李飛龍，巫 鑫，廖紅波，仇雙利，朱曉輝，崔 燎，吳 華

(1. 廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤中心，2. 廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東 湛江 524023)

dalbinol通過ROS/Dvl/GSK-3β/β-catenin信號通路誘導人結腸癌細胞凋亡的作用機制研究

李飛龍1，巫 鑫2，廖紅波2，仇雙利1，朱曉輝2，崔 燎2，吳 華1

(1. 廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤中心，2. 廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東 湛江 524023)

目的 探討天然產(chǎn)物dalbinol對人結腸癌HCT116細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制。方法 采用MTT法檢測dalbinol對人結腸癌HCT116細胞的增殖抑制作用；利用Hoechst 33342熒光染色法觀察細胞凋亡的形態(tài)學變化；應用流式細胞術檢測細胞凋亡率和ROS水平；通過Western blot法檢測Wnt/β-catenin信號通路及凋亡相關蛋白的表達情況。結果 dalbinol可抑制人結腸癌HCT116 細胞的增殖，且呈劑量和時間依賴性，24、48和72 h的IC50分別為(4.8±0.53)、(2.5±0.43)和(0.6±0.22) μmol·L-1；Hoechst 33342染色觀察到細胞皺縮、核固縮和染色質凝集等典型凋亡的形態(tài)學變化，同時dalbinol可劑量依賴性地提高細胞凋亡率，且能增加細胞內ROS水平；Western blot結果發(fā)現(xiàn)dalbinol通過下調抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表達水平，上調促凋亡蛋白Bax和Bim的表達，從而促進cleaved caspase-3--------------------

dalbinol；結腸癌；HCT116；增殖；凋亡；Wnt/β-catenin

結腸癌是常見的惡性消化道腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤前列，使人類健康面臨嚴重挑戰(zhàn)[1]。盡管結腸癌診療的技術和水平都有所提高，但患者的5年生存率仍不理想[2]。據(jù)統(tǒng)計，1940～2014年間，超過75%的抗腫瘤藥物直接來源于天然物質[3]。因此，從天然藥物中尋找新型抗癌藥物，對改善結腸癌患者預后具有重要意義。研究表明[4]，結腸癌的發(fā)生、發(fā)展與Wnt/β-catenin、EGFR、p53、MAPK、Notch、RhoA/ROCK 等多種信號通路有關，其中Wnt/β-catenin 信號通路的異常激活被認為是結腸癌的發(fā)生、發(fā)展的關鍵事件。Tan等[5]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路的激活，結腸癌細胞可發(fā)生增殖抑制和凋亡現(xiàn)象。紫穗槐(AmorphaFruticosa)，落葉灌木，系豆科紫穗槐屬，其花和葉均可入藥，具有清熱、涼血、止血和祛濕消腫等藥理作用，中醫(yī)主要用于濕疹、癰腫和燒燙傷等病癥[6]。dalbinol是從紫穗槐中分離純化的一種魚藤酮類化合物(結構見Fig 1A)，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，該化合物在體外對HCT116細胞表現(xiàn)出顯著的細胞毒性，但其作用機制尚不明確。因此，本研究進一步觀察dalbinol對人結腸癌HCT116細胞周期及凋亡的影響，并分析dalbinol對Wnt/β-catenin信號通路的影響，探討dalbinol調控Wnt/β-catenin信號通路的可能機制，為其后續(xù)開發(fā)與利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人結腸癌 HCT116 細胞由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 dalbinol由本課題組提取純化并鑒定所得[7]。胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(高糖型)、胎牛血清均購于美國Hyclone 公司；青霉素-鏈霉素購自廣州威佳科技有限公司；Hoechst 33342染色液、活性氧檢測試劑盒、全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發(fā)光液、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒、細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒均購于碧云天生物技術研究所；β-actin抗體購自北京義翹神州生物技術有限公司；β-catenin 抗體購自英國ABC公司；PARP 抗體購自美國Biolegend公司；caspase-3抗體購自美國 Proteintech公司；Dvl-2購于美國Santa Cruz Biotechnology公司。GSK-3β和c-Myc抗體均購于美國 BD公司；GSK-3β(pS9)、Survivin、Bcl-2、Bax、Bim、Mcl-1和Histone3抗體均購于美國CST公司；羊抗兔IgG-HRP和羊抗鼠IgG-HRP均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和1%(V/V)青-鏈霉素的高糖型DMEM培養(yǎng)基，于 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)HCT116 細胞，按 1 ∶4 隔天傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制作用 取對數(shù)生長期細胞接種于96 孔板，不同濃度的dalbinol (0、 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol·L-1)分別作用 24、48、72 h 后，每組設置3個復孔，每孔加入5 g·L-1MTT 10 μL，置孵箱繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清，加入200 μL DMSO溶液，使用酶標儀在570 nm 波長處檢測各孔吸光度值，計算細胞存活率。

1.2.3 Hoechst 33342 熒光染色觀察細胞凋亡的形態(tài)學變化 取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，將dalbinol稀釋成不同終濃度(0.5、1.0、2.0 μmol·L-1)進行加藥，每組設置3個復孔，同時設置陰性對照組。孵育24 h 后，PBS 洗 3 遍后每孔各加入 2.5 mg·L-1Hoechst 33342 染色液，在 37 ℃條件下孵育染色 5 min，用 PBS 洗 3 次。倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法測定細胞凋亡率 取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，質量濃度、加藥方式同“1.2.3”項，加藥24 h后收集細胞，PBS洗滌2次，將細胞重懸于195 μL的Annexin V-FITC結合液中，室溫避光孵育15 min后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。1.2.5 細胞內 ROS 含量的檢測 取對數(shù)生長期細胞接種于 6 孔板，質量濃度、加藥方式同“1.2.3”項，dalbinol處理12 h后收集細胞，將DCFH-DA熒光探針按1 ∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋，置10 μmol·L-1DCFH-DA于培養(yǎng)箱中孵育30 min，用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次。流式細胞儀測定細胞內活性氧含量。

1.2.6 Western blot檢測相關蛋白的表達 將對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中，質量濃度、加藥方式同“1.2.3”項，加藥24 h后收集細胞，提取各實驗組細胞總蛋白、核蛋白。BCA法蛋白定量，用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，將分離后的蛋白質轉移至NC膜上，用5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗滌10 min，一抗4℃搖床過夜，TBST洗滌3次，每次15 min，HRP標記二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次15 min，最后在暗室進行化學發(fā)光顯色和曝光。

2 結果

2.1 dalbinol對HCT116細胞增殖的影響 MTT結果顯示(Fig 1B)，與對照組相比，作用24、48和72 h時，dalbinol可抑制HCT116細胞的增殖，呈劑量和時間依賴性(P<0.05)，IC50分別為(4.8±0.53)、(2.5±0.43)和(0.6±0.22) μmol·L-1。

2.2 dalbinol對HCT116細胞凋亡的影響 將dalbinol按不同終濃度(0.5、1.0、 2.0 μmol·L-1)處理HCT116細胞24 h后，Hoechst33342染色后可觀察到部分細胞出現(xiàn)細胞皺縮、核固縮、核破碎等典型凋亡的形態(tài)學變化(Fig 2)。同時Annexin V-FITC/PI雙染結果表明(Fig 3)，與陰性對照組相比，dalbinol可濃度依賴性地增加HCT116細胞凋亡率(P<0.05)。2.3 dalbinol對細胞內ROS水平的影響 DCFH-DA檢測結果表明(Fig 4)，dalbinol按不同終濃度(0.5、1.0、2.0 μmol·L-1)作用12 h時，與對照組相比，dalbinol可使HCT116細胞內ROS水平升高，2.0 μmol·L-1dalbinol作用時細胞內ROS水平最高達55.3%，并呈濃度依賴性。

Fig 1 Structure of dalbinol and anti-proliferative effect of dalbinol on HCT116 cells

A:The Structure of dalbinol;B:Anti-proliferative effect of by dalbinol on HCT116 cells.*P<0.05vscontrol.

Fig 2 Morphological changes of apoptosis by dalbinol in HCT116 cells

A:0 μmol·L-1；B：0.5 μmol·L-1；C：1.0 μmol·L-1；D：2.0 μmol·L-1

Fig 3 Effect of dalbinol on apoptosis of HCT116 cells

A:Flow cytometry analysis results;B:The apoptotic ratio was measured by flow cytometric analysis staining with PI.*P<0.05vscontrol

2.4 dalbinol對HCT116細胞中凋亡相關蛋白表達的影響 初步的作用機制表明(Fig 5)，不同終濃度(0.5、1.0和2.0 μmol·L-1)的dalbinol處理HCT116細胞24 h后，促凋亡蛋白Bax和Bim的表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表達水平下降，導致cleaved caspase-3和cleaved PARP同時過度活化，而總的caspase-3 和PARP變化趨勢不明顯。

Fig 5 Expression of apoptosis-associated proteins by dalbinol in HCT116 cells

2.5 dalbinol對HCT116細胞中 Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的影響 進一步的作用機制研究表明(Fig 6)，dalbinol可降低HCT116細胞內總的和胞核β-catenin蛋白表達，尤以胞核β-catenin的下降為甚，但對胞質β-catenin的表達無明顯影響。此外，dalbinol可降低Dvl-2、GSK-3β(pS9)、c-Myc和Survivin的蛋白表達，總的GSK-3β蛋白表達無明顯變化。

3 討論

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，尤其是飲食結構的改變，目前結腸癌已上升為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一[1]。在過去幾十年，外科手術一直是結腸癌的主要治療手段之一，但在原發(fā)腫瘤出現(xiàn)明顯癥狀之前，患者可能己經(jīng)發(fā)生播散或遠處轉移，另外約50%病例術后 2 年會出現(xiàn)復發(fā)和轉移，因此大多數(shù)結腸癌患者都需要接受化療。由于外科手術治療的局限性、放射治療的劑量限制、化療藥物的毒副作用以及耐藥性等因素影響，結腸癌患者的預后仍不理想[2]。從天然藥物資源中尋找具有抗腫瘤活性的藥物，是近年來抗結腸癌藥物研究的熱點之一[3]。

Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與許多癌癥的發(fā)生、發(fā)展有著不可分割的聯(lián)系，其與結腸癌的關系更是密不可分。據(jù)報道，90%的結腸癌都存在Wnt/β-catenin信號通路中一個關鍵調控基因的突變[8]。因此抑制 Wnt/β-catenin信號是抑制結腸癌細胞生長的重要靶點之一[9]，開發(fā)針對Wnt/β-catenin 信號通路的抗癌藥物已成為研究的熱點[10]。大量研究表明，經(jīng)典模式下，Wnt/β-catenin 信號通路中 LRP5/6、APC、Dvl、GSK3β、Axin或者β-catenin 等基因的突變，會抑制降解復合體(Axin/APC/GSK-3β)的生成，使β-catenin無法降解并在胞質內堆積后轉入細胞核，引起核的β-catenin 與轉錄因子 TCF/LEF 形成復合物，從而激活相應的下游靶基因 c-Myc、Cyclin D1和Survivin 等，最終導致結腸癌的發(fā)生和發(fā)展[4]。

Fig 6 Expression of related proteins in Wnt/β-catenin pathway by dalbinol in HCT116 cells

本實驗Western blot結果發(fā)現(xiàn)，dalbinol作用24 h后，HCT 116細胞中總的和胞核β-catenin的表達均下降，尤以胞核β-catenin 下降最為明顯，但胞質β-catenin水平無明顯變化，這結果表明dalbinol可調控關鍵蛋白β-catenin的表達。因此，我們推測dalbinol可能通過下調Wnt/β-catenin 信號通路來抑制HCT 116細胞的增殖。另外，Wnt/β-catenin通路的下游靶蛋白c-Myc和Survivin表達均降低，這結果也進一步證實我們的推測。為明確dalbinol調控Wnt/β-catenin通路的具體機制，我們還檢測了影響降解復合體生成的相關蛋白Dvl-2、GSK-3β和GSK-3β(pS9)。結果發(fā)現(xiàn)，Dvl-2和GSK-3β(pS9)的表達下降明顯，而GSK-3β的蛋白水平未見明顯變化。上述結果表明，dalbinol可能通過抑制 Dvl-2 的表達，從而使失活型GSK-3β(pS9)的表達下降， β-catenin磷酸化降解增多，最終導致Wnt/β-catenin通路的下游靶蛋白c-Myc和Survivin表達下降。

總之，dalbinol能明顯抑制人結腸癌HCT116細胞增殖，并誘導其凋亡，其作用機制可能與細胞內ROS水平提高和抑制Dvl/GSK-3β/β-catenin信號通路有關。本實驗僅探討dalbinol對HCT116細胞的作用，尚未在其它結腸癌細胞系中予以證實，下一步本課題組將繼續(xù)研究dalbinol對多種結腸癌細胞系中Wnt/β-catenin通路的影響，為其進一步開發(fā)提供科學依據(jù)。

(致謝：本實驗在廣東醫(yī)科大學廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室完成，感謝吳華教授和巫鑫博士以及各位老師的指導和幫助。)

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dalbinol induces apoptosis of human colon cancer cells through ROS/Dvl/GSK-3β/β-catenin pathway

LI Fei-long1, WU Xin2, LIAO Hong-bo2, QIU Shuang-li1, ZHU Xiao-hui2, CUI Liao2, WU Hua1

(1.CancerCenter,theAffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,ZhanjiangGuangdong524023,China; 2.GuangdongKeyLaboratoryforResearchandDevelopmentofNaturalDrugs,GuangdongMedicalUniversity,ZhanjiangGuangdong524023,China)

Aim To investigate the effects of dalbinol on proliferation and apoptosis of human colon cancer HCT116 cells and its mechanisms. Methods Anti-proliferative effect of dalbinol was evaluated by MTT assay. The morphological changes of apoptosis were observed by Hoechst33342 staining. Apoptotic rate and ROS generation were analyzed by flow cytometry. The related proteins of Wnt/β-catenin pathway and the apoptosis-associated proteins expression were measured by Western blot. Results The growth of HCT116 treated with dalbinol was inhibited in a dose and time dependent manner with IC50(4.8±0.53), (2.5±0.43) and (0.6±0.22) μmol·L-1at 24, 48 and 72 h, respectively. Typical morphological changes of apoptosis such as cell shrinkage, karyopyknosis and nuclear condensation were observed by Hoechst33342 staining. Meanwhile, the apoptotic rate and intracellular ROS generation of dalbinol were both increased dose-dependently. Western blot results showed that dalbinol could activate the expression of cleaved Caspase-3 and cleaved PARP by decreasing anti-apoptotic protein levels such as Bcl-2 and Mcl-1 and increasing pro-apoptotic protein levels such as Bax and Bim, which induced further apoptosis. Moreover, dalbinol can reduce the protein expression of the total and nuclear β-catenin, but not cytoplasmic β-catenin by suppressing the protein expression of Dvl-2 and GSK-3β(pS9), as well as its target proteins c-Myc and Survivin. Conclusion dalbinol can induce apoptosis in colon cancer HCT116 cells by upregulating the intracellular ROS generation and suppressing Dvl/GSK-3β/β-catenin pathway.

dalbinol; colon cancer cells; HCT116; proliferation; apoptosis; Wnt/β-catenin

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.012

A

1001-1978(2016)12-1694-05

R284.1；R329.24；R329.25；R735.350.22

2016-08-19，

2016-09-14

國家自然科學基金青年基金資助項目(No 81503226)；廣東省自然科學基金資助項目(No 2KZ16015G)；湛江市科技攻關計劃項目基金資助項目(No 2014B01021)

李飛龍(1990-)，男，碩士生，研究方向：腫瘤的診斷、治療及預防學，E-mail：443608172@qq.com； 吳 華(1966-)，男，碩士，教授，碩士生導師，研究方向：腫瘤的診斷、治療及預防學，通訊作者，E-mail：1740154717 @qq.com

和cleaved PARP活化裂解，進而誘導細胞凋亡；此外，dalbinol通過抑制Dvl-2和GSK3β(pS9)的蛋白表達，從而降低總的β-catenin和胞核β-catenin的表達，但胞質β-catenin無明顯變化，最終下調Wnt/β-catenin通路下游靶蛋白c-Myc和Survivin的表達水平。結論 dalbinol可抑制人結腸癌HCT116細胞增殖并誘導其凋亡，其分子機制可能與提高細胞內ROS水平和抑制Dvl/GSK-3β/β-catenin信號通路有關。