白盈盈,朱光旭，潘興華

(1.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院 細胞生物治療中心、細胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室、云南省干細胞工程實驗室，云南 昆明650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué) 成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床學(xué)院，云南 昆明650500)

DNA甲基化檢測在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用

白盈盈1,2,朱光旭1*，潘興華1*

(1.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院 細胞生物治療中心、細胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室、云南省干細胞工程實驗室，云南 昆明650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué) 成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床學(xué)院，云南 昆明650500)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球男性第3、女性第2常見的惡性腫瘤，死亡率占全球癌癥的第4位，每年約有69.4萬人死于此病[1]。在中國，CRC的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，現(xiàn)已高居男女腫瘤發(fā)病率的第5位和第4位[2]。對于早期CRC患者，多數(shù)可以治愈，5年生存率可達90%，而對于晚期患者則不足10%[3]，然而多數(shù)CRC患者確診時已到中晚期，早期CRC缺乏典型臨床癥狀不易察覺，因此有效的早期診斷方法可以降低CRC的發(fā)病率和病死率以及提高患者生存率。目前，侵入性的結(jié)腸鏡檢查和糞便隱血試驗(Fecal occult blood teats，F(xiàn)OBT)是CRC診斷的主要手段,但是FOBT缺乏特異性，難以滿足結(jié)直腸癌診斷的要求。結(jié)腸鏡檢查的特異性可達95%，但屬于侵入性檢查，并且有高風(fēng)險的并發(fā)癥，難以在人群中進行大規(guī)模的篩查[4]，因此急需方便、準確的生物標志物應(yīng)用于CRC的診斷。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤形成過程中，表觀遺傳學(xué)改變可能比經(jīng)典遺傳學(xué)改變更早發(fā)生[5]。DNA甲基化作為表觀遺傳修飾的重要方式，與CRC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，且在癌癥的早期階段就已發(fā)生，使其可能成為CRC早期診斷的新型生物標記物。

1 DNA甲基化

DNA甲基化(DNA methylation)是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，Dnmt)催化作用下，將 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)的甲基共價結(jié)合到胞嘧啶磷酸鳥嘌呤二核苷酸(CpG)的 5’-末端，生成 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mc)的過程[6]。在哺乳動物中，70%-80% 的 CpG 位點發(fā)生 DNA 甲基化，剩余的分布于基因的啟動子區(qū)處于未甲基化狀態(tài)[7]。在腫瘤細胞基因組中，CpG島呈現(xiàn)異常DNA甲基化狀態(tài)，通過直接或間接作用抑制基因轉(zhuǎn)錄，從而影響基因表達[8]。

2 DNA甲基化檢測與結(jié)直腸癌診斷的相關(guān)性

DNA甲基化與CRC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)?；蚣谆瘷z測在CRC診斷的應(yīng)用中，檢測標本來源主要有局部組織、血漿以及糞便三類，大量文獻基于這三種標本進行了基因甲基化檢測用于CRC診斷的研究，結(jié)果表明基因甲基化檢測對于CRC的診斷具有不同程度的敏感性和特異性(表1)，同時也提示單一依靠局部組織、血漿或糞便標本進行甲基化檢測難以比較準確地實現(xiàn)CRC診斷。

3 CRC患者DNA甲基化檢測

在CRC患者中，多種來源的標本，如血液、糞便、組織等中均檢測到異常DNA甲基化,因此進行DNA甲基化檢測在臨床上對結(jié)直腸癌診斷可能具有較好的潛在價值[9]。迄今文獻對于CRC診斷的DNA甲基化檢測主要包括了一下幾種方式：

3.1 組織DNA甲基化的檢測

活體組織檢查是腫瘤診斷的重要手段，腫瘤樣本組織相比于血液、糞便等樣本具有更早的發(fā)生率、更高的準確性，對CRC病變組織進行DNA甲基化檢測有助于其準確的診斷。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織、癌前病變中啟動子區(qū)域基因甲基化陽性率高于遠離結(jié)直腸癌的正常組織，表明活檢組織基因啟動子甲基化檢測可以為CRC患者提供準確的早期病情判斷和預(yù)后評估依據(jù)，具有廣泛的臨床應(yīng)用價值[10]。但是，腫瘤組織標本相較于血液、糞便，其提取過程是侵入性的，且取材部位也能影響診斷準確性，因此不適于大范圍的CRC早期篩查。

3.2 血液DNA 甲基化的檢測

腫瘤細胞可向外周血釋放 DNA，在患者血清和血漿內(nèi)可以檢測到異常的較高濃度的DNA甲基化[11]，因此檢測腫瘤患者血液中游離的 DNA 甲基化水平可能為CRC診斷及預(yù)后等提供新的方法和思路。Epi proColon是以細胞質(zhì)分裂基因9(Septin9)基因為基礎(chǔ)開發(fā)的，也是最早商業(yè)化并進入臨床試驗甲基化檢測試劑盒,尤其是第二代血漿 SEPI9甲基化檢測試劑盒(Eoi proColon 2.0)[12]的臨床應(yīng)用為CRC的早期診斷提供了一重要的新手段。目前國內(nèi)已有 BioChain公司授權(quán)代理第二代 SEPT9 基因甲基化CRC 檢測試劑盒(Epi proColon 2．0)，并實現(xiàn)了國產(chǎn)化，初步臨床試驗結(jié)果顯示檢出CRC的總體特異性高達87.4%，敏感性為74.8%[13]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)更多的特定基因甲基化可能作為生物標志物用于CRC早期篩選及診斷(表1)。但是血液標本不具有器官特異性，全身各部位器官的惡性腫瘤均會引起血液中甲基化指標異常，因此血液DNA甲基化檢測難以作為CRC完全特異性的診斷手段。

表1 CRC患者不同類型標本中相關(guān)甲基化基因檢測

3.3 糞便DNA甲基化的檢測

糞便中的生物標志物檢測是一種很有前途的結(jié)直腸癌篩查方法。在早期的結(jié)直腸癌中，腫瘤細胞可能脫落進入腸腔,并與糞便混合;并且腸道是堿性環(huán)境，有利于 DNA 的保存，使從糞便提取的 DNA性質(zhì)穩(wěn)定、敏感性高[25]。糞便樣本檢測作為一種檢測相對高效能和高特異性的非侵入性手段，其基因甲基化檢測可作為結(jié)直腸癌早期篩查工具應(yīng)用于臨床實踐。Vimentin在CRC發(fā)生中扮演重要角色，并且很容易在糞便中檢測出來，其在診斷CRC和進展期腺瘤的敏感性分別可高達81%和83%[26]，目前Vimentin基因已成為市場上首次應(yīng)用糞便 DNA 甲基化作為大腸癌診斷性檢測的靶基因。ColoSure是以糞便標本提取DNA樣本,通過定量檢測糞便中 Vimentin 基因高甲基化而開發(fā)的第一個商業(yè)化CRC篩選試劑盒[27]。但是由于糞便中混雜了多種物質(zhì)，對提取高質(zhì)量的糞便DNA存在一定的阻礙，因此可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，影響CRC的早期診斷。

3.4 DNA甲基化聯(lián)合檢測

研究表明基因甲基化聯(lián)合檢測優(yōu)于單個基因甲基化檢測，可以彌補以單一基因的甲基化檢測可能存在敏感性和特異性不足的問題[28]。對CRC患者、進展期腺瘤患者和結(jié)腸鏡陰性組vimentin 和SFRP2 甲基化狀態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)，大腸癌組中 vimentin和SFRP2 甲基化陽性檢出率分別為55.0%和70.0%;進展期腺瘤組中為48.0%和64.0%;正常對照組中為 6.7%和0。在病例組中兩基因聯(lián)合檢測的敏感性為83.1%，明顯高于 vimentin 的52.3%和 SFRP2 的67.7%，更要高于 FOBT的27.7%，而在正常對照組中兩基因聯(lián)合檢測的陽性率均無明顯差異[27]，提示在CRC診斷中，聯(lián)合檢測糞便中 vimentin 和 SFRP2 基因甲基化狀態(tài)在敏感性、特異性方面均優(yōu)于單個基因甲基化檢測，表明基因甲基化聯(lián)合檢測較單基因甲基化檢測更能提供較準確的診斷。

4 總結(jié)與展望

隨著對腫瘤表觀遺傳學(xué)研究的深入，不斷發(fā)現(xiàn)可以用作腫瘤診斷的新型生物標志物。DNA甲基化作為新的生物標志在臨床上的微創(chuàng)診斷、預(yù)后評估、預(yù)測治療反應(yīng)、監(jiān)測病情等方面不斷展示其可能的潛在應(yīng)用價值，為CRC篩查和早期診斷提供了不同于傳統(tǒng)方法的全新手段，極具開發(fā)和臨床應(yīng)用潛力。目前已經(jīng)有為數(shù)不多的幾個以DNA甲基化檢測為基礎(chǔ)的商業(yè)化試劑盒投入了CRC臨床診斷應(yīng)用，這僅僅是該方法用于臨床診斷的開端，仍然存在一些問題需要進一步解決，比如與CRC有關(guān)的標志甲基化基因的篩選，在方法上如樣品儲存、糞便DNA或循環(huán)DNA提取、甲基化檢測標準化，以及單個基因甲基化檢測與多個基因甲基化聯(lián)合檢測在敏感性和特異性方面的比對等，尚需進行大量細致的工作加以論證和闡明。

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國家自然科學(xué)基金項目(81170316)

1007-4287(2016)12-2139-04

白盈盈，女，26歲，在讀碩士研究生，主要從事臨床實驗診斷研究;朱光旭，男，副主任技師，主要從事心血管疾病發(fā)病機制及診斷研究;潘興華，男，主任醫(yī)師，主要研究方向為干細胞與組織工程。

2016-07-19)

*通訊作者