟芬那酸(flufenamic，FA) 結合于位點Ⅱ，洋地黃毒苷(digitoxin，DIG) 結合于位點Ⅲ[8]。 本研究采用DIG、FA和PB三種特定部位探針進行位點競爭實驗。

它們的熒光數據由式(7)進行分析，對應的K值列于表3。 顯然，DIG-BSA-AR92和FA-BSA-AR92的K值與BSA-AR92的K值相比幾乎沒有變化，然而，PB-BSA-AR92的K值遠小于BSA-AR92的K值。因此，AR92最可能結合BSA的位點I處，即BSA子域IIA中的Trp-212。

表3 存在和不存在位點標記物、不同濃度乙醇時對BSA-AR92體系的結合常數K

2.1.4 驅動結合力

熱力學參數ΔG0<0、ΔH0<0和ΔS0>0(表2)，表明AR92與BSA主要通過靜電力結合[9]，且是放熱自發(fā)反應。

2.2 鹽和乙醇對BSA與AR92結合作用的影響

2.2.1NaCl的影響

為進一步證實AR92與BSA間通過靜電力相互作用，我們考察不同濃度NaCl對BSA-AR92體系的影響。 離子強度的增加容易對靜電引力產生影響，而不易對疏水相互作用產生影響[10]。 圖3列出不同濃度鹽存在下BSA校正后的Stern-Volmer圖，相關參數列于表1和表2。 結合常數隨NaCl濃度增加而顯著減小，表明AR92對BSA的猝滅程度明顯降低，進一步說明較高鹽濃度可能減弱HSA對AR92的吸收進而降低其對人體的危害。 此外，Bolel等[11]發(fā)現，離子強度對BSA的動態(tài)猝滅程度幾乎沒有任何影響，而對其靜態(tài)猝滅程度影響顯著。 結合本研究中鹽對BSA-AR92體系熒光猝滅的影響可推斷，BSA與AR92的結合模式不是動態(tài)猝滅。

2.2.2 乙醇的影響

乙醇對外源分子在子域IIA的結合有影響，從而導致其周圍微環(huán)境發(fā)生變化[12]。 我們進行不同乙醇含量的熒光猝滅實驗來進一步確認BSA與AR92的結合位點，對應的參數列于表3。BSA與AR92的結合常數K值隨乙醇含量的升高而明顯降低，再次表明AR92結合于BSA的子域IIA。

2.3 AR92誘導BSA構象變化的研究

2.3.1 紫外-可見吸收光譜

UV-Vis是研究小分子與蛋白相互作用，探討復合物形成和蛋白構象變化的簡便有效的工具，蛋白質分子的構象變化會影響生色氨基酸殘基的微環(huán)境，進而使生色團的吸收光譜發(fā)生改變[13]。 圖4顯示AR92在540nm附近有強吸收帶，在AR92中加入BSA，540nm處的峰值逐漸減小后上升并伴隨紅移，這表明BSA和AR92之間形成復合物，導致BSA的構象變化。

2.3.2 同步熒光光譜

同步熒光光譜通過檢測光譜最大發(fā)射波長的移動來提供有關蛋白質分子中發(fā)色團(如色氨酸和酪氨酸殘基)附近微環(huán)境的信息[14]，進而說明AR92對BSA構象的影響。 它涉及熒光激發(fā)和發(fā)射單色器的同時掃描，它們之間保持恒定的波長間隔(Δλ)。 當激發(fā)和發(fā)射波長的間隔Δλ=15nm時，光譜反映的是酪氨酸殘基的熒光特性；Δλ=60nm時，光譜反映的是色氨酸殘基的熒光特性。BSA隨AR92加入時的同步熒光光譜示于圖5。 觀察到Δλ=15nm和Δλ=60nm時的最大熒光發(fā)射波長均發(fā)生微弱藍移，表明BSA的微環(huán)境在AR92存在下發(fā)生輕微變化。 此外可以明顯看出，BSA-AR92體系在Δλ=60nm的猝滅程度強于Δλ=15nm，這表明，與酪氨酸殘基相比，色氨酸殘基對固有熒光的猝滅貢獻更多，即結合位點主要集中在BSA的色氨酸部分。

2.3.3 傅里葉變換紅外光譜

3 結 論

在四個不同溫度、三種鹽濃度及不同乙醇含量下，采用多光譜技術分別研究BSA與AR92間相互作用。熒光猝滅數據及修正后的S-V圖表明BSA與AR92間通過靜態(tài)猝滅結合。 結合位點數近似等于1、乙醇影響的研究及位點標記物實驗結果均證實AR92與BSA子域IIA中的Trp-212相結合。 熱力學和鹽影響的結果表明BSA與AR92間的結合力主要為靜電力。 此外，UV-vis、同步熒光和FT-IR證實AR92與BSA的結合導致BSA的構象發(fā)生變化。 這些結果可能為實際應用中設計食品色素配比提供一定的參考價值。

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Study on the Mechanism of Acid Red 92 Binding with Bovine Serum Albumin by Spectroscopic Techniques

CAO Lijun, CHENG Zhengjun, LI Tian, JIANG Xiaohui

(a.College of Chemistry and Chemical Engineering,b.Key Laboratory of Chemical Synthesis and Pollution Control of Sichuan Province,China West Normal University,Nanchong Sichuan 637009,China)

The interaction of Acid Red 92 (AR92) with Bovine Serum Albumin (BSA) was investigated via fluorescence,UV-vis and FT-IR spectra.The results showed that the interaction between BSA and AR92 belongs to a static quenching.The binding constant K and the binding-site number n were also calculated.The site marker competition experiments confirmed that AR92 binds to siteⅠ (subdomainⅡA) on BSA.The thermodynamic parametersΔG0<0,ΔH0<0,ΔS0>0 demonstrate that the main driving force of BSA and AR92 interacting with each other spontaneously is static electricity.The influences of salt and alcohol in different concentrations on their binding were studied.Furthermore,AR92-induced conformational changes of BSA were also analyzed.

spectroscopic technique;bovine serum albumin;acid red 92;fluorescence quenching;conformational change

1673-5072(2016)04-0396-07

2015-12-20

四川省教育廳重點項目(12ZA171)

曹麗君(1989—)，女，河南許昌人，碩士研究生，主要從事食品分析方面研究。

程正軍(1973—)，男，陜西鎮(zhèn)安人，副教授，主要從事食品和藥物分析方面研究。E-mail：ncczj1112@126.com

O65

A

10.16246/j.issn.1673-5072.2016.04.007