朱路，勾越陽(yáng)，鄢曉君，周律，廖泉，王斌，葉春祥，馮長(zhǎng)江，杜亞楠

1.清華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程系，北京 100084；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 衛(wèi)生裝備研究所，天津 300161；3.北京協(xié)和醫(yī)院 外科，北京 100032；4.北京大學(xué)人民醫(yī)院 a.骨關(guān)節(jié)科；b.胃腸外科；c.胸外科，北京 100044

基于病人自體腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的個(gè)體化精準(zhǔn)用藥

朱路1，2，勾越陽(yáng)1，鄢曉君1，周律1，廖泉3，王斌4a，葉春祥4b，馮長(zhǎng)江4c，杜亞楠1

1.清華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程系，北京 100084；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 衛(wèi)生裝備研究所，天津 300161；3.北京協(xié)和醫(yī)院 外科，北京 100032；4.北京大學(xué)人民醫(yī)院 a.骨關(guān)節(jié)科；b.胃腸外科；c.胸外科，北京 100044

精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出為腫瘤治療開(kāi)創(chuàng)了新的時(shí)代。利用基因測(cè)序技術(shù)精準(zhǔn)地找到患者基因突變靶標(biāo)，采取針對(duì)性的化療藥物治療，對(duì)癌細(xì)胞完成“精確打擊”成為腫瘤治療的新模式。然而，由于癌細(xì)胞基因的不穩(wěn)定性，僅僅采用基因測(cè)序這種間接方式，在大多數(shù)情況下并不足以給出最合理的用藥方案。而精準(zhǔn)醫(yī)療不僅僅是基因測(cè)序，還包括了多層面醫(yī)療技術(shù)的使用。利用病人自體腫瘤細(xì)胞體外模型對(duì)候選藥物或藥物組合進(jìn)行精確的藥理分析和藥效檢測(cè)，是一種更為直接、更為準(zhǔn)確的腫瘤診治模式。將基因篩選與體外腫瘤模型分析相結(jié)合，可以更大程度上的篩選出對(duì)病人個(gè)體有效的化療藥物，從而最終實(shí)現(xiàn)對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化精準(zhǔn)用藥的目的。本文對(duì)基于病人自體腫瘤細(xì)胞體外模型指導(dǎo)個(gè)性化用藥的發(fā)展歷程、現(xiàn)狀及未來(lái)展望進(jìn)行了綜述。

精準(zhǔn)醫(yī)療；病人自體腫瘤細(xì)胞；藥敏檢測(cè)；三維培養(yǎng)

1 精準(zhǔn)醫(yī)療的概念

1.1 精準(zhǔn)醫(yī)療的背景

精準(zhǔn)醫(yī)療需考慮患者個(gè)體化差異，其中一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)是利用基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和醫(yī)學(xué)前沿技術(shù)，通過(guò)分析大樣本人群和特定疾病，精確地找到病因和靶點(diǎn)，并據(jù)此制定個(gè)性化精準(zhǔn)治療方案。精準(zhǔn)醫(yī)療將改變現(xiàn)有的診斷、治療模式，為醫(yī)學(xué)發(fā)展帶來(lái)一場(chǎng)變革[1]。目前我國(guó)正在制定“精準(zhǔn)醫(yī)療”戰(zhàn)略規(guī)劃，這一規(guī)劃有望納入到“十三五”重大科技專(zhuān)項(xiàng)。與傳統(tǒng)群體醫(yī)療以個(gè)人經(jīng)驗(yàn)為主導(dǎo)、片面強(qiáng)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)化不同，精準(zhǔn)醫(yī)療更注重利用患者自身的分子生物學(xué)信息，制定與病人自身病理特點(diǎn)相匹配的個(gè)體化診斷和治療策略。這種更為精確的個(gè)體化醫(yī)療模式在臨床實(shí)踐中顯現(xiàn)出高度的確定性、預(yù)見(jiàn)性和可控性，特別適用于惡性腫瘤、糖尿病等重大疾病的臨床診治。通過(guò)整合各類(lèi)組學(xué)技術(shù)和生物信息與大數(shù)據(jù)科學(xué)的交叉應(yīng)用，精準(zhǔn)醫(yī)療可以更有針對(duì)性的對(duì)特定患者的特定疾病進(jìn)行個(gè)性化治療。人們普遍相信這種新型醫(yī)療模式必將開(kāi)創(chuàng)一個(gè)新的醫(yī)學(xué)時(shí)代[2]。

1.2 精準(zhǔn)醫(yī)療用于腫瘤治療

癌癥是當(dāng)今危害人類(lèi)健康的主要疾病。在中國(guó)，癌癥發(fā)生率正處于快速上升期并已成為第一死因。癌癥本質(zhì)上與基因突變息息相關(guān)，而這一基因變異過(guò)程的發(fā)生和演變通常是動(dòng)態(tài)的，且存在高度異質(zhì)性。不同的疾病進(jìn)展階段以及不同的腫瘤細(xì)胞可能攜帶不同的變異信息，從而對(duì)以大規(guī)模人群為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)和測(cè)試藥物的治療模式造成了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[3]。由于新一代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，人們已經(jīng)能夠快速、高分辨率地分析基因組，通過(guò)高通量測(cè)序方法獲得腫瘤基因突變、拷貝數(shù)變異、基因移位和融合基因等海量基因變異信息；然后從海量的組學(xué)數(shù)據(jù)中解碼和提煉相關(guān)變異信息，提取起決定性作用的關(guān)鍵數(shù)據(jù)，從而在成千上萬(wàn)的基因突變位點(diǎn)中，找到真正引發(fā)癌變的關(guān)鍵基因。再以大數(shù)據(jù)分析結(jié)果作為依據(jù)，制定因人因病而異的治療方案[4]。然而，由于腫瘤的異質(zhì)性，同一腫瘤患者不同癌細(xì)胞的基因突變并不一定相同，不同關(guān)鍵基因突變的隨機(jī)組合，導(dǎo)致癌癥治療難度大為增加；更為嚴(yán)重的是癌癥細(xì)胞周期檢查點(diǎn)已破壞，各種新突變及融合基因仍在不斷累積，這些新突變及融合基因可能會(huì)破壞這些靶向藥物的靶點(diǎn)及其下游信號(hào)，從而使靶向治療藥物失效。因此，看似已抑制了關(guān)鍵基因，但癌癥細(xì)胞又建立新的關(guān)鍵基因并產(chǎn)生旁路，導(dǎo)致費(fèi)盡心思尋找到的藥物在幾個(gè)月時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生抗藥性而失效[5]。從臨床實(shí)踐來(lái)看，由基因（生物標(biāo)記）檢測(cè)及診斷并通過(guò)統(tǒng)計(jì)/數(shù)學(xué)信息模型、生物大數(shù)據(jù)分析提煉的方法選擇治療方案仍處于發(fā)展階段，在可靠性和重復(fù)性方面還具有相當(dāng)大的挑戰(zhàn)，導(dǎo)致目前完全依賴(lài)于這種間接性精準(zhǔn)醫(yī)療方案在臨床應(yīng)用上仍有局限性。

1.3 基因組精準(zhǔn)篩查與自體腫瘤細(xì)胞體外檢測(cè)聯(lián)合使用

為了彌補(bǔ)基因組精準(zhǔn)篩查技術(shù)在可靠性和重復(fù)性方面的不足，人們開(kāi)始嘗試將病人自體腫瘤細(xì)胞的體外藥敏檢測(cè)技術(shù)引入到精準(zhǔn)醫(yī)療方案中。杭渤等[5]等報(bào)道的癌癥醫(yī)療中的個(gè)體化用藥方案，見(jiàn)圖1，通過(guò)在體外構(gòu)造與病人腫瘤細(xì)胞相適應(yīng)的生長(zhǎng)微環(huán)境，使其在體外迅速適應(yīng)并快速增殖，再根據(jù)基因組精準(zhǔn)篩查遴選出的用藥方案，直接觀察抗癌藥物或藥物組合對(duì)病人自體癌細(xì)胞的反應(yīng)，從而在臨床用藥前對(duì)基因組篩查確定的用藥方案進(jìn)行驗(yàn)證和擴(kuò)展，為病人提供更為安全、可靠的個(gè)體化精準(zhǔn)用藥方案。特別是使用體外三維組織或類(lèi)器官作為抗癌藥物的篩選和驗(yàn)證模型已越來(lái)越多的受到人們的重視[5]。

圖1 癌癥醫(yī)療中的個(gè)體化用藥方案[5]

2 基于自體腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的藥敏測(cè)試技術(shù)介紹及分類(lèi)

2.1 技術(shù)介紹

雖然自體腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)模型千差萬(wàn)別，但其基本的實(shí)驗(yàn)思路是十分相似的。首先在手術(shù)切割或者活檢過(guò)程中得到臨床病人的腫瘤組織樣本，然后通過(guò)物理與酶消化的方式獲得所需的腫瘤細(xì)胞或微組織，在體外進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。當(dāng)其生長(zhǎng)到足夠的細(xì)胞數(shù)量時(shí)，分裝到高通量的孔板中，用已有的抗癌藥物庫(kù)進(jìn)行藥物篩查，通過(guò)細(xì)胞活性和生物標(biāo)志物表達(dá)的檢測(cè)，確定有效的藥物，并最終指導(dǎo)病人的用藥[6]。

2.2 按腫瘤組織處理結(jié)果分類(lèi)

2.2.1 單細(xì)胞

通過(guò)以酶消化為主、物理消化為輔的方式將腫瘤組織分離出單細(xì)胞懸液，在單細(xì)胞懸液中加測(cè)試藥物進(jìn)行培養(yǎng)，以觀察克隆形成、MTT、MTS顏色、ATP熒光值、放射性摻入變化等不同檢測(cè)終點(diǎn)，評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。其中最常用的方法是MTT、MTS、ATP法。該類(lèi)方法一般來(lái)說(shuō)具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、無(wú)需特殊設(shè)備、便于開(kāi)展、實(shí)驗(yàn)時(shí)間短等特點(diǎn)。但成功率低、指導(dǎo)臨床選擇化療藥物/方案與臨床結(jié)果符合率低、可靠性差。這是因?yàn)樵?xì)胞分離成單細(xì)胞后，不容易培養(yǎng)生長(zhǎng)，大多數(shù)情況下加或不加藥物細(xì)胞均會(huì)因無(wú)法貼壁生長(zhǎng)而凋亡。這可能是長(zhǎng)期以來(lái)臨床醫(yī)生未能接受藥敏指導(dǎo)化療的主要原因之一。

另外，該類(lèi)方法未能模擬體內(nèi)微環(huán)境，不能對(duì)經(jīng)肝酶代謝后產(chǎn)生抗癌作用的藥物如環(huán)磷酰胺等進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。盡管檢測(cè)的手段不同，但原代細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增是該類(lèi)方法的瓶頸，制約著其成功率和可靠性。同時(shí)分離后的原代細(xì)胞中不可避免地混雜有腫瘤間質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞（通常較腫瘤細(xì)胞更易生長(zhǎng)）等，可能對(duì)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果有影響。

2.2.2 微組織塊

由于以上方法均須分離細(xì)胞，破壞了組織結(jié)構(gòu)的完整性，影響了腫瘤細(xì)胞之間的相互聯(lián)系，導(dǎo)致結(jié)果欠可靠。為此，Hoffman于20世紀(jì)90年代初建立組織塊培養(yǎng)（HistocultureDrug Response Assay，HDRA）方法。該法是將腫瘤組織以組織塊的形式在膠原上進(jìn)行培養(yǎng)，然后加入化療藥物，觀察組織塊對(duì)化療藥物的敏感性。其特點(diǎn)是保持細(xì)胞間接觸，維持了組織形態(tài)和功能，更加接近機(jī)體實(shí)體瘤內(nèi)環(huán)境，臨床效果相關(guān)性好，非常適用于臨床應(yīng)用。研究表明，HDRA法可有效指導(dǎo)臨床化療用藥，提高多種腫瘤的臨床療效，例如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、骨肉瘤、頭頸部鱗癌等。Tanahashi等報(bào)道了70例肺癌患者用HDRA法檢測(cè)藥敏，其中16例III期肺癌患者接受了誘導(dǎo)化療，39例III期肺癌患者接受了輔助化療，均按照兩種敏感藥物化療、一種敏感藥物化療、不敏感藥物化療分成3組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于采用誘導(dǎo)化療者，3組的有效率分別為100%、50%和0%，兩種敏感藥物化療組的3年存活率高于后兩組。對(duì)于采用輔助化療者，兩種敏感藥物化療組具有更高的存活率（P=0.03），提示HDRA指導(dǎo)的化療有助于提高臨床療效和生存時(shí)間。

中山大學(xué)符立梧、梁永鉅等對(duì)此方法進(jìn)行了改良，已成功建立了一種微小組織塊培養(yǎng)-MTT終點(diǎn)染色-計(jì)算機(jī)圖像分析體外藥物敏感性試驗(yàn)法。該方法采用體外腫瘤組織塊培養(yǎng)，通過(guò)分析給藥前和給藥后腫瘤組織的面積及顏色變化，獲得多種單藥或聯(lián)合用藥以及不同藥物濃度下的腫瘤生長(zhǎng)抑制率。目前已用此法檢測(cè)肝癌、卵巢癌、胃癌、頭頸部腫瘤等實(shí)體瘤數(shù)百例，取得良好的效果，其檢測(cè)結(jié)果總符合率達(dá)85.7%。該法是目前較理想的腫瘤藥敏試驗(yàn)方法，具有方法模擬體內(nèi)微環(huán)境、穩(wěn)定、重復(fù)性好、標(biāo)本需要量少、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短（5 d）、可評(píng)價(jià)率高、結(jié)果直觀可靠等優(yōu)點(diǎn)，將被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)腫瘤患者的外周血白細(xì)胞（Peripheral Blood Leucocyte，PBL）和腫瘤細(xì)胞這兩者對(duì)各種化療藥物敏感性的相關(guān)性進(jìn)行了大量的研究，結(jié)果顯示多種腫瘤患者的PBL與腫瘤細(xì)胞體外藥敏檢測(cè)具有較好的相關(guān)性，而且腫瘤患者的PBL和腫瘤細(xì)胞一樣，對(duì)不同的藥物敏感性不一樣，都具有個(gè)體差異[7]。因此，對(duì)于在臨床上對(duì)無(wú)法取到腫瘤標(biāo)本進(jìn)行藥敏檢測(cè)的患者，可考慮取外周血淋巴細(xì)胞代替，這樣可提高藥敏試驗(yàn)的臨床適用性，但仍需廣泛驗(yàn)證。藥物基因組學(xué)與藥敏試驗(yàn)相結(jié)合在指導(dǎo)腫瘤化療方面也取得了明顯的效果，如結(jié)腸癌患者胸苷合成酶（TS）基因多態(tài)性與5-Fu的療效相關(guān)，研究表明TYMS*2/*2或TYMS*2/*3型的患者比TYMS*3/*3型對(duì)5-Fu的敏感性更高且毒副作用更小。Chang等[8]的最新研究發(fā)現(xiàn)，MDR1 SNPs與紫杉醇的藥效相關(guān)：與MDR1 3435 CC基因型相比，3435 CT預(yù)示著接受單一紫杉醇治療的晚期乳腺癌患者的總體生存率更短。表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制藥吉非替尼在治療非小細(xì)胞肺癌研究中也發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織EGFR突變預(yù)示著吉非替尼治療有效，無(wú)突變者敏感性顯著降低。這些研究提示，腫瘤藥敏試驗(yàn)與患者的遺傳背景相結(jié)合應(yīng)用于臨床腫瘤治療，對(duì)提高個(gè)體化治療效果和降低毒副反應(yīng)的發(fā)生具有重要意義。

2.3 按腫瘤模型培養(yǎng)方式分類(lèi)

2.3.1 二維平面培養(yǎng)與三維立體培養(yǎng)

二維平面培養(yǎng)是目前體外構(gòu)建腫瘤模型的常用方法，利用這種體外模型人們可以對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡及藥物反應(yīng)進(jìn)行分析。二維單層細(xì)胞培養(yǎng)與三維生物材料培養(yǎng)比較，見(jiàn)圖2[9]。作為一種過(guò)度簡(jiǎn)單化并嚴(yán)重脫離機(jī)體生物學(xué)系統(tǒng)的培養(yǎng)方式，二維培養(yǎng)體系缺乏真實(shí)腫瘤組織的三維微環(huán)境，如缺少細(xì)胞外基質(zhì)的支持貼壁，生長(zhǎng)的細(xì)胞失去了原有形態(tài)特征及生長(zhǎng)分化的能力，缺乏三維立體構(gòu)型以研究細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用，尤其在研究惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移方面存在嚴(yán)重的局限性，導(dǎo)致其在抗腫瘤藥物篩選和檢測(cè)中經(jīng)常造成假陽(yáng)性[9]。

圖2 二維單層細(xì)胞培養(yǎng)與三維生物材料培養(yǎng)比較[9]

體外細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)重要原則就是模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境。相對(duì)于二維扁平化培養(yǎng)的細(xì)胞模型，三維立體環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞在骨架形態(tài)、分化水平、遷移能力以及細(xì)胞之間相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等方面更加接近于體內(nèi)真實(shí)情況。因此在這種微環(huán)境下生長(zhǎng)的腫瘤模型其藥物反應(yīng)、抗藥性程度以及藥物滲透水平與體內(nèi)較為接近，從而可更加準(zhǔn)確地反映候選藥物或藥物組合的效果。已有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)此進(jìn)行了研究，例如乳腺癌細(xì)胞系MCF7在二維培養(yǎng)時(shí)以及在基于殼聚糖的三維支架時(shí)，在細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)目、葡萄糖的消耗量以及代謝產(chǎn)物乳酸量上都表現(xiàn)出了明顯的不同。在初始葡萄糖濃度相同的情況下，三維培養(yǎng)時(shí)MCF7在快速增長(zhǎng)階段消耗的葡萄糖要快，細(xì)胞數(shù)目較多；在環(huán)境中葡萄糖趨于耗盡時(shí)，三維培養(yǎng)的MCF7明顯比二維培養(yǎng)的MCF7數(shù)量要多，在這個(gè)過(guò)程中，三維培養(yǎng)的MCF7所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物乳酸量也比二維培養(yǎng)所產(chǎn)生的乳酸量逐漸增多[10]。2.3.2 癌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)與間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)

腫瘤微環(huán)境除了具備三維空間結(jié)構(gòu)，還包含有多種間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）。近年來(lái)的研究表明，腫瘤的發(fā)展惡化不僅僅與腫瘤細(xì)胞的自分泌有關(guān)，而且受周?chē)?xì)胞及基質(zhì)的影響很大，與腫瘤細(xì)胞共同組成一個(gè)系統(tǒng)完備的微環(huán)境。這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等。腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用不僅可以影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，同時(shí)也會(huì)顯著影響腫瘤對(duì)藥物的敏感性和耐受性。這種腫瘤微環(huán)境的形成增強(qiáng)了腫瘤對(duì)外界的抵抗力，特別是對(duì)藥物治療作用的抵抗，導(dǎo)致抗腫瘤藥物的實(shí)際藥效常常與單細(xì)胞腫瘤模型的預(yù)測(cè)結(jié)果不符。

在眾多的間質(zhì)細(xì)胞當(dāng)中，所占比例最高的是成纖維細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞在一些因素的刺激下被激活，轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（TAFs）。這類(lèi)活化的TAFs能夠誘發(fā)腫瘤形成，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，在某些類(lèi)型的癌細(xì)胞中還會(huì)誘導(dǎo)發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal Transformation，EMT）。另一種起重要作用的間質(zhì)細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，這種細(xì)胞起源于外周血中的單核/巨噬細(xì)胞，在不同刺激條件下，單核細(xì)胞可以分化為促進(jìn)腫瘤發(fā)展的M2型巨噬細(xì)胞。外周血中的單核/巨噬細(xì)胞被腫瘤微環(huán)境中的趨化因子和細(xì)胞因子募集到腫瘤微環(huán)境后，誘導(dǎo)分化成腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）。這種TAMs表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)的作用，并且其浸潤(rùn)程度與惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，在多種惡性腫瘤中高密度的TAMs浸潤(rùn)是患者生存率降低的指標(biāo)之一。腫瘤微環(huán)境中的內(nèi)皮細(xì)胞是腫瘤血管生成的基礎(chǔ)，新生血管既為腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，也是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的主要途徑。內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相互作用導(dǎo)致兩者粘附分子上調(diào)、肌動(dòng)球蛋白骨架重組，以及鈣粘蛋白的表達(dá)變化。內(nèi)皮細(xì)胞還可以通過(guò)分泌某些血管生長(zhǎng)因子和趨化因子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲、增加收縮力和重塑細(xì)胞骨架[11]。

2.3.3 體外直接培養(yǎng)與異種移植培養(yǎng)

除了直接將病人自體腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)并檢測(cè)外，還有另一類(lèi)被廣泛采用的個(gè)體化藥敏檢測(cè)手段，即病人源性異種移植培養(yǎng)（Patient-derired Xenograft，PDX），它是將病人的臨床腫瘤組織轉(zhuǎn)移到裸鼠中建立動(dòng)物模型并進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。美國(guó)西北醫(yī)院強(qiáng)文安教授對(duì)其進(jìn)行了深入研究并將這種方法用于藥物開(kāi)發(fā)與腫瘤治療中。這種培養(yǎng)方法的優(yōu)勢(shì)是可以利用異種動(dòng)物的相同組織環(huán)境最大限度的模擬人體實(shí)驗(yàn)環(huán)境（例如將卵巢癌組織接種于裸鼠卵巢膜下），再通過(guò)裸鼠體內(nèi)微環(huán)境實(shí)現(xiàn)人源腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)并用于藥敏檢測(cè)。雖然這種方法可以構(gòu)造出極為復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，并且這種微環(huán)境很難在體外通過(guò)人工方式重建出來(lái)的，理論上來(lái)說(shuō)實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)該更具代表性。然而從現(xiàn)有的研究結(jié)果來(lái)看，結(jié)果并非如此。細(xì)胞在體成瘤后（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物）的藥敏結(jié)果并不等同于藥物對(duì)患者有效，致使不少臨床前有較好藥效的藥物在臨床階段被淘汰。另外這種方法技術(shù)難度較大、成本昂貴、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、缺少重要的免疫影響因素，并且很難實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)[12]。

3 領(lǐng)域現(xiàn)狀及未來(lái)發(fā)展

3.1 病人自體腫瘤細(xì)胞的個(gè)體化藥效分析和篩選技術(shù)

3.1.1 膠滴腫瘤藥敏檢測(cè)技術(shù)（CD-DST）

原代癌細(xì)胞來(lái)源少一直制約體外細(xì)胞藥敏檢測(cè)的推廣。在此種研究背景下，人們建立了膠滴腫瘤藥敏檢測(cè)技術(shù)（Collagen gel Droplet Culture drug-Sensitivity Test，CDDST），一種體外腫瘤藥敏檢測(cè)技術(shù)，其突出特點(diǎn)是能夠排除成纖維細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，在體外對(duì)抗癌藥物的特異性殺傷作用做出客觀評(píng)價(jià)，同時(shí)所需標(biāo)本量?。?×103個(gè)細(xì)胞/孔）的特點(diǎn)擴(kuò)大了該技術(shù)的應(yīng)用范圍，彌補(bǔ)了目前其他藥敏檢測(cè)技術(shù)的不足。國(guó)外臨床研究表明，此技術(shù)的體外檢測(cè)結(jié)果與臨床療效間存在較好的相關(guān)性。

由于人體內(nèi)的腫瘤組織是由腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)共同組成的細(xì)胞群體，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生重要影響。CD-DST技術(shù)是利用膠原凝膠在37 ℃時(shí)形成三維立體結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，在體外模仿了體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，使腫瘤細(xì)胞能夠在與體內(nèi)環(huán)境相似的條件下生長(zhǎng)，生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞具有與體內(nèi)相似的細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)7 d的培養(yǎng)后，經(jīng)干膠、染色、掃描等程序最終對(duì)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用程度做出客觀評(píng)價(jià)。

CD-DST技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：① 細(xì)胞用量少，這樣不僅可對(duì)小量的組織標(biāo)本進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，而且可以對(duì)胸腹水等液體標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，從而可以使乳腺針吸活檢標(biāo)本、胸水標(biāo)本、組織活檢標(biāo)本進(jìn)行體外藥敏檢測(cè)，擴(kuò)大了腫瘤藥敏技術(shù)的檢測(cè)范圍；② 腫瘤細(xì)胞在膠原凝膠所形成的三維立體培養(yǎng)環(huán)境中，培養(yǎng)成功率高，細(xì)胞具有與體內(nèi)細(xì)胞相似的生長(zhǎng)形態(tài)；③ 本技術(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞可以采用圖像軟件系統(tǒng)分析結(jié)果，可排除成纖維細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，可對(duì)抗癌藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用在體外做出客觀評(píng)價(jià)；④ 結(jié)果測(cè)定快速（3 s/滴），可利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行結(jié)果分析，測(cè)定6種藥物的時(shí)間只需1 min。

3.1.2 組織培養(yǎng)藥敏檢測(cè)技術(shù)（HDRA）

Hoffman于20世紀(jì)90年代初建立HDRA法[13]，此方法已在2.2.2章節(jié)中進(jìn)行了敘述。

3.1.3 人腫瘤細(xì)胞原代裸鼠移植瘤模型法

為了模擬體內(nèi)環(huán)境，人們將腫瘤組織塊接種于裸鼠的皮下或腎包膜下，建立裸鼠移植瘤模型。由于裸鼠缺乏T淋巴細(xì)胞，異種移植時(shí)排斥反應(yīng)不明顯，進(jìn)行人腫瘤移植時(shí)，可保持原有的生物學(xué)特性及對(duì)抗癌藥物的敏感性，也可評(píng)估經(jīng)代謝后起作用的藥物敏感性，是進(jìn)行腫瘤藥敏試驗(yàn)的良好模型。1969年，Rygarrd和Povlsen等首次將人結(jié)腸癌細(xì)胞植入裸鼠皮下獲得成功，之后許多研究者采用裸鼠皮下移植法研究人胃癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤對(duì)抗癌藥物的敏感性，證實(shí)當(dāng)給予荷瘤裸鼠有效藥物時(shí)，移植物的化療敏感性可從本質(zhì)上反映腫瘤患者的化療敏感性。Fiebig等報(bào)道了用此法指導(dǎo)36例實(shí)體瘤患者的化療，結(jié)果顯示裸鼠移植瘤法對(duì)抗癌藥耐藥性預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率達(dá)97%，敏感性達(dá)92%。但該方法移植成功率低，同時(shí)操作復(fù)雜、要求無(wú)特定病原（Specifc Pathogen Free，SPF）級(jí)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室、移植瘤生長(zhǎng)慢、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)（30～40 d）、費(fèi)用昂貴等，不適合作為常規(guī)用于臨床藥敏試驗(yàn)的手段。

3.2 技術(shù)在國(guó)內(nèi)外醫(yī)療體系中的發(fā)展現(xiàn)狀

現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外已有多家醫(yī)療單位將病人自體腫瘤細(xì)胞的體外藥敏分析作為常規(guī)診療服務(wù)項(xiàng)目。如日本早在2008年就由中央社會(huì)保險(xiǎn)醫(yī)療協(xié)會(huì)發(fā)布了《對(duì)現(xiàn)有醫(yī)療保險(xiǎn)引入的先進(jìn)醫(yī)療技術(shù)》，將病人自體腫瘤細(xì)胞的體外抗癌藥敏感性試驗(yàn)（主要是CD-DST方法）列入“被評(píng)定為適合優(yōu)先引進(jìn)醫(yī)療保險(xiǎn)的現(xiàn)今醫(yī)療”。這一協(xié)會(huì)在另一份文件《根據(jù)新聯(lián)合實(shí)施的先進(jìn)醫(yī)療專(zhuān)家會(huì)議的第二項(xiàng)先進(jìn)醫(yī)療科學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果》中，將CD-DST法的抗惡性腫瘤藥敏實(shí)驗(yàn)總評(píng)結(jié)果設(shè)為“適用”。適應(yīng)癥包括胃腸癌（除治愈級(jí)別C的胃癌）、頭頸部癌、乳腺癌、肺癌、乳腹膜炎、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌或卵巢癌。國(guó)內(nèi)方面，上海也早在2008年就為癌癥患者提供基于先進(jìn)腫瘤藥敏檢測(cè)的個(gè)體化化療方法。醫(yī)生可通過(guò)一張“腫瘤藥敏報(bào)告單”為病人制定更加合理的化療方案。江蘇省也已經(jīng)將腫瘤細(xì)胞化療藥物敏感試驗(yàn)（HDRA檢測(cè)）納入“江蘇省基本醫(yī)療保險(xiǎn)和工商保險(xiǎn)診療服務(wù)項(xiàng)目、醫(yī)療服務(wù)設(shè)施范圍和支付標(biāo)準(zhǔn)”。南京鼓樓醫(yī)院腫瘤中心已經(jīng)利用新鮮腫瘤組織三維培養(yǎng)藥敏檢測(cè)平臺(tái)（HDRA）來(lái)指導(dǎo)藥物選擇。天津市于2013年頒布的《天津市基本醫(yī)療保險(xiǎn)和生育保險(xiǎn)診療項(xiàng)目暨醫(yī)療服務(wù)設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)》中，將人體腫瘤SKC法藥敏測(cè)定納入醫(yī)保范圍（序號(hào)1254）。新疆省在最新公布的醫(yī)療服務(wù)價(jià)格項(xiàng)目中也提及了人體腫瘤SKC法藥敏測(cè)定項(xiàng)目。由中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)最新發(fā)布的腫瘤個(gè)體化治療檢測(cè)技術(shù)指南（試行）》更是對(duì)病人自體腫瘤細(xì)胞體外藥敏檢測(cè)中涉及的樣本采集、分析質(zhì)控、結(jié)果報(bào)告、診斷標(biāo)準(zhǔn)等進(jìn)行了一整套規(guī)范化要求，為腫瘤治療的精準(zhǔn)化用藥提供了重要保證。

3.3 存在的問(wèn)題

3.3.1 細(xì)胞來(lái)源稀缺降低藥敏檢測(cè)通量

癌癥藥敏檢測(cè)需要大量的癌細(xì)胞來(lái)源，而在手術(shù)過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞并不能滿(mǎn)足大量的藥敏檢測(cè)需要。同時(shí)，由于原代細(xì)胞分離技術(shù)的不完善，導(dǎo)致細(xì)胞獲取的機(jī)會(huì)大大降低，嚴(yán)重影響了癌癥組織體外藥敏檢測(cè)模型的大面積推廣。

3.3.2 藥敏檢測(cè)技術(shù)的時(shí)效性

從應(yīng)用角度講，藥敏檢測(cè)結(jié)果應(yīng)在病人需要進(jìn)行化療之前得出，以幫助病人指導(dǎo)用藥。但現(xiàn)有原代細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)并不完善，導(dǎo)致研究人員很難在短時(shí)間內(nèi)得到大量的樣本進(jìn)行藥敏檢測(cè)。尤其對(duì)于一些病情惡化的患者，并沒(méi)有過(guò)多的時(shí)間來(lái)等待檢測(cè)結(jié)果。所以，如何能快速得到藥敏測(cè)試結(jié)果也將是研究人員需要考慮的問(wèn)題之一。

3.3.3 檢測(cè)技術(shù)對(duì)體內(nèi)的模擬程度

目前對(duì)于什么手段能夠更好地模擬體內(nèi)微環(huán)境仍然存在較大爭(zhēng)議。但是作為腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，將來(lái)的應(yīng)用方向是指導(dǎo)病人的用藥與進(jìn)行新藥的開(kāi)發(fā)，因此檢驗(yàn)體外腫瘤培養(yǎng)模型是否能夠準(zhǔn)確有效地預(yù)測(cè)藥物對(duì)體內(nèi)腫瘤的殺傷效果是本領(lǐng)域的核心問(wèn)題。而目前在這方面的研究還很薄弱，主要受限于原代細(xì)胞的分離、培養(yǎng)技術(shù)手段不成熟、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、體外體內(nèi)藥效較難比較等原因。但如果要將體外腫瘤模型推向醫(yī)療應(yīng)用，這一系列難題需要被一一攻克。

3.4 展望

3.4.1 病人自體腫瘤細(xì)胞快速擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展

癌癥藥敏檢測(cè)需要大量的癌細(xì)胞來(lái)源，而手術(shù)獲得的腫瘤細(xì)胞并不能滿(mǎn)足高通量藥敏檢測(cè)的需求。所以，高通量癌癥藥敏檢測(cè)需要在體外對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行快速擴(kuò)增，以達(dá)到所需的細(xì)胞量。而來(lái)自于病人的原代細(xì)胞并不容易適應(yīng)體外環(huán)境，細(xì)胞存活、擴(kuò)增都存在較大問(wèn)題。研究人員通過(guò)在原代腫瘤細(xì)胞中加入不能分裂的成纖維細(xì)胞，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，使其擁有與體內(nèi)更高的相似性，以期待最終癌細(xì)胞可以在體外存活并快速擴(kuò)增。Liu等[14]通過(guò)對(duì)原代腫瘤細(xì)胞與無(wú)分裂能力的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，并添加ROCK抑制因子的方式，來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞以較快的速度生長(zhǎng)，從而在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增大量癌細(xì)胞。基于這種癌細(xì)胞快速擴(kuò)增技術(shù)，Crystal等[15]開(kāi)發(fā)出了能夠快速確定當(dāng)腫瘤產(chǎn)生單一藥物抗藥性后所應(yīng)采用的聯(lián)合用藥方案。通過(guò)快速擴(kuò)增技術(shù)得到大量病人源性腫瘤細(xì)胞的應(yīng)用實(shí)例，見(jiàn)圖3[15]。相較于通過(guò)單純遺傳分析的手段來(lái)尋找新的藥物靶點(diǎn)，直接進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)得到的結(jié)果更為直接，同時(shí)有助于發(fā)現(xiàn)新的有效藥物。

3.4.2 體外3D腫瘤組織類(lèi)器官藥物篩選模型的優(yōu)化

由于3D細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范化的模式尚未建立，因此需要優(yōu)化現(xiàn)有系統(tǒng)以產(chǎn)生穩(wěn)定可重復(fù)的檢測(cè)結(jié)果。例如，通過(guò)引入細(xì)胞外基質(zhì)材料來(lái)模擬體內(nèi)環(huán)境可能會(huì)由于基質(zhì)材料批次間的差異造成結(jié)果不穩(wěn)定。因此實(shí)驗(yàn)前要注意檢測(cè)其所含成分的差異。3D細(xì)胞培養(yǎng)所模擬的狀態(tài)通常歷時(shí)較短，然而在體內(nèi)腫瘤的生成是長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)程。驗(yàn)證體內(nèi)腫瘤和體外模型的形成時(shí)間差異是否會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響也是一個(gè)很關(guān)鍵的問(wèn)題。在3D細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞密度大，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求也會(huì)更高，但在3D培養(yǎng)條件中，這一需求并不能完全得到滿(mǎn)足。和傳統(tǒng)的2D平面培養(yǎng)細(xì)胞相比，單個(gè)細(xì)胞氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)匱乏，影響細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)，可能致使實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不佳，降低了3D模型的穩(wěn)定性。3D體外模型缺乏復(fù)雜的脈管系統(tǒng)，而體內(nèi)這些脈管系統(tǒng)通過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)散可以為組織提供氧、營(yíng)養(yǎng)，并清除廢物。所以在一個(gè)3D腫瘤組織體外模型進(jìn)行表征時(shí)，也應(yīng)當(dāng)對(duì)系統(tǒng)內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物的擴(kuò)散能力進(jìn)行表征。

3.4.3 在國(guó)內(nèi)醫(yī)療體系中的發(fā)展趨勢(shì)

隨著對(duì)惡性腫瘤認(rèn)識(shí)的不斷深入，人們已經(jīng)迫切的感受到精準(zhǔn)醫(yī)療對(duì)于腫瘤診治的重要性。盡管基于基因篩查的腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療技術(shù)突飛猛進(jìn)并受到世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注，但基于病人自體腫瘤細(xì)胞的藥敏篩查技術(shù)仍處于發(fā)展階段，受到的重視程度依然不足。然而，現(xiàn)階段制約自體腫瘤藥敏篩查的幾個(gè)主要因素，如原代細(xì)胞稀缺、檢測(cè)周期相對(duì)較長(zhǎng)、體外模擬程度較低等問(wèn)題均已取得重大突破。特別是體外三維培養(yǎng)腫瘤微組織模型的飛速發(fā)展更是極大的促進(jìn)了藥敏檢測(cè)的準(zhǔn)確性和有效性。我們有理由相信，在不久的將來(lái)，體外三維培養(yǎng)腫瘤微組織能夠與基因篩查互為驗(yàn)證和補(bǔ)充，共同實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療的目標(biāo)。

圖3 通過(guò)快速擴(kuò)增技術(shù)得到大量病人源性腫瘤細(xì)胞的應(yīng)用實(shí)例[15]

致謝

本實(shí)驗(yàn)室的研究工作受到了國(guó)家自然科學(xué)基金（81171474、51273106、51461165302）和北京市自然科學(xué)基金（157142090）的支持。

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Precise Medicine in Cancer Treatment via Patient Derived in Vitro Tumor Model

ZHU Lu1,2, GOU Yue-yang1, YAN Xiao-jun1, ZHOU Lv1, LIAO Quan3, WANG Bin4a, YE Chun-xiang4b, FENG Chang-jiang4c, DU Ya-nan1
1. Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, China; 2. Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300161, China; 3.Department of Surgery, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100032, China; 4.a. Department of Arthritis; b. Department of Gastroenterological Surgery; c. Department of Thoracic Surgery, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China

The concept of precise medicine opens a new gate for cancer treatment. Nowadays, gene mutations possibly responsible for chemotherapeutic sensitivity can be pinpointed based on the Whole Genome Sequencing (WGS) technology to attack the tumor targeting to specific mutation. However, gene sequencing probably is not capable of providing the most suitable drug usage solution due to tumor genetic instability. In addition to the WGS, precise medicine also includes drug sensitivity testing. Chemo-sensitivity drug testing with patient derived primary tumorin vitromodel can provide more direct and accurate medical indication compared with the WGS because critical information for drug usage, such as pharmacological analysis and drug efficiency, can be acquired simply. The combination of genetic analysis andin vitromodel screening is helpful to fnd the most promising drug or drug combination for each patient and thus achieves the personalized medicine and increases tumor treatment effciency. This paper discussed the history, status, perspectives of current method of patient derived tumorin vitromodel.

precise medicine; patient derived tumor cells; drug sensitivity testing; 3D cell culture

R318

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2016.06.003

1674-1633(2016)06-0013-06

2015-10-30

2015-12-21

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171474、51273106、51461165302），北京市自然科學(xué)基金（157142090）。

杜亞楠，教授。

通訊作者郵箱：duyanan@tsinghua.edu.cn