李 銳，白 宇，季 紅

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 藥學(xué)部，吉林 長春130033)

多種藥物干預(yù)老齡骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)大鼠股骨沖擊力學(xué)特性分析

李 銳，白 宇，季 紅*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 藥學(xué)部，吉林 長春130033)

研究骨在外部載荷作用下的生物力學(xué)性能和生物學(xué)效應(yīng)，是評(píng)定骨質(zhì)量的可靠方法之一。骨密度測(cè)定對(duì)骨脆性和骨折危險(xiǎn)性進(jìn)行預(yù)測(cè)是一種重要的方法，但大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，骨礦鹽含量的增加，骨質(zhì)量不一定相應(yīng)的增加，有時(shí)反而降低，所以對(duì)骨組織進(jìn)行生物力學(xué)性能的研究，可直接對(duì)骨質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，骨組織進(jìn)行生物力學(xué)性能實(shí)驗(yàn)是評(píng)定對(duì)抗骨丟失措施的重要方法之一[1]。由絕經(jīng)引起的骨質(zhì)疏松癥 是老年女性的多發(fā)病、常見病，骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防、診斷、治療是一個(gè)世界性醫(yī)學(xué)課題[2]。關(guān)于骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)大鼠骨和骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)大鼠以1-2種藥物干預(yù)治療后，實(shí)驗(yàn)大鼠骨的力學(xué)性能研究已見報(bào)道[3-6]。王成學(xué)[7]等對(duì)去卵巢所致骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)大鼠骨的壓縮與沖擊力學(xué)性能進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型組大鼠股骨壓縮最大應(yīng)變、最大載荷、最大應(yīng)力，脛骨最大沖擊韌性功、最大沖擊功均小于正常對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)，得出了骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)大鼠骨沖擊和壓縮力學(xué)性能指標(biāo)均降低的結(jié)論。別海洲[8]對(duì)比分析了去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠骨和正常大鼠骨的拉伸與沖擊力學(xué)特性,結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)大鼠骨沖擊、拉伸實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)生物力學(xué)指標(biāo)顯著低于正常對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)，得出了骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)大鼠骨沖擊、拉伸生物力學(xué)指標(biāo)發(fā)生了改變的結(jié)論。

以往骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物骨的沖擊生物力學(xué)性能實(shí)驗(yàn)以正常大鼠骨和骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)大鼠骨居多，以αD3、結(jié)合型結(jié)合型雌激素(倍美力)、丹杞顆粒、依普拉芬分別干預(yù)治療去卵巢雌性大鼠骨質(zhì)疏松模型實(shí)驗(yàn)大鼠骨的沖擊生物力學(xué)特性對(duì)比分析鮮有報(bào)道。鑒于預(yù)防和治療老齡骨質(zhì)疏松癥的需要，作者建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大鼠模型后分別以依普拉芬、αD3、丹杞顆粒、結(jié)合型雌激素進(jìn)行干預(yù)治療，于各組大鼠飼養(yǎng)18周后，處死大鼠，取各組大鼠股骨進(jìn)行沖擊力學(xué)性能測(cè)試，以沖擊力學(xué)性能指標(biāo)對(duì)比分析以依普拉芬、αD3、丹杞顆粒、結(jié)合型雌激素干預(yù)治療骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)大鼠的效果。為預(yù)防和治療老齡女性骨質(zhì)疏松癥提供沖擊生物力學(xué)特性基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠

6月齡wistar雌性大鼠60只作為測(cè)試大鼠，由長春高新醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。許可證：scxk(吉)2003-00040。大鼠體質(zhì)量292 g-307 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥物

上海榕柏生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的甲狀旁腺激素(3-34)， 昆明貝克若頓制藥有限公司生產(chǎn)的αD3，武漢制藥廠生產(chǎn)的依普拉芬邯鄲摩羅丹制藥有限公司生產(chǎn)的丹杞顆粒。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

60只wistar雌性大鼠分別設(shè)為骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型以甲狀旁腺激素(3-34).牛干預(yù)治療組10只、骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型組10只、正常組對(duì)照組10只、骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型以αD3干預(yù)治療組10只，骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型以丹杞顆粒干預(yù)治療組10只，骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型以依普拉芬干預(yù)治療組10只。各組大鼠均在鼠籠中飼養(yǎng)。

1.4 骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型建立和藥物干預(yù)方法

于大鼠購入飼養(yǎng)3天后，以摘除大鼠雙側(cè)卵巢的方法建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，之后對(duì)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型以依普拉芬治療組動(dòng)物每日給服依普拉芬1 mg/kg，治療20周。對(duì)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型大鼠以甲狀旁腺激素(3-34).牛治療組大鼠每日以40 μg/kg甲狀旁腺激素(3-34).牛+2%大鼠血清的雙蒸水溶解，皮下注射，治療20周。對(duì)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型以αD3治療組大鼠每日給服αD30.1 mg/ka，治療20周，對(duì)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型以丹杞顆粒治療組大鼠每日給服0.9 g/kg，治療20周。骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型組大鼠不做任何處理，20周后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型建成。建模20周后以腹主動(dòng)脈放血法處死各組大鼠，分別取各組大鼠雙側(cè)股骨，以生理鹽水將紗布后浸濕后包裹股骨試樣，置于-20℃冰箱內(nèi)存放。2天后，取出各組股骨試樣，自然解凍。股骨試樣的長度、直徑以游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量，股骨試樣長31.7-32.0 mm，直徑1.97-2.13 mm。分別將每個(gè)股骨試樣兩端置于外徑為8 mm、內(nèi)徑為6 mm、深為4 mm的模具內(nèi)，之后向裝有試樣模具內(nèi)填充稀釋的快干膠和義齒聚合物；固化后待用。

1.5 測(cè)試儀器與設(shè)備

德國萊比錫試驗(yàn)機(jī)廠生產(chǎn)的小量程沖擊試驗(yàn)機(jī)，長春市第三光學(xué)儀器廠生產(chǎn)的測(cè)量顯微鏡。

1.6 各組大鼠股骨沖擊測(cè)試方法

大鼠股骨為生物粘彈性體，實(shí)驗(yàn)前必須對(duì)股骨試樣進(jìn)行預(yù)調(diào)，本測(cè)試按參考文獻(xiàn)[9-13]的方法對(duì)每個(gè)大鼠股骨試樣進(jìn)行預(yù)調(diào)處理后進(jìn)行沖擊測(cè)試。將股骨試樣放在試驗(yàn)機(jī)的支坐上，之后將試驗(yàn)機(jī)的擺錘擺到最高位置，之后使試驗(yàn)機(jī)的擺錘自由釋放，沖斷試樣，通過試驗(yàn)機(jī)的度盤，讀取股骨試樣的沖擊功，通過材料力學(xué)公式分別計(jì)算出每個(gè)股骨試樣的沖擊韌性，計(jì)算公式如下[13]:

αk=W/K

式中αk為沖擊韌性、W為沖擊功、K為試樣橫截面積。

1.7 各組大鼠股骨沖擊測(cè)試斷口宏觀觀察

對(duì)各組大鼠股骨沖擊測(cè)試破壞后的試樣斷口進(jìn)行宏觀觀察.發(fā)現(xiàn)，多數(shù)股骨試樣斷口為粉碎性斷口，少數(shù)股骨試樣為橫形或斜形。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨沖擊測(cè)試結(jié)果

各組大鼠股骨沖擊測(cè)試沖擊功、沖擊韌性數(shù)據(jù)見表1。

表1 各組大鼠股骨沖擊功、沖擊韌性數(shù)據(jù)

測(cè)試結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型組大鼠股骨最大沖擊韌性、最大沖擊功顯著小于骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型以甲狀旁腺激素(3-34).牛治療組、以丹杞顆粒、依普拉芬治療組、正常對(duì)照組(P<0.05)，αD3治療組最大沖擊韌性、最大沖擊功與模型組最大沖擊韌性、最大沖擊功差異不顯著(P>0.05)。

2.2 各組大鼠股骨沖擊實(shí)驗(yàn)斷口大體觀察結(jié)果

各組大鼠股骨沖擊試樣多數(shù)為粉碎性破壞斷口形貌，少數(shù)為斜斷口或橫斷口破壞形貌。

3 討論

骨生物力學(xué)性能指標(biāo)是反映骨量、骨形態(tài)、骨結(jié)構(gòu)完整程度的綜合指標(biāo),可直接反映骨抗骨折能力和骨強(qiáng)度,對(duì)評(píng)價(jià)骨骼強(qiáng)度、韌性和各組藥物抗骨質(zhì)疏作用不可缺少的重要指標(biāo)之一[15]。研究骨質(zhì)疏松，動(dòng)物體內(nèi)動(dòng)驗(yàn)使用廣泛，評(píng)價(jià)新藥干預(yù)治療骨質(zhì)疏松是否有效，都要進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過觀察藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生化指標(biāo)、生理功能、藥物對(duì)病理等的影響，以判斷藥物干預(yù)治療動(dòng)物骨質(zhì)疏松的效果；當(dāng)藥物的作用主要是減少骨質(zhì)疏松的骨折傾向和骨脆性時(shí)，難于以人在體實(shí)驗(yàn)考察藥物的效果，而通過動(dòng)物的骨組織等的生物力學(xué)測(cè)試分析則能對(duì)藥物干預(yù)治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)[1]。沖擊測(cè)試是研究動(dòng)物骨暴力損傷的重要方法之一。動(dòng)物骨不能像金屬材料等可以加工成標(biāo)準(zhǔn)試樣。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠股骨進(jìn)行沖擊測(cè)試，本測(cè)試采用自制的模具，將大鼠股骨試樣兩端放入自制的模具內(nèi)，向模具內(nèi)填充快干膠和義齒聚合物進(jìn)行固定，使試樣的長度加長了，使大鼠股骨能安放在沖擊試驗(yàn)機(jī)的擺放試樣的支座上。本實(shí)驗(yàn)使用的沖擊試驗(yàn)機(jī)量程小，沖擊測(cè)試前分別對(duì)各組股骨試樣進(jìn)行了預(yù)調(diào)處理，由于采取了以上各項(xiàng)干預(yù)措施，使大鼠股骨試樣沖擊測(cè)試能夠?qū)崿F(xiàn)。

沖擊測(cè)試結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型組股骨沖擊韌性、沖擊功、顯著低于以丹杞顆粒治療組，以依普拉芬治療組，正常對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)。αD3組沖擊韌性、沖擊功與模型組差異不顯著(P>0.05)。宏觀觀察各組大鼠股骨沖擊測(cè)試試樣的斷口形貌，大鼠股骨沖擊測(cè)試試樣呈粉碎形狀破壞斷口居多，斜形斷口或橫形斷口較少。正常對(duì)照組大鼠股骨骨皮質(zhì)較厚。模型組大鼠股骨骨皮質(zhì)較薄，具有骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)形式。有研究表明，切除動(dòng)物卵巢后導(dǎo)致雌激素水平的降低,骨吸收與骨形成之間的相對(duì)平衡關(guān)系被打亂,骨吸收大于骨形成，降低了骨密度，產(chǎn)生骨質(zhì)疏松,降低了骨的生物力學(xué)性能[16,17]。本實(shí)驗(yàn)支持參考文獻(xiàn)[16,17]的觀點(diǎn)。骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型大鼠骨質(zhì)疏松后由于骨的顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變使骨韌性和強(qiáng)度降低生物力學(xué)特性發(fā)生了改變。股骨骨折大致可表現(xiàn)為較高能量骨折、低能量骨折、高能量骨折，由于大鼠股骨沖擊測(cè)試的速度很高，高測(cè)試速度造成的骨損傷具有重要的臨床意義。大鼠股骨為堅(jiān)硬組織,只有在承受高能量撞擊時(shí)才會(huì)受到損傷。損傷的表現(xiàn)形式主要為骨折出現(xiàn)裂紋和爆裂性損傷,骨折出現(xiàn)裂紋系由緩慢運(yùn)動(dòng)速度的鈍器造成,形成一條骨折線。當(dāng)相對(duì)速度較高撞擊物撞擊骨時(shí),則會(huì)產(chǎn)生生爆裂性骨折。當(dāng)發(fā)生骨折時(shí)使貯存于骨內(nèi)的能量釋放，當(dāng)?shù)洼d荷時(shí)，骨內(nèi)貯存的能量釋放由骨組織的單一的裂隙完成，這種情況下產(chǎn)生很小的移位或不產(chǎn)生移位，軟組織與骨可具有完整性，當(dāng)測(cè)試速度高時(shí)，由于單一的裂隙滿足不了較大能量的釋放，從而造成大面積的軟組織損傷和爆裂性骨損傷。

有研究表明[18]，依普拉芬的主要作用機(jī)理為：作用于骨基質(zhì)的細(xì)胞能夠使骨密度增加；促進(jìn)基質(zhì)的礦化和膠原合成；增殖成骨細(xì)胞；可以起到釋放白細(xì)胞介素一6，抑制成熟破骨細(xì)胞的募集，減少破骨細(xì)胞前體的分化和增殖， 成為治療低骨量的一種藥物,由于價(jià)格較貴，未能得到廣泛的應(yīng)用。過量的服用維生素D可引起骨丟失加重，骨吸收增加,還可引起腎結(jié)石,體內(nèi)適量的維生素D 是足量鈣被體內(nèi)利用的條件，腸道鈣吸收的唯一激素是維生素D,腸道鈣的缺乏是骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病原因之一，聯(lián)合應(yīng)用鈣劑、甲狀旁腺激素、維生素D能起到相輔相成的作用[19]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用表明，甲狀旁腺素是治療骨質(zhì)疏松的有效藥物之一,甲狀旁腺素作為一種膚類激素,具有促進(jìn)骨形成的良好的作用,甲狀旁腺素還具有促進(jìn)成骨細(xì)胞生長的作用,但其有誘導(dǎo)骨腫瘤發(fā)生的可能,因此限制了其在臨床應(yīng)用[20]。

中成藥丹杞顆粒系根據(jù)中醫(yī)腎主骨的理論，研究開發(fā)出來的治療骨質(zhì)疏松的中成藥，具有強(qiáng)筋健骨提高骨密度的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲狀旁腺激素(3-34).牛、依普拉芬干預(yù)治療骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型大鼠都具有一定的效果，αD3治療效果不明顯，丹杞顆粒對(duì)恢復(fù)實(shí)驗(yàn)大鼠骨的沖擊功和沖擊韌性具有很好的作用。

本實(shí)驗(yàn)與以往研究不同的是以多種藥物對(duì)骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行干預(yù)治療，以大鼠股骨的沖擊韌性指標(biāo)研判各種藥物的治療骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)大鼠的效果更具有理論意義和臨床意義。

[1]崔 偉，劉成林.基礎(chǔ)骨生物力學(xué)(一)[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，1997，6(4)：18.

[2]陳 列,謝興文,李 寧,等.雌激素缺乏導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松病理機(jī)制的研究[J].中醫(yī)正骨,2002，14(3)：53.

[3]孫樹東,高 明,李新穎,等.脊髓損傷繼發(fā)骨質(zhì)疏松大鼠椎骨的力學(xué)變化[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),15(20):3661.

[4]杜 聯(lián)，殷麗平，陳 敏，等.補(bǔ)腎壯骨膠囊對(duì)糖尿病骨質(zhì)疏松癥骨代謝及股骨生物力學(xué)相關(guān)指標(biāo)的影響[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,27(3):17.

[5]王宗帥,梁興森,歐陽潔,等.中西藥物干預(yù)對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度和生物力學(xué)性能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)正骨，2009，21(7)：1.

[6]高 明,張忠君,馬洪順.老齡對(duì)腰椎松質(zhì)骨沖擊力學(xué)特性的影響[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程,2010,2(5)：508.

[7]王成學(xué),谷貴山,陳塑寰,等.去卵巢所致骨質(zhì)疏松大鼠骨壓縮與沖擊力學(xué)性能實(shí)驗(yàn)研究[J].中國老年學(xué)雜志,2007，27，27(14)：1347.

[8]別海洲.去勢(shì)大鼠導(dǎo)致骨質(zhì)疏松對(duì)骨拉伸與沖擊生物力學(xué)性質(zhì)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國老年學(xué)雜志,2005,25(7):810.

[9]Zhang ZJ,Li ZW,Liu XG,et al.Human umbilical cord blood stem cells and brain-derived neurotrophic factor for optic nerve injury:a biomechanical evaluation[J].Neural Regeneration Research,2015,10(7)：1134.

[10]Wang Y,Li ZW,Luo M,et al.Biological conduits combining bone marrow mesenchymal stem cells and extracellular matrix to treat longsegment[J].Neural regeneration Research,2015，10(6):965.

[11]王秀玲， 張繼波，李新穎.青年與老年頸總動(dòng)脈力學(xué)特性對(duì)比分析[J].中國老年學(xué)雜志.2015,35(22):6513.

[12]王 強(qiáng)，戰(zhàn)祥波，王 巍,等.藥物治療骨質(zhì)疏松肱骨拉伸力學(xué)特性的對(duì)比[J].中國組織工程研究，2015，19(46):7435.

[13]齊 兵，戴維群，尤建宇,等.不同種藥物干預(yù)骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨壓縮力學(xué)的變化[J].中國組織工程研究，2015，19(42):6770.

[14]劉鴻文主編.材料力學(xué)[M].北京：人民教育出版社，1979，176.

[15]王曉東，孫 平，洪曼杰.雷奈酸鍶對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠骨超微結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)特性的影響[J].廣東醫(yī)學(xué),2011,32(2):158.

[16]李 良,陳槐卿,陳孟詩,等.建立骨質(zhì)疏松山羊模型初探[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,1998,4(2):12.

[17]李 良,陳槐卿,陳孟詩,等.去卵巢山羊長骨生物力學(xué)性能的變化[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,1998,15(2):101.

[18]裴春改，趙燕玲，劉忠厚.依普拉芬治療骨質(zhì)疏松的基礎(chǔ)研究[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，1997,3(4):86.

[19]許惠英.治療骨質(zhì)疏松癥藥物的應(yīng)用進(jìn)展[J].廣東藥學(xué) 2004,14(5):35.

[20]馬尊良，邢學(xué)農(nóng).甲狀旁腺素治治療骨質(zhì)疏松的新進(jìn)展[J].國際老年醫(yī)學(xué)雜志，2010,31(6)：274.

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