顧文佳+譚玉靜+胡雪蓮+鐘蕾+陸壹+張奕南+段文鋒

摘要：本研究應(yīng)用熒光PCR技術(shù)鑒定水貂毛皮。方法建立：市場采購32件鞣制動物毛皮，提取足夠的DNA，應(yīng)用熒光PCR方法檢測水貂成分；其中21件水貂毛皮檢測到水貂成分，11件其他動物毛皮均未檢出水貂成分，方法特異性達(dá)到100%。方法驗證：市場采購10件毛皮服裝樣品，比較宏觀法與PCR法結(jié)果；其中宏觀法鑒定結(jié)果與PCR法一致，宏觀法無法確定水貂的 4 件樣品均可通過PCR法明確。本方法可用于水貂毛皮的鑒定，并作為宏觀法的有效補(bǔ)充和驗證。

關(guān)鍵詞：水貂毛皮；鑒別；PCR方法

中圖分類號：TS57 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Identification of Mink Fur Based on PCR Method

Abstract： The study relates to the identification of mink fur based on PCR method. Test method was established by extracting enough DNA from 32 samples of tanned animal fur from market and employing the PCR method to identify the samples. After testing， 21 samples were proved to contain key constituent of mink， while the other 11 samples were component-free by PCR method with the specification of 100%. This test method was validated by comparing the results of conventional and PCR method respectively for 10 fur coat samples from the market. The results of conventional method were identical with PCR method， and 4 samples that couldnt be identified by the conventional method were measured by the PCR method. Eventually， the PCR method can be used in the field of identification of tanned mink fur and as supplement and verification for optical method.

Key words： mink fur； identification； PCR method

貂皮素有“裘中之王”之稱，其種類繁多，有水貂、石貂、松貂、漁貂、掃雪貂等品種，其中以水貂最為常見，紫貂最為名貴。目前，毛皮鑒定常采用宏觀觀察法和顯微鏡觀察法，尚無可靠、穩(wěn)定、可重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)鑒別方法。一些形態(tài)接近或經(jīng)過特殊處理工藝的皮毛樣品鑒定仍存在難點，如黃狼皮與水貂毛皮在電子顯微鏡下也難以區(qū)別。某些商家利用消費者缺乏皮毛知識和鑒別經(jīng)驗，在商品上標(biāo)示山貂、黃金貂、艾狐貂、青根貂等近似的名稱或類別，混淆消費者。因此，如何方便、準(zhǔn)確、快速地鑒別毛皮種類一直是質(zhì)檢部門和廣大消費者關(guān)注的焦點。

本研究擬探索在分子水平上實現(xiàn)物種鑒別，突破傳統(tǒng)方法依據(jù)動物纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒別的局限性，更加客觀、穩(wěn)定。但是，由于動物毛皮經(jīng)過鞣制、漂白和染色處理，鞣制皮張中的DNA高度降解，且含有大量的酶抑制物，因此提取足夠量的DNA成為應(yīng)用PCR檢測的技術(shù)難點。本文通過研究鞣制貂毛皮的DNA提取技術(shù)，得到穩(wěn)定可靠的DNA，利用PCR技術(shù)鑒別水貂毛皮，并與宏觀觀察法、顯微鏡觀察法相比較，為貂毛皮的鑒別檢測提供一個可靠的檢測方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用水貂、紫貂、艾虎等鞣制動物毛皮購自大連某貂業(yè)有限公司、河北大營毛皮市場、桐鄉(xiāng)皮草大世界；加工過程中的水貂毛皮購自桐鄉(xiāng)某皮草有限公司。貂毛皮成衣購自河北大營毛皮市場、海寧皮革城和淘寶、京東等網(wǎng)絡(luò)店鋪。

裂解液：2%十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、1.4 mol/L NaCl、0.1 mol/L Tris-HCl、0.02 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）pH值8.0；DNA提取試劑盒（Roche，11796828001）；PCR預(yù)混液Premix Ex Taq （TaKaRa，RR390）。

1.2 儀器與設(shè)備

7500fast熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；6870冷凍研磨機(jī)（美國SPEX SamplePrep公司）；DS-11超微量分光光度計（美國DeNovix公司）；5415R離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 鞣制毛皮DNA的提取

鞣制皮張在平整處取約 4 cm2，成衣在腋下、底邊處分別取樣，各 4 cm2。將皮張剪成直徑 5 mm左右小塊，使用冷凍研磨機(jī)研磨成粉末。然后，稱取0.5 g左右樣品，加入 5 mL裂解液和40 μL蛋白酶K，置于56 ℃水浴鍋中過夜裂解。加入等體積的酚-三氯甲烷-異戊醇（25∶24∶1，v/v/v）。顛倒混勻后，10 000 g離心 5 min。取上清，加入等體積三氯甲烷-異戊醇（24∶1，v/v），混勻后10 000 g離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至另一離心管中，加入0.8倍異丙醇混勻，4 ℃下10 000 g離心10 min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀1 次，4 ℃下12 000 g離心10 min，棄上清，室溫下晾干。沉淀加入200 μL 0.1×TE緩沖液（10 mM Tris–HCl，1 mM EDTA；pH值8.0）。按照Roche DNA提取試劑盒說明將提取的DNA過柱，提取的DNA稀釋至20 ng/μL左右 4 ℃?zhèn)溆谩?

1.3.2 引物及探針

引物及探針由上海英俊生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其序列如表 1 所示。

1.3.3 熒光定量PCR擴(kuò)增體系及條件

熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含DNA模板 1～2 μL（約含20 ng DNA），Real Time PCR預(yù)混液10 μL，Rox 0.4 μL，上下游引物（10 mmol/L）各0.4 μL，探針（10 mmol/L）0.6 μL，以超純水補(bǔ)足體積。

熒光定量PCR儀反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)。使用ROX染料對熒光數(shù)值進(jìn)行校正。

陽性、陰性及空白對照擴(kuò)增正常，內(nèi)參基因擴(kuò)增Ct值< 30，且水貂目標(biāo)基因擴(kuò)增Ct值<40，判定為檢出水貂成分。

1.3.4 水貂成分的特異性檢測

收集國內(nèi)大型水貂養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的有代表性的雜交水貂、進(jìn)口純種水貂鞣制的皮張21條（包括不同加工過程、不同顏色、不同產(chǎn)地的水貂毛皮），以及常見用于冒充水貂毛皮的動物毛皮11條（包括紫貂、青根貂各 3 條，黃狼皮 2條，掃雪貂、艾虎、河貍各 1 條），按1.3.1的方法提取DNA，并按照1.3.3的方法檢測內(nèi)參基因和水貂成分。

1.3.5 市售貂毛皮服裝材質(zhì)鑒定

在市場隨機(jī)購入標(biāo)示為“貂毛皮”的服裝10件，由檢驗人員依據(jù)上海市社會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T31/07001-C001 — 2014《皮革和毛皮 材質(zhì)鑒別 通用方法》，使用宏觀觀察法和光學(xué)顯微鏡檢測動物毛皮，判定服裝主要材質(zhì)。同時，自服裝上取樣，按1.3.1的方法提取DNA，并按照1.3.3的方法檢測內(nèi)參基因和水貂成分。將 2 種方法進(jìn)行對比。

2 結(jié)果

2.1 鞣制毛皮DNA提取質(zhì)量

對水貂毛皮及其他動物毛皮共計32條按照1.3.1的方法提取鞣制毛皮DNA，A260/A280均在1.8 ～ 2.0之間，A260/ A230均大于 1，提取的DNA質(zhì)量滿足PCR實驗要求。

提取的DNA按照1.3.3方法擴(kuò)增內(nèi)參基因12S rRNA，Ct值均小于30，平均為25.15±3.68。本方法提取到了足夠的DNA，質(zhì)量滿足后續(xù)PCR實驗要求。PCR擴(kuò)增曲線如圖 1所示。

2.2 水貂成分的特異性檢測

水貂毛皮及其他動物毛皮共計32條，按照1.3.3方法擴(kuò)增水貂特異性基因Cyt b，水貂毛皮Ct值均小于35，平均為27.34±2.01，擴(kuò)增曲線如圖 2 所示；其他動物毛皮擴(kuò)增Ct值均大于40。本方法所選取水貂引物和探針具有高度的特異性，在熒光PCR反應(yīng)體系中只有水貂成分能被擴(kuò)增，其他易與水貂混肴的動物毛皮均未被擴(kuò)增。

2.3 市售貂毛皮服裝的檢測

為驗證本方法的準(zhǔn)確性和適用性，將購得的10件成品服裝先通過宏觀觀察法、光學(xué)顯微鏡法進(jìn)行材質(zhì)鑒定；然后通過本文建立的DNA方法檢測水貂成分，最后與標(biāo)簽標(biāo)識進(jìn)行比較（表 2）。如服裝有毛領(lǐng)，則計為 2 件樣品，共計14件檢測樣品，檢測結(jié)果如表 3 所示。

10件成衣的14件樣品中，宏觀法檢測無法確定的樣品為 4 件（占28.6%），均可通過PCR法檢測確定是否為水貂毛皮。宏觀法檢測可以確定的10件樣品，PCR法檢測結(jié)果均與之一致。標(biāo)簽標(biāo)示內(nèi)容與材質(zhì)鑒定結(jié)果完全一致的僅有 5 件，其中只有 1 件成衣的標(biāo)簽標(biāo)示與材質(zhì)鑒定結(jié)果完全一致。

3 討論

本研究成功建立了從鞣制動物毛皮上提取足夠用于進(jìn)一步PCR檢測的DNA方法。貂毛皮在鞣質(zhì)加工時需要進(jìn)行浸酸、油鞣、鋁鞣，達(dá)到去油軟化的目的，而且為了加工服裝的需要還要染色、鉻鞣。本研究選擇了不同加工過程中的水貂毛皮，以及不同色澤的鞣制成品進(jìn)行DNA提取，經(jīng)過DNA含量和純度檢測、內(nèi)參基因擴(kuò)增證實均提取到了可靠的可用于PCR反應(yīng)的DNA，滿足后續(xù)實驗需求。

在食品和飼料領(lǐng)域，DNA分析法早已成功地建立了多種物種鑒別的方法。如SN/T 3730 — 2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒別方法》提供對貂、狐貍、馬等多種物種的鑒別方法，可以滿足動物纖維和皮革的鑒別需求。本研究在成功提取出鞣制毛皮DNA后，直接采用標(biāo)準(zhǔn)方法中的引物和探針應(yīng)用于動物毛皮的鑒別，成功地鑒別出全部的水貂毛皮，引物特異性為100%。比前人研究結(jié)果特異性66.7%有較大提高。在毛皮成衣服裝的鑒別中，與宏觀法比較，宏觀法無法確定皮革種類的，PCR法可以確定是否為水貂成分；宏觀法能夠確定的，PCR法則與之結(jié)果一致。但對其它種屬的貂毛皮（如紫貂、松貂和石貂），以及黃狼、青根貂、兔毛皮的鑒別還待進(jìn)一步實驗，分別設(shè)計出針對不同物種的特異性引物，以便能夠更全面地鑒別動物毛皮品種。

綜上所述，本研究建立了分子生物學(xué)水平的水貂毛皮鑒別方法，能夠準(zhǔn)確、客觀地鑒別經(jīng)過加工的水貂毛皮，且該方法具有穩(wěn)定性、可重復(fù)性。不足之處在于必須對毛皮服裝進(jìn)行破壞性采樣，影響服裝成品的銷售。本方法宜作為宏觀觀察法和顯微鏡檢測法的補(bǔ)充確認(rèn)方法，當(dāng)交易中產(chǎn)生疑問時提供客觀結(jié)果。

參考文獻(xiàn)（略）