孫虎芝，任慧英，張 燦

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109)

噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37的原核表達(dá)與鑒定

孫虎芝，任慧英，張 燦*

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109)

為了研究噬菌體尾絲蛋白gp37在識別宿主菌大腸埃希菌K12過程中的作用，PCR擴(kuò)增獲得gp37基因C端1 161 bp序列，以EGFP為熒光標(biāo)簽，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37，在大腸埃希菌BL21(DE3)中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白EGFP-gp37，親和層析純化蛋白。SDS-PAGE及Western blot檢測結(jié)果表明,重組蛋白EGFP-gp37在大腸埃希菌BL21(DE3)為可溶性表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白量的23%。EGFP-gp37融合蛋白與大腸埃希菌K12相互作用，激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示,尾絲蛋白gp37能夠吸附到宿主菌K12表面，表明尾絲蛋白gp37參與宿主菌受體的識別和吸附過程。

噬菌體Bp7；尾絲蛋白gp37；綠色熒光蛋白EGFP；大腸埃希菌K12

噬菌體作為一種細(xì)菌病毒，通過侵染細(xì)菌從而使其裂解，是自然界中細(xì)菌的天敵。近年來，隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌的耐藥情況日益嚴(yán)重，噬菌體作為抗菌制劑用于耐藥菌的防治研究引起高度重視[1]。

T4類噬菌體為有尾噬菌體，在形態(tài)上相似，頭部為20面體，尾部可以伸縮，由基板和長短兩組尾絲構(gòu)成[2]。長尾絲通過其末端的尾絲蛋白識別宿主表面的特異性受體并與之可逆性結(jié)合，從而啟動噬菌體侵染宿主菌的過程，這種識別受體的特異性決定了噬菌體的宿主范圍[3-4]。gp37位于T4類噬菌體長尾絲末端，其C端能夠識別宿主菌表面受體，引發(fā)噬菌體的吸附過程，是T4類噬菌體識別受體的關(guān)鍵蛋白[5-6]。在前期研究工作中，從雞場糞便中分離到一株噬菌體Bp7，具有寬宿主譜的特性，基因組序列分析顯示其屬于T4類噬菌體[7]。噬菌體Bp7基因組的功能基因預(yù)測表明，開放閱讀框ORF37編碼尾絲蛋白gp37，與T4類噬菌體的尾絲蛋白gp37具有同源性，因此推測其在噬菌體Bp7識別宿主菌受體過程中具有關(guān)鍵作用。

為了驗(yàn)證上述假說，本試驗(yàn)著眼于噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37 的C端序列，以綠色熒光蛋白為標(biāo)簽，檢測其與宿主菌大腸埃希菌K12的結(jié)合情況，從而確定噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37是否參與識別宿主菌的受體，為進(jìn)一步研究噬菌體Bp7與宿主菌的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 質(zhì)粒pET-28a、質(zhì)粒pEGFP-N1、質(zhì)粒pGEX-6P-1-gp37、大腸埃希菌BL21(DE3)菌株、大腸埃希菌DH5α菌株,均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存的；大腸埃希菌K12,購自河南省微生物菌種資源庫菌種保藏中心。

1.1.2 試劑 營養(yǎng)瓊脂,購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量快速提取試劑盒,購自北京艾德萊生物科技有限公司；T4 DNA連接酶、DNA Marker DL 2 000、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、XholⅠ，二抗為HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG,均購自寶生物工程(大連)有限公司;一抗為鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體,Top Sciense公司產(chǎn)品;DAB試劑盒,購自Biosharp公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因EGFP及gp37的引物設(shè)計 參照GenBank已登錄的EGFP序列(GI: CVU55762)和噬菌體Bp7的基因組序列(GI: HQ829472)，以EGFP基因和尾絲蛋白gp37 C端1 161 bp為目的基因，利用Primer5.0軟件設(shè)計引物，并分別在EGFP基因上下游引物P1、P2引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線表示)，在gp37基因上、下游引物P3、P4引入SalⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線表示)；在EGFP基因下游引物中引入一個linker(斜體表示)，引物序列如下：P1： 5′-GGC GAA TTC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG-3′；P2： 5′-CCC GTC GACTCGGCTCCAGGAACGCCATCGGCTCCAGGAACGCCATCGGCTCCAGGAACGCCATTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3′；P3： 5′-CAG GTC GAC GCT ACT CGT GTT TCT A-3′ ；P4： 5′-TTG CTC GAG CCC GAA GGC CCT TTC TTAT-3′ 。

1.2.2 目的基因EGFP及gp37的PCR擴(kuò)增及鑒定 分別以質(zhì)粒pEGFP-N1和質(zhì)粒pGEX-6P-1-gp37為模板，擴(kuò)增目的基因片段EGFP和gp37，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37的構(gòu)建 分別將載體pET-28a和目的基因EGFP用EcoRⅠ與SalⅠ雙酶切，產(chǎn)物回收后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α后挑菌提取質(zhì)粒，將所得的質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR與雙酶切鑒定,選出陽性克隆，命名為pET-28a-EGFP。送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，以確保插入基因的準(zhǔn)確。將目的基因片段gp37與測序正確的重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP用SalⅠ與XhoⅠ雙酶切，雙酶切產(chǎn)物回收后連接，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α后挑菌提取質(zhì)粒，將所得的質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR與雙酶切鑒定,選出陽性克隆，命名為pET-28a-EGFP-gp37。送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，以確保插入基因的準(zhǔn)確。

1.2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-EGFP-gp37/BL21(DE3)的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析 將重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸埃希菌BL21(DE3)，隨機(jī)挑取含Kana的LB平板上長出的單菌落，接種含Kana的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，取70 μL接種7 mL含Kana的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD 600 nm約為0.6～0.8，加入終濃度為0.6 mmol/L IPTG，37℃振蕩培養(yǎng)6 h，離心，分別收集培養(yǎng)上清液和菌體沉淀，菌體以PBS重懸后在冰浴條件下進(jìn)行超聲波裂解，裂解條件為：冰浴間歇超聲30 min，超聲2 s，間歇2 s。超聲后的菌液12 000 r/min 、4℃離心5 min，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達(dá)。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的純化以及Western blot 檢測 收集超聲破碎后的菌液上清，用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化，純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行免疫印跡，一抗為鼠抗HIS標(biāo)簽的單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用底物二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.2.6 融合蛋白EGFP-gp37與宿主菌相互作用 保存的宿主菌大腸埃希菌K12菌種進(jìn)行普通營養(yǎng)瓊脂平板復(fù)蘇，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，37℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，分別取500 μL加入到2個EP管中8 000 r/min離心3 min，用200 μL的PBS液重懸，其中一管加入200 μL純化的融合蛋白EGFP-gp37(0.2 mg/mL)，另一管加入等量的EGFP蛋白作對照，37℃作用10 min，2 000r /min離心10 min，加入1 mL的PBS液洗滌2次，激光共聚焦顯微鏡檢測兩者相互作用情況。

2 結(jié)果

2.1 目的基因EGFP及gp37基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別以質(zhì)粒pEGFP-N1和pGEX-6P-1-gp37為模板，擴(kuò)增EGFP和gp37基因序列，10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。

M. DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～3.擴(kuò)增的gp37基因；4～6.擴(kuò)增的EGFP基因

M. DNA Marker DL 2 000;1-3.PCR products of gp37 gene;4-6.PCR products of EGFP gene

圖1 EGFP基因與gp37基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 PCR amplification results of EGFP and gp37 gene

由圖1可知，PCR擴(kuò)增后分別出現(xiàn)特異的條帶，大小約1 161 bp和774 bp，與預(yù)期的條帶大小一致。

2.2 重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37的PCR鑒定與雙酶切鑒定結(jié)果

用EcoRⅠ與SalⅠ雙酶切EGFP和載體，構(gòu)建pET-28a-EGFP質(zhì)粒；用SalⅠ與XhoⅠ雙酶切g(shù)p37和載體pET-28a-EGFP，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37。將構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定與雙酶切鑒定，10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(圖2)。對篩選出的陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果表明目的基因序列正確。

由圖2可見，對于構(gòu)建的質(zhì)粒pET-28a-EGFP，PCR擴(kuò)增出774 bp的條帶與目的基因EGFP一致，經(jīng)過雙酶切得到2個條帶，其中包括與預(yù)期774 bp大小一致的條帶。對于構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37，PCR擴(kuò)增出1 161 bp的條帶與目的基因gp37一致，經(jīng)過雙酶切得到2個條帶，其中包括與預(yù)期1 161 bp大小一致的條帶。測序結(jié)果表明，獲得了正確的重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37。

2.3 融合蛋白EGFP-gp37的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析

重組菌pET-28a-EGFP-gp37/BL21(DE3)通過IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果見圖3。通過SDS-PAGE可以發(fā)現(xiàn)，融合蛋白在上清中可溶性表達(dá)，表達(dá)量約占菌體總蛋白量的23%。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.pET-28a-EGFP；2.pET-28a-EGFP雙酶切鑒定；3.pET-28a-EGFP-gp37；4.pET-28a-EGFP-37雙酶切鑒定

M.DNA Marker DL 2 000;1.pET-28a-EGFP;2.Double enzymes digestion of pET-28a-EGFP;3.pET-28a-EGFP-gp37;4.Double enzymes digestion of pET-28a-EGFP-gp37

圖2 pET-28a-EGFP-gp37的PCR與雙酶切鑒定

Fig.2 PCR and double enzymes digestion identification of EGFP pET-28a-EGFP-gp37

2.4 融合蛋白的純化以及Western blot檢測

原核表達(dá)的EGFP-gp37融合蛋白利用親和層析純化，洗脫時每管收集1 mL，純化后進(jìn)行SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)純化第2管含量最高(圖3)，進(jìn)行Western blot檢測時，出現(xiàn)一條分子質(zhì)量71 ku特異性的結(jié)合帶(圖3)，根據(jù)分子質(zhì)量大小推測，這條

帶分子質(zhì)量與目的蛋白的分子質(zhì)量相同，從而證明表達(dá)的蛋白是EGFP-gp37融合蛋白。

2.5 融合蛋白EGFP-gp37與宿主菌相互作用

融合蛋白EGFP與宿主菌大腸埃希菌K12相互作用，利用激光共聚焦顯微鏡觀察二者相互作用(圖4)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.空質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá);2.重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37的誘導(dǎo)表達(dá);3.菌體裂解上清;4.菌體裂解沉淀;5～7.不同管洗脫的融合蛋白;8.Western blot

M.Protein molecular weight Marker;1.Expression induced by backbone plasmid;2.Expression of recombinant plasmid pET-28a-EGFP-gp37;3.The supernatant of lysates; 4.The deposition of lysates;5-7.Fusion proteins of different tubes;8.Western blot

圖3 融合蛋白EGFP-gp37 SDS-PAGE及Western blot分析

Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant protein EGFP-gp37

A.熒光條件下拍攝;B.白光條件下拍攝;C.A與B的疊加;D.對照組

A.Shooting under the condition of fluorescence;B.Shooting under white light;C.Overlapping of A and B;D.Control group

圖4 激光共聚焦檢測

Fig.4 Results of laser confocal detection

由圖4可知，試驗(yàn)組中有菌體存在的地方就有綠色熒光，而對照組中沒有，這說明蛋白EGFP-37能夠結(jié)合到宿主菌K12上，而EGFP蛋白不能與宿主菌K12結(jié)合，表明尾絲蛋白gp37參與噬菌體Bp7吸附大腸埃希菌K12的過程，能夠吸附到宿主菌表面。

3 討論

近年來，隨著抗生素的使用以及耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，噬菌體治療也越來越受到人們的關(guān)注。本試驗(yàn)中的噬菌體Bp7來自雞場糞便，并且完成了全基因組測序，基因組分析顯示，噬菌體Bp7與T4類噬菌體同源性極高，生物學(xué)特征分析顯示，其對雞致病性大腸埃希菌的裂解率達(dá)45%，具有較寬的裂解譜[8]。在T4類噬菌體中，尾絲蛋白gp37參與宿主菌表面受體的識別[9]，因此，本試驗(yàn)對噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37進(jìn)行研究，確定其在噬菌體Bp7識別宿主菌表面受體過程中的作用。

蛋白之間的相互作用可以通過多種方法進(jìn)行檢測，其中最常用的就是CoIP和Pull-down方法，但是需要SDS-PAGE以及轉(zhuǎn)膜的操作過程，費(fèi)時繁瑣[10]。EGFP作為一種報告分子，可以用于檢測蛋白表達(dá)、蛋白和細(xì)胞熒光示蹤、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能的研究[11]。庾慶華等報道了利用EGFP研究禽腸炎沙門菌在雞腸道定植分布規(guī)律和芽胞桿菌在仔豬和雛雞體內(nèi)的動態(tài)分布[12]。Warren R M等[13]報道了利用綠色熒光蛋白標(biāo)記噬菌體對細(xì)菌病原體進(jìn)行檢測。Bae H W等[14]報道了利用綠色熒光蛋白標(biāo)記噬菌體蛋白，發(fā)現(xiàn)了抑制Ⅳ型菌毛裝配所需的細(xì)菌ATP酶。本試驗(yàn)通過綠色熒光蛋白與尾絲蛋白gp37的融合表達(dá)，使尾絲蛋白帶有綠色熒光標(biāo)簽，通過激光共聚焦顯微鏡直接觀察尾絲蛋白gp37與大腸埃希菌K12的相互作用情況。自然光條件下菌體是無色的，熒光條件下檢測到菌體帶綠色熒光，試驗(yàn)結(jié)果顯示，尾絲蛋白gp37能夠結(jié)合到宿主菌K12表面。利用綠色熒光可追蹤的特點(diǎn)來觀察尾絲蛋白gp37與宿主菌K12的吸附過程，減少了SDS-PAGE凝膠電泳以及Western blot轉(zhuǎn)膜等復(fù)雜的過程，不僅節(jié)約了時間，而且試驗(yàn)結(jié)果更加清晰明了。

本試驗(yàn)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37，實(shí)現(xiàn)了綠色熒光蛋白EGFP與尾絲蛋白gp37重組蛋白的融合表達(dá)，獲得71 ku的可溶性蛋白EGFP-gp37。融合蛋白EGFP-gp37能夠結(jié)合到宿主菌表面，表明尾絲蛋白gp37參與宿主菌受體的識別。在T4類噬菌體中尾絲蛋白gp37是噬菌體與宿主菌的相互作用過程中的關(guān)鍵蛋白，本研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究噬菌體Bp7與宿主菌的相互作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

[1] 蔣 羽，李 偉，范蒙光.細(xì)菌抗噬菌體感染分子機(jī)制[J].疾病監(jiān)測,2015(8):679-682.

[2] Yap M L，Rossmann M G.Structure and function of bacteriophage T4[J].Future Microbiol,2014,9(12):1319-1327.

[3] Simpson D J，Sacher J C，Szymanski C M.Exploring the interactions between bacteriophage-encoded glycan binding proteins and carbohydrates[J].Curr Opin Struct Biol,2015,34:69-77.

[4] Buth S A，Menin L，Shneider M M，et al.Structure and biophysical properties of a triple-stranded beta-helix comprising the central spike of bacteriophage T4[J].Viruses,2015,7(8):4676-4706.

[5] Brzozowska E，Smietana M，Koba M，et al.Recognition of bacterial lipopolysaccharide using bacteriophage-adhesin-coated long-period gratings[J].Biosens Bioelectron，2015,67:93-99.

[6] Bartual S G，Otero J M，Garcia-Doval C，et al.Structure of the bacteriophage T4 long tail fiber receptor-binding tip[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(47):20287-20292.

[7] 劉霄飛，任慧英，劉文華，等.大腸桿菌噬菌體Bp7裂解性能分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2010(9):18-21.

[8] Zhang C，Li W，Liu W，et al.T4-like phage Bp7,a potential antimicrobial agent for controlling drug-resistantEscherichiacoliin chickens[J].Appl Environ Microbiol,2013,79(18):5559-5565.

[9] Rydosz A，Brzozowska E，Górska S，et al.A broadband capacitive sensing method for label-free bacterial LPS detection[J].Biosens Bioelectron,2016,75:328-336.

[10] 劉 文.周期蛋白依賴的激酶10、磷脂酶C伽馬1及熱休克蛋白90在昆蟲蛻皮激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的功能研究[D].山東濟(jì)南：山東大學(xué),2014.

[11] Kan S C，Chen C M，Lin C C，et al.Deciphering EGFP production via surface display and self-cleavage intein system in different hosts[J]. J Taiwan Instit Chem Engine,2015,55:1-6.

[12] 王高玲，李 濤，史冰田，等.hilA基因兩端51 bp序列對示蹤標(biāo)記性綠色熒光蛋白在禽腸炎沙門氏菌中倍增表達(dá)效率的鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2015(6):409-413.

[13] Van der Merwe R G，van Helden P D，Warren R M，et al.Phage-based detection of bacterial pathogens[J].Analyst,2014,139(11):2617-2626.

[14] Chung I Y，Jang H J，Bae H W，et al.A phage protein that inhibits the bacterial ATPase required for type IV pilus assembly[J].Proceed Natl Aca Sci,2014,111(31):11503-11508.

Prodaryotic Expression and Activity Determination of Tail Fiber Protein gp37 of Phage Bp7

SUN Hu-zhi,REN Hui-ying,ZHANG Can

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao,Shandong,266109,China)

In order to identify the tail fiber protein gp37 function in phage Bp7 adsorbing onE.coliK12,1 161 bp C terminal sequence of gp37 as amplified by PCR,and recombinant plasmid pET-28a-EGFP-gp37 was constructed with a fluorescent tag of EGFP.InE.coliBL21(DE3),the fusion protein EGFP-gp37 was induced by IPTG to express and purified by affinity chromatography.SDS-PAGE and Western blot analysis showed that protein EGFP-gp37 was expressed in supernatant ofE.coliBL21(DE3).The expression level reached 23%.The purfied protein of EGFP-gp37 was incubated withE.coliK12 and detected by laser confocal microscopy.The result showed that protein EGFP-gp37 adsorbed on the surface ofE.coliK12,which indicated that tail fiber protein gp37 participated in the receptor recognition of phage Bp7.

phage Bp7;tail fiber protein gp37;green fluorescent protein EGFP;E.coliK12

2015-10-22

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新計劃項(xiàng)目(QYC201406)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2013CQ024；ZR2015CM020)

孫虎芝(1991-)，男，山東乳山人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.65;Q789

A

1007-5038(2016)05-0010-05