李 亮，陳 希，王 奮，王曉陽，齊樹亭

（河北工業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300130）

印度梨形孢通過激活抗氧化物酶活性及誘導(dǎo)P5CS基因表達(dá)提高紫花苜蓿耐鹽性

李 亮，陳 希，王 奮，王曉陽，齊樹亭

（河北工業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300130）

印度梨形孢能廣泛促進(jìn)植物生長，增強(qiáng)植物對生物及非生物脅迫的抵抗性．然而其作用機(jī)制還知之甚少．本研究通過分析不同鹽濃度脅迫下紫花苜蓿的生物產(chǎn)量以及體內(nèi)丙二醛含量、抗氧化物酶活性、電導(dǎo)率以及吡咯啉-5-羧基合成酶基因（P5CS基因）的表達(dá)，揭示鹽害脅迫下，印度梨形孢對紫花苜蓿的生長調(diào)節(jié)機(jī)制．實驗表明紫花苜蓿是印度梨形孢良好的寄主，并能顯著促進(jìn)紫花苜蓿的生長．與未侵染組相比，印度梨形孢定殖能緩解鹽害對植物造成的損傷，提高產(chǎn)量．生理生化實驗表明印度梨形孢定殖可顯著激活植物體內(nèi)抗氧化物酶活性、有效降低丙二醛含量以及降低根部電導(dǎo)率．分子生物學(xué)實驗表明該真菌可誘導(dǎo)脯氨酸合成酶基因（P5CS）的表達(dá)增強(qiáng)紫花苜蓿的耐鹽害能力．

印度梨形孢；紫花苜蓿；抗氧化物酶；耐鹽性

0 引言

印度梨形孢（Piriformospora indica）是擔(dān)子菌綱（Basidiomycota）臘殼耳目（Sebacinales）的一種能夠定殖在多種植物根部的內(nèi)生真菌[1-2]．印度梨形孢具有廣泛的宿主，并且能有效促進(jìn)宿主植物的生長發(fā)育[3-7]．另外，研究表明印度梨形孢定殖可增強(qiáng)植物對生物及非生物脅迫的抵御能力并誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗性[8-10]．然而，印度梨形孢介導(dǎo)的植物產(chǎn)量提高和抗性增強(qiáng)機(jī)制還有待于深入挖掘和闡明．

本研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿是印度梨形孢良好的宿主．鹽害脅迫下，印度梨形孢能顯著增加紫花苜蓿的產(chǎn)量．紫花苜蓿作為首選優(yōu)良草種，具有極強(qiáng)的科研價值．苜蓿草生物學(xué)的農(nóng)業(yè)和生態(tài)方面表現(xiàn)為和土壤中各種微生物如根際細(xì)菌和菌根真菌的互作能力．然而，這種互作關(guān)系會受到土壤中鹽害的影響．對與土壤中的鹽脅迫，苜蓿草比根際微生物更加敏感[11]．鹽脅迫會影響根際微生物的定殖和早期的侵染[12]；另外，鹽脅迫會影響根際類細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)從而影響固氮過程[13]．盡管印度梨形孢和植物的互作機(jī)制與菌根真菌[14]以及根際細(xì)菌[15]有很多相似的地方，然而目前對印度梨形孢介導(dǎo)的植物生長調(diào)節(jié)機(jī)制的研究成果還相對甚少．

實驗中首先明確印度梨形孢可在紫花苜蓿根部定殖，通過檢測抗氧化物酶活性、丙二醛含量，植物根部電導(dǎo)率以及P5CS基因的表達(dá)等生理生化以及分子生物學(xué)指標(biāo)，探討了印度梨形孢提高紫花苜蓿耐鹽的分子機(jī)制．

1 材料與方法

1.1 材料

紫花苜蓿（Medicago sativa）種子和印度梨形孢（Piriformospora indica）分別由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所王彥章博士和德國吉森大學(xué)植物病理研究所（Instituteof Pathology and Applied Zoology，IPAZ，Giessen）Karl-Heinz Kogel教授惠贈．

1.2 方法

1.2.1 印度梨形孢的培養(yǎng)和菌絲體的收集

將P.indica接種到完全培養(yǎng)基上[16]，保持25℃黑暗培養(yǎng)3周．從已經(jīng)大量繁殖后的完全培養(yǎng)基上收集P.indica．在培養(yǎng)基上倒入少量表面活性劑（0.05%的吐溫20），用扁鏟或三角棒平放在培養(yǎng)基上輕轉(zhuǎn)培養(yǎng)基獲取菌體懸液，在離心機(jī)上以4 000 r/m in，離心10m in，除去菌絲體和培養(yǎng)基碎片用吐溫20沖洗培養(yǎng)基表面，反復(fù)3～4次，離心，獲得孢子菌液；血球計數(shù)板計數(shù)使細(xì)胞密度達(dá)到4×104個/m L．

1.2.2 紫花苜蓿種子的處理

種子用溫水泡30m in，75%酒精震蕩60 s，消毒，用滅菌的蒸餾水沖洗幾次，再置于10%次氯酸鈉中浸泡致使種子破皮，將處理好的無菌紫花苜蓿種子種入配置好的富集培養(yǎng)基[17]中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，24℃，16h光周期；18℃，8h暗周期．待種子萌發(fā)7 d后，用收集好的印度梨形孢孢子液侵染紫花苜蓿根部，將收集的P.indica接種到植物根部組織，接種方法見文獻(xiàn) [16]．對照處理為不加菌絲體的培養(yǎng)基，印度梨形孢與紫花苜蓿根部共培養(yǎng)14 d后，發(fā)芽種子轉(zhuǎn)移到蛭石珍珠巖2∶1的土壤中培養(yǎng)，以備用于鹽脅迫實驗的生理生化分析．

1.2.3 根樣的染色與顯微鏡觀察

植物和P.indica共生1周后，用臺盼藍(lán)進(jìn)行根系染色，選取未侵染和已被P.indica侵染的紫花苜蓿根系，洗凈后擦干水分，將植物根系置于潔凈的平板內(nèi)放入10%KOH適量進(jìn)行軟化，15m in后取出后無菌水沖洗，擦干水分，置于1mol/L溶液中進(jìn)行酸化，10m in后取出置于事先配置好的0.02%臺盼藍(lán)溶液中過夜染色，要保證染色時間充足，取出后用50%乳酸酚脫色液（乳酸20 m L，苯酚20 m L，甘油40 m L，蒸餾水20 m L）脫色2 h，最后在相差顯微鏡下觀察P.indica在根部的定殖情況及植物細(xì)胞內(nèi)孢子形態(tài)，拍照并保存．

1.2.4 生物產(chǎn)量測定

印度梨形孢與紫花苜蓿共培養(yǎng)5周后，植物與P.indica共同培養(yǎng)5周后，對實驗組和對照組植物的根長、根重和莖重分別進(jìn)行測定．植物根部用蒸餾水洗凈，分別進(jìn)行稱重統(tǒng)計．每個處理稱取100株植物．實驗重復(fù)3次．

1.2.5 鹽脅迫實驗

土壤中培養(yǎng)1個月后設(shè)置5個實驗組及1個對照組，實驗組分別加入不同濃度的NaCl5m L于植物根部：A組濃度為50mmol/L，B組濃度為100mmol/L，C組濃度為150mmol/L，D組濃度為175mmol/L，E組濃度為200mmol/L，對照組加同樣5m L的無菌水．鹽處理后的12 h、18 h、24 h收獲紫花苜蓿根部組織用于分析鹽脅迫下P.indica的生物學(xué)效應(yīng)．

1.2.6 抗氧化物酶活性測定

粗酶液的制備：取0.2 g洗凈的苜蓿草的根部，在研缽中，加入5m LPBS研磨成勻漿．將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，用PBS沖洗，并倒入離心管中至10m L，于4 000 r/m in條件下離心15m in，取上清液6m L于容器中，低溫保存?zhèn)溆茫^氧化氫酶、超氧化物歧化酶以及過氧化物酶活性測定參考文獻(xiàn) [19-20]．

1.2.7 測定植物體內(nèi)丙二醛含量測定

丙二醛含量測定方法參考試劑盒說明書（MDA assay Kit，Abcam）．

1.2.8 植物根部電導(dǎo)率測定

取實驗組和對照組的植物根部組織，先用自來水沖洗再用蒸餾水沖洗2～3次，吸干水分，分別稱取待測鮮樣0.1 g置于25m L比色管中加入10m L蒸餾水，蓋上塞子室溫下靜置12 h，用電導(dǎo)率儀測定浸提液電導(dǎo)率記為R1，沸水浴30 m in，室溫下冷卻后震蕩均勻，測定浸提液電導(dǎo)率記為R2，重復(fù)該過程3次．相對電導(dǎo)率可記為R1/R2×100%．

1.2.9 RNA提取、RT-PCR以及目的基因擴(kuò)增

紫花苜蓿組織研磨后進(jìn)行RNA的提取，方法參見文獻(xiàn) [17]．RT-PCR體系及各物質(zhì)含量參見鼎國RT-PCR試劑盒說明（產(chǎn)品編號：TER016-1）．RT-PCR程序如表1．

表1 RT-PCR程序Tab.1 RT-PCR program

PCR體系及各物質(zhì)含量參見鼎國PCR試劑盒說明（產(chǎn)品編號：TER016-2）．PCR程序見表2．

表2 PCR程序Tab.2 PCR program

內(nèi)參及引物序列如表3（由北京鼎國生物科技有限公司合成）．

表3引物序列Tab.3 Primersequence

1.2.10 Northern分析

1.2.11 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL、MATLAB等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 印度梨形孢定殖提高紫花苜蓿生物產(chǎn)量

印度梨形孢接種紫花苜蓿14 d后，可顯著增加紫花苜蓿的生物產(chǎn)量（如圖1a），而且經(jīng)接種的紫花苜蓿根部主根和側(cè)根含量明顯多于未接種的（如圖1b）．發(fā)芽種子移栽到土壤后的10 d，印度梨形孢的促進(jìn)效應(yīng)更加明顯（如圖1c）．菌根復(fù)合體經(jīng)臺盼藍(lán)染色后，定殖于紫花苜蓿根部表面的孢子被染成藍(lán)褐色，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)印度梨形孢主要定殖于根的表皮細(xì)胞及細(xì)胞間隙中（如圖1d）．

2.2 印度梨形孢定殖增強(qiáng)紫花苜蓿對鹽脅迫的耐受力

45 d苗齡的紫花苜蓿經(jīng)持續(xù)的不同鹽濃度的NaCl溶液（100mmol/L、175mmol/L、200mmol/L）處理7d后，發(fā)現(xiàn)接種印度梨形孢侵染的紫花苜蓿生長良好，而未經(jīng)印度梨形孢侵染的植物出現(xiàn)不同程度的萎蔫，而經(jīng)鹽脅迫14 d后，未經(jīng)接種的紫花苜蓿幼苗表現(xiàn)出生長遲滯，并伴隨一定程度的早衰現(xiàn)象如泛黃，萎蔫，而經(jīng)過印度梨形孢接種的則癥狀輕微，鹽害效應(yīng)明顯減弱（圖2a）．通過對100株植物的生物量統(tǒng)計，數(shù)據(jù)表明接種印度梨形孢使根長分別提高51%、67%和65%（圖2b）；使莖鮮重分別提高97%、66.7%和157%（圖2c）；而在根鮮重上，接種印度梨形孢使莖鮮重分別提高57%，31%，24%（圖2d）（P＜0.01）．

圖1 印度梨形孢在紫花苜蓿根部的定殖Fig.1 Colonization of P.indica in the rootof Medicago sativa

2.3 鹽脅迫下印度梨形孢定殖提高紫花苜蓿抗氧化物酶活性

有研究顯示在印度梨形孢介導(dǎo)的植物對非生物脅迫的系統(tǒng)抗性中，過氧化氫酶扮演重要的角色[22-23]．因此，我們感興趣于鹽害脅迫下，印度梨形孢是否會激活抗氧化物酶活性．實驗結(jié)果顯示在實施200 mmol/L的高鹽脅迫后3 d，印度梨形孢的定殖在不同程度上誘導(dǎo)了紫花苜蓿體內(nèi)的抗氧化物酶活性活性．接種印度梨形孢的植株其體內(nèi)POD、SOD和CAT活性比未接種的分別提高了33%、25%和20%．這與之前在蒺藜苜蓿中的抗氧化物酶活性影響程度有所不同（如圖3所示）[24]．圖3中，Control：空白對照；Piri：只加印度梨形孢；NaCl：200mmol/L的鹽處理；Piri+NaCl：在加入印度梨形孢的蒺藜苜蓿根部實施200mmol/L的鹽處理．

圖2 鹽脅迫下印度梨形孢定殖對紫花苜蓿生長的影響Fig.2 Effectof P.indica colonization on thebiomassof Medicago sativa under saltstress(**P＜0.01,*P＜0.05)

圖3 鹽脅迫下印度梨形孢定殖對紫花苜?？寡趸锩富钚缘挠绊慒ig.3 Effectof P.indica colonization on theantioxidantenzymeactivitiesof Medicago sativa under saltstress(**P＜0.01)

2.4 鹽脅迫下印度梨形孢定殖降低紫花苜蓿丙二醛含量

植物在受到逆境脅迫下，代謝產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量會積累．MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，用來表征細(xì)胞膜脂過氧化作用程度和植物對逆境反應(yīng)條件的強(qiáng)弱．實驗中，比較了不同處理對紫花苜蓿根部丙二醛（MDA）含量變化的影響．結(jié)果顯示，隨著NaCl濃度的升高，MDA在紫花苜蓿根部的積累也逐漸加強(qiáng)，與對照相比，定殖有印度梨形孢的植株體內(nèi)MDA含量明顯低于未接種植株（如圖4所示）．該結(jié)果顯示印度梨形孢定殖能減少鹽害脅迫對細(xì)胞膜帶來的傷害，表現(xiàn)為有效降低丙二醛的積累．

圖4 鹽脅迫下接種印度梨形孢對紫花苜蓿丙二醛含量的影響Fig.4 Effectof P.indica colonization on theMDA contentof Medicago sativa under saltstress

2.5 鹽脅迫下印度梨形孢定殖降低紫花苜蓿根部電導(dǎo)率

當(dāng)植物受到逆境脅迫時，細(xì)胞膜受破壞，其透性增大，胞內(nèi)電解質(zhì)滲出，增大了植物細(xì)胞浸提液的電導(dǎo)率．電導(dǎo)法已成為反應(yīng)植物受逆境脅迫強(qiáng)弱程度的1個精確且實用的方法．實驗中發(fā)現(xiàn)，在50 mmol/L、100mmol/L、175mmol/L、200mmol/L的鹽脅迫條件下，與未定殖的對照組相比，印度梨形孢定殖的紫花苜蓿根部電導(dǎo)率分別下降了13%，25%，26%和34%（如圖5所示）．

圖5 鹽脅迫下，印度梨形孢定殖對紫花苜蓿相對電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effectof P.indica colonizationon the relativeelectricalconductivity(REC)of Medicago sativa under saltstress(**P＜0.01)

2.6 鹽脅迫下印度梨形孢定殖誘導(dǎo)吡咯啉-5-羧基合成酶基因（P5CS）表達(dá)

已完成的研究表明印度梨形孢可以提高紫花苜蓿體內(nèi)脯氨酸含量[24]．為了從分子水平闡明機(jī)制，檢測了脯氨酸合成途徑關(guān)鍵基因P5CS的表達(dá)．P5CS基因產(chǎn)物為吡咯啉-5-羧基合成酶，可催化谷氨酸最終生成脯氨酸，P5CS是脯氨酸合成過程中的重要酶．利用RT-PCR技術(shù)對P5CS基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行半定量分析．結(jié)果顯示：正常條件下，紫花苜蓿中P5CS基因表達(dá)量很低（圖6a）、圖6b）、Conc、Piri泳道）．當(dāng)受到鹽害脅迫（200mmol/L）12 h后，P5CS基因在定殖印度梨形孢的紫花苜蓿中表達(dá)量明顯高于未定殖的對照組（圖6a）；當(dāng)鹽處理18 h后，半定量PCR顯示P5CS基因表達(dá)量依然高于對照組（圖6b）．核酸雜交實驗進(jìn)一步驗證了實驗結(jié)果（圖6c）：Northern-blot表明隨著鹽害脅迫時間的增加，P5CS基因的表達(dá)量也逐步升高．這些結(jié)果表明在鹽害脅迫下，印度梨形孢可誘導(dǎo)P5CS基因的高效表達(dá)．

圖6 鹽脅迫下接種印度梨形孢對紫花苜蓿P5CS基因表達(dá)的影響Fig.6 Effectof P.indica colonization on the P5CS expression of Medicagosativa under saltstress

3 結(jié)論

本實驗通過設(shè)置鹽害脅迫，研究了印度梨形孢在紫花苜蓿中的定殖對提高其耐鹽性的分子機(jī)制．結(jié)果表明：1）印度梨形孢能定殖紫花苜蓿根部并顯著提高鹽害脅迫下紫花苜蓿生物產(chǎn)量；2）印度梨形孢通過激活紫花苜蓿體內(nèi)抗氧化物酶活性，從而增加植物對鹽脅迫的抵抗力；3）印度梨形孢通過降低紫花苜蓿體內(nèi)丙二醛含量，增強(qiáng)對植物的保護(hù)；4）印度梨形孢定殖可降低紫花苜蓿根部電導(dǎo)率，減少鹽害脅迫對植物根部細(xì)胞的傷害；5）鹽脅迫下，印度梨形孢定殖可以誘導(dǎo)脯氨酸合成途徑吡咯啉-5-羧基合成酶基因（P5CS）表達(dá)，實現(xiàn)分子水平調(diào)控．

總之，印度梨形孢作為一種可離體培養(yǎng)的根部內(nèi)生真菌，可與紫花苜蓿形成互惠共生的菌根復(fù)合體，可將土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)和水分傳遞給宿主，有效提高宿主植物生物產(chǎn)量，減緩鹽脅迫對植物的傷害，有效促進(jìn)鹽漬化生境下植物的生長，該真菌對于指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，實施間接土壤改良具有重要意義．

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[責(zé)任編輯 田 豐 夏紅梅]

Piriformospora indica conferssalt tolerance in Medicago sativa by stimulating antioxidantenzymesactivitiesand the expression of P5CS genes

LILiang，CHEN Xi，WANG Fen，WANG Xiaoyang，QIShuting

(SchoolofMarine Scienceand Engineering,HebeiUniversity of Technology,Tianjin 300130,China)

Piriformospora indica promotesplantgrow th and confers toleranceagainstbiotic and abiotic stress.However, themolecularmechanism is required to be revealed.In the paper,the plantbiomass,MDA content,antioxidantenzyme activitiesand relative electrical conductivity(REC)aswellas the Pyrroline-5-Carboxylate Syn-thetase(P5CS)gene expressionwereanalyzed in theMedicago sativa colonized by P.indica undersaltstress.The data indicated thatMedicago sativa is a good host for P.indica.The fungus could effectively increase plantbiomass.Compared to the control,the injuriescaused by saltstresscould besignificantly reduced by P.indica colonization.Physiologicaland biochem icaldata suggested that the endophyte significantly promote antioxidantenzyme activities,reduced the relative electrical conductivity(REC)andmalondialdehyde(MDA)content.Molecular biology experiment show that the P5CS genewhich is the key gene for proline synthesiswasupregulated in the P.indica colon ized plantunder saltstress.

Piriformospora indica;medicago sativa;antioxidantenzymes;salt-tolerance

S541.9

A

1007-2373(2016)04-0029-08

10.14081/j.cnki.hgdxb.2016.04.006

2016-06-20

天津市自然科學(xué)基金（13JCYBJC37600）；河北省自然科學(xué)基金（C2014202256）

李亮（1982-），女（滿族），講師，博士．