葉 芳，柏 平，曾凡星，石麗君

體育科學(xué)

不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)及功能影響的氧化應(yīng)激機(jī)制

葉 芳，柏 平，曾凡星，石麗君

目的：觀察不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)及功能的影響，探討氧化應(yīng)激在其中的作用機(jī)制。方法：選用3月齡雄性SHR和正常血壓大鼠(Wistar Kyoto，WKY)隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(SHR-C，WKY-C)、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(SHR-M，WKY-M)和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(WKY-H，SHR-H)。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組以18～20 m/min、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組以26～28 m/min進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，坡度為0°，60 min/天，5天/周。8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練末進(jìn)行無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)試、血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)、內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察及腸系膜動(dòng)脈微血管張力測(cè)定。結(jié)果：1)SHR-M的收縮壓和舒張壓顯著低于SHR-C(P<0.05)，而SHR-H顯著高于SHR-C(P<0.05)。2)血清氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)檢測(cè)顯示：SHR-C組血清MDA含量與WKY-C相比，均值有升高趨勢(shì)但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，SHR-M組MDA含量與SHR-C不具有顯著性差異(P>0.05)，但SHR-H血清MDA含量顯著高于SHR-C(P<0.05)；抗氧化物酶谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)顯示：SHR-C GSH-Px酶活力顯著低于WKY-C組(P<0.05)，SHR-M組和SHR-H組GSH-Px酶活力顯著高于SHR-C(P<0.05)。WKY-M SOD顯著高于WKY-C(P<0.05)，SHR運(yùn)動(dòng)組與SHR安靜組相比較SOD無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。3)透射電鏡結(jié)果顯示：SHR-C和SHR-H組均表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞畸形、膠原纖維增生，而SHR-M血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)完整。4)微血管張力測(cè)定結(jié)果顯示：SHR-C內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張能力顯著小于WKY-C，SHR-M內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張能力顯著高于SHR-C，而SHR-H顯著低于SHR-M(P<0.05)。結(jié)論：中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以降低高血壓大鼠血壓、改善內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能，其機(jī)制可能與運(yùn)動(dòng)降低氧化應(yīng)激水平相關(guān)。然而，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則上調(diào)氧化應(yīng)激水平，加劇了高血壓誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能紊亂。

運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度；高血壓；內(nèi)皮；氧化應(yīng)激

內(nèi)皮細(xì)胞主要以旁分泌方式分泌血管活性物質(zhì)，作用于臨近的組織、細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)包括血管舒張因子(EDRF)和血管收縮因子(EDCF)，兩者共同作用于血管張力的調(diào)控。但是，在高血壓的病理?xiàng)l件下，全身阻力血管處于高應(yīng)力狀態(tài)，通過(guò)打破EDRF和EDCF之間的平衡，直接造成內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變和功能的失調(diào)，加重高血壓的發(fā)生和發(fā)展。在已有研究中，高血壓大鼠模型中選用不同類(lèi)型的動(dòng)脈，如：大動(dòng)脈(主動(dòng)脈、頸動(dòng)脈)、微血管(腎血管、腸系膜動(dòng)脈)，都存在著內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能的下降。內(nèi)皮功能紊亂是由多因素共同產(chǎn)生的[11]，其中氧化應(yīng)激(Oxidative Stress，OS)是最關(guān)鍵的因素。OS是一種氧化水平與抗氧化水平的失衡狀態(tài)，不同程度氧化應(yīng)激水平使活性氧簇(reactive oxidative species，ROS)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同的效應(yīng)。適宜的ROS水平，使機(jī)體適應(yīng)性的上調(diào)酶和非酶抗氧化物的含量，使ROS發(fā)揮正常的生理功能，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生正向作用。如果ROS大量蓄積而引起氧化損傷，可能會(huì)導(dǎo)致大分子，如DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)的改變和破壞，甚至危及到細(xì)胞死亡和組織損傷[5,9]。因此，有研究將抗氧化物應(yīng)用于內(nèi)皮功能紊亂和相關(guān)的心血管疾病的治療中。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)伴有內(nèi)皮功能紊亂的冠狀動(dòng)脈疾病，可通過(guò)注射維生素-C調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平，提高NO生物利用度，達(dá)到治療的效果[14]。有學(xué)者提出，對(duì)高血壓大鼠模型注射SOD1，研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組大鼠血壓顯著下降[23]。抗氧化物的治療主要通過(guò)減少ROS的生成，降低OS水平，從而達(dá)到降壓效果。然而，ROS并不是單純對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響，它是機(jī)體正常代謝的產(chǎn)物，運(yùn)動(dòng)、衰老、炎癥都伴隨ROS的產(chǎn)生。

《中國(guó)高血壓基層管理指南》(下文簡(jiǎn)稱(chēng)《指南》)明確表明，改善長(zhǎng)期生活方式是治療高血壓的基石，運(yùn)動(dòng)是改善生活方式的重要一環(huán)?！吨改稀吠扑]高血壓患者選擇中等運(yùn)動(dòng)方式，進(jìn)行每周5～7次，每次持續(xù)30 min的運(yùn)動(dòng)，這是對(duì)運(yùn)動(dòng)作為預(yù)防和治療高血壓疾病的認(rèn)可[2]。研究表明，定期有氧運(yùn)動(dòng)是一種有效的干預(yù)策略，可以改善疾病狀態(tài)下內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張能力，如慢性心臟衰竭和高血壓[28]。長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)鍛煉可以使機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性的變化，從而提高心血管的功能。然而，在選擇運(yùn)動(dòng)作為治療手段時(shí)，運(yùn)動(dòng)處方往往會(huì)選擇中低強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)，對(duì)于不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，尤其是中等強(qiáng)度和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓疾病的內(nèi)皮功能和超微結(jié)構(gòu)影響如何，以及不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度下氧化應(yīng)激水平會(huì)如何調(diào)控內(nèi)皮功能，目前國(guó)內(nèi)外研究尚少。本研究以不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度下氧化應(yīng)激水平對(duì)內(nèi)皮的功能性影響為立足點(diǎn)，探究高血壓運(yùn)動(dòng)治療方法的有效運(yùn)動(dòng)負(fù)荷。

本實(shí)驗(yàn)擬用自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)和正常血壓大鼠(Wistar Kyoto，WKY)隨機(jī)分為安靜對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組。運(yùn)動(dòng)組以中等強(qiáng)度和高強(qiáng)度進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，觀察不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度下的系統(tǒng)血壓、內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和功能的變化，探討氧化應(yīng)激在其中的作用機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)療法的量——效關(guān)系以及運(yùn)動(dòng)處方的制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)方案

本實(shí)驗(yàn)選用3月齡雄性高血壓大鼠(SHR，n=24)和同齡的正常血壓大鼠(WKY，n=24)，體重約250 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。將SHR、WKY隨機(jī)分成安靜組(SHR-C，n=8；WKY-C，n=8)和運(yùn)動(dòng)組。運(yùn)動(dòng)組根據(jù)不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度分成高血壓中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(SHR-M，n=8)、普通血壓中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(WKY-M，n=8)、高血壓高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(SHR-H，n=8)和正常血壓高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(WKY-H，n=8)。全部動(dòng)物由北京體育大學(xué)動(dòng)物房飼養(yǎng)，保持室溫約22℃，濕度保持40%～45%，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2 尾動(dòng)脈血壓的測(cè)量

訓(xùn)練前和8周訓(xùn)練后采用尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)試儀(BP-2010A，軟隆科技有限公司，日本)測(cè)量各組大鼠的收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)。

1.3 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)，麻醉開(kāi)腹后用粗紗布去除腹部筋膜和其他組織，找到下腔靜脈進(jìn)行采血，取血后在離心機(jī)上以3 500 r/min離心15 min，取上層血清并儲(chǔ)存于-80℃，直到下次進(jìn)行血清指標(biāo)的分析時(shí)取出。

1.4 透射電鏡檢測(cè)

麻醉開(kāi)腹后迅速取下腸系膜動(dòng)脈(mesenteric artery，MA)，剝離周?chē)M織，防止組織自溶現(xiàn)象，在最短時(shí)間內(nèi)投入4℃2.5%戊二醛固定液，并在固定液中過(guò)夜。次日用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次至少15 min；沖洗完畢進(jìn)行脫水步驟，應(yīng)梯度進(jìn)行：70% 丙酮15 min→80% 丙酮15 min→90%丙酮15 min→100% 丙酮20 min(10 min×2)；組織進(jìn)行浸透和包埋，形成包埋塊室溫儲(chǔ)存；超薄切片染色后JEOL JEM-1230(日本)透射電鏡進(jìn)行觀察并攝片。

1.5 微血管張力測(cè)定

麻醉開(kāi)腹后迅速取出腸系膜動(dòng)脈組織，置于4℃ Na-Hepes緩沖液的平皿中。選取一小段含MA零級(jí)及其含有三級(jí)分支的血管，固定于含有4℃ Na-Hepes緩沖液的膠皿。在體視顯微鏡下輕輕剪去MA上的脂肪組織，暴露出腸系膜動(dòng)、靜脈，辨別出靜脈，去除靜脈后剪取4段約1.5 mm長(zhǎng)的三級(jí)MA備用。為保證血管活性，全程杜絕牽扯。將一根2 cm左右長(zhǎng)的鎢絲穿進(jìn)備好的三級(jí)MA管腔中，并固定在內(nèi)含5 mL Na-Hepes(pH=7.4，T=37℃)離體微血管環(huán)張力測(cè)定儀上，在儀器上操作將另一根鎢絲穿入管腔。浴槽持續(xù)通95% O2-5% CO2的混合氣，保持浴槽溫度37℃。調(diào)節(jié)微調(diào)標(biāo)尺，稍稍將血管擴(kuò)張，張力調(diào)零平衡20 min，此后張力穩(wěn)定保持在0 mN之后緩慢持續(xù)增加血管張力，當(dāng)血管基礎(chǔ)張力穩(wěn)定維持在1 mN左右停止。平衡后，動(dòng)脈血管環(huán)浴槽中加藥觀察血管收縮、舒張功能。固定離體血管環(huán)后，每輪加藥后用5 mL Na-Hepes三次洗脫，等到血管環(huán)張力穩(wěn)定在1 mN左右進(jìn)行下一輪加藥。

Na-Hepes緩沖液成分(mmol/L)：121.1 NaCl、10 Hepes、15.16 KCl、2.4 MgSO4、11.08 Glucose，1.6 CaCl2。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血壓的影響

訓(xùn)練前和8周正式訓(xùn)練末對(duì)各組大鼠進(jìn)行無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)定，結(jié)果表明：訓(xùn)練末WKY-M和WKY-H與正常血壓安靜組相比，收縮壓(SBP)均顯著下降(P<0.05)；然而，SHR-M SBP水平顯著低于SHR-C(P<0.05)，而SHR-H組不僅顯著高于SHR-C，亦顯著高于SHR-M(P<0.05)。正常血壓運(yùn)動(dòng)組與正常血壓安靜組舒張壓(DBP)無(wú)顯著性差異(P<0.05)，但SHR-M、SHR-H與SHR-C存在顯著性差異(P<0.05)，具體表現(xiàn)為SHR-M DBP顯著低于SHR-C；SHR-H則顯著高于SHR-M和SHR-C(P<0.05)。此外，訓(xùn)練末SHR-M和SHR-H SBP和DBP均與各自訓(xùn)練前結(jié)果存在顯著性差異(P<0.05，表1)。

表 1 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血壓的影響Table 1 The Effects of Exercise with Different Intensity on Rats’Blood Pressure (mmHg)

注：Initial指訓(xùn)練前，F(xiàn)inal指8周正式訓(xùn)練末；SBP為收縮壓；DBP為舒張壓。*表示P<0.05，與WKY-C進(jìn)行比較；#表示P<0.05，與SHR-C比較；+表示P<0.05，與SHR-M比較；$表示P<0.05，與Initial比較。

2.2 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)氧化應(yīng)激水平的影響

2.2.1 丙二醛(MDA)

SHR-C組(10.9±1.2 nmol/mL)血清MDA含量與WKY-C(8.5±0.6 nmol/mL)比較，均值有升高趨勢(shì)，但是不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。SHR-H(21.0±3.1 nmol/mL)MDA含量顯著高于SHR-C組(P<0.05)，亦顯著高于SHR-M組(10.7±2.0 nmol/mL，P<0.05)，而SHR-M組與SHR-C組比較并不存在顯著性差異(P>0.05，圖1A)。

2.2.2 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)

GSH-Px是機(jī)體重要的過(guò)氧化物分解酶，它特異的催化還原性谷胱甘肽對(duì)過(guò)氧化氫產(chǎn)生還原反應(yīng)。SHR-C組GSH-Px酶活力顯著低于WKY-C(SHR-C：1 348.1±42.5 U；WKY-C：1 562.6±68.9 U，P<0.05)。不同強(qiáng)度的高血壓運(yùn)動(dòng)組與高血壓安靜組相比均表現(xiàn)出抗氧化物酶GSH-Px顯著增加(P<0.05)，但SHR-M與SHR-H兩組間不具有顯著性差異(SHR-M：1 639.2±119.5 U：SHR-H：1 685.1±35.00 U，P>0.05，圖1B)。

圖 1 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)柱狀圖Figure1. Indicators of OxidativeStress in Serum

注：MDA：丙二醛；GSH-Px：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶；SOD：過(guò)氧化物歧化酶；Cu/Zn-SOD為SOD的分型。 *P<0.05，與WKY-C進(jìn)行比較；#P<0.05，與SHR-C比較；+P<0.05，與SHR-M比較。

2.2.3 過(guò)氧化物歧化酶(SOD)

血清總SOD(T-SOD)測(cè)定顯示，WKY-M組(232.9±3.6 U/mL)顯著高于WKY-C組(217.7±0.6 U/mL，P<0.05)，WKY-H與WKY-C、WKY-M相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，高血壓不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組與高血壓安靜組均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1C)。

Cu/Zn-SOD是SOD的分型，與內(nèi)皮依賴(lài)性超極化因子發(fā)生有關(guān)。8周運(yùn)動(dòng)后，正常血壓運(yùn)動(dòng)組無(wú)論中強(qiáng)度還是高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，Cu/Zn-SOD均顯著高于WKY-C組(WKY-C：163.9±4.0 U/mL；WKY-M：226.5±6.3 U/mL；WKY-H：211.8±19.7 U/mL，P<0.05)。SHR-C組Cu/Zn-SOD(213.0±1.6 U/mL)顯著高于WKY-C(P<0.05)，SHR-M、SHR-H與SHR-C相比均無(wú)顯著性差異，SHR-M與SHR-H之間亦不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1D)。

2.3 內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WKY組MA內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平狀，表面可見(jiàn)微絨毛，內(nèi)膜連續(xù)性完好、內(nèi)彈力膜平直與內(nèi)皮細(xì)胞伴行，平滑肌排列較整齊；SHR組腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞失去正常形態(tài)，核大而畸形，內(nèi)皮細(xì)胞呈指狀突向內(nèi)腔，表面微絨毛結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞器脫落形成空泡，內(nèi)彈性模不規(guī)則，大量膠原纖維增生至內(nèi)膜層。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)逆轉(zhuǎn)高血壓內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，內(nèi)皮細(xì)胞較完整；高血壓高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組內(nèi)皮細(xì)胞核大，不規(guī)則，出現(xiàn)空泡狀結(jié)構(gòu)，大量膠原纖維增生(圖2)。

圖 2 大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖Figure2. Ultrastructure of Endothlial Cells of Mesenteric Artery of Rats 注：EC：內(nèi)皮細(xì)胞； IEL：內(nèi)彈性膜；COL：膠原纖維。

2.4 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮功能的影響

2.4.1 去甲腎上腺素(NE)誘發(fā)的血管收縮反應(yīng)

為排除微血管個(gè)體差異，先以KCL(60 mmol/L)誘導(dǎo)三級(jí)腸系膜動(dòng)脈離體微血管環(huán)收縮，以產(chǎn)生的最大收縮張力作為100%Kmax。反應(yīng)達(dá)平臺(tái)加入5 mL Na-Hepes進(jìn)行3次洗脫，保持血管環(huán)張力值穩(wěn)定1 mN約10 min。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，加入去甲腎上腺素(norepinephrine，NE，10-5mol/L)誘發(fā)MA收縮，均將其張力標(biāo)準(zhǔn)化為Kmax百分比(%KMAX)，以%KMAX作為評(píng)價(jià)血管收縮反應(yīng)性的指標(biāo)。各組對(duì)KCL反應(yīng)的血管張力分別是(mN)：WKY-C(5.98±0.90)；WKY-M(6.39±0.14)；WKY-H(5.96±0.29)；SHR-C(6.00±0.22)；SHR-M(5.98±0.18)；SHR-H(6.00±0.27)，組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

NE(10-5M)誘發(fā)收縮在SHR-C組為190.6%Kmax±9.1%Kmax，與WKY-C(175.5%Kmax±8.3%Kmax)相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，給WKY施與不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)與正常血壓安靜組(WKY-C)相比均具有顯著性差異(P<0.05)，WKY-H亦與WKY-M存在顯著性差異(WKY-M：154.1%Kmax±2.3%Kmax；WKY-H：198.2%Kmax±9.1%Kmax，P<0.05)。然而，SHR-M(155.8%Kmax±5.1%Kmax)與SHR-C的血管收縮反應(yīng)性相比顯著降低 (P<0.05)； SHR-H(200.2%Kmax±10.8%Kmax)血管收縮反應(yīng)性與SHR-C沒(méi)有顯著性差異，但顯著高于SHR-M(P<0.05,圖3)。

2.4.2 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)內(nèi)皮舒張功能的影響

為評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張水平，常用遞增濃度的乙酰膽堿(ACh)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[10]。為比較不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)內(nèi)皮舒張功能的影響，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了如下步驟：1)加入KCL(60 mmol/L)待血管張力達(dá)到平臺(tái)時(shí)，Na-Hepes 3次洗脫；2)加入NE(10-5mol/L)，待血管張力達(dá)到平臺(tái)時(shí)，在浴槽依次加入半對(duì)數(shù)遞增濃度的ACh(10-9-10-5mol/L)。如圖4所示，在10-5mol/L NE刺激下，浴槽中依次加入ACh誘發(fā)MA血管環(huán)舒張，MA舒張百分比隨ACh濃度的升高呈濃度依賴(lài)性增加。

圖 3 NE誘發(fā)大鼠腸系膜動(dòng)脈收縮張力比較Figure 3. Comparison of the Tension Increase Induced by NE in Mesenteric Arteries of Rats

注：*P<0.05，與WKY-C比較；aP<0.05，與WKY-M比較；#P<0.05，與SHR-C比較；+P<0.05，與SHR-M比較。NE為去甲腎上腺素。

圖 4 ACh誘發(fā)的內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張反應(yīng)曲線圖Figure 4. ACh-induced Endothelium-dependent Vasodilation

注：圖中箭頭表示以半對(duì)數(shù)遞增濃度方式依次加入乙酰膽堿(ACh：10-9mol/L，3×10-9mol/L，10-8mol/L，3×10-8mol/L，10-7mol/L，3×10-7mol/L，10-6mol/L，3×10-6mol/L，10-5mol/L)。

ACh(10-5mol/L)誘發(fā)的最大血管舒張?jiān)赟HR-C組為87.2%NE±4.8%NE，顯著小于WKY-C(97.9%NE±1.2%NE，P<0.05)。SHR-M(95.7%NE±1.2%NE)則顯著改善SHR-C內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能(P<0.05)。然而，SHR-H(66.0%NE±3.0%NE)顯著低于SHR-C和SHR-M內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張能力(P<0.05，圖5A)。

利用GraphPad Prism 5.0劑量濃度——反應(yīng)的非線性回歸曲線計(jì)算得出EC50。pIC50 是EC50的負(fù)對(duì)數(shù)，pIC50值表示對(duì)藥物的敏感性，值越高表示對(duì)藥物的敏感性越高。各組由ACh誘發(fā)的內(nèi)皮依賴(lài)性血管pIC50分別為：WKY-C(7.65±0.06)；WKY-M(7.58±0.03)；WKY-H(7.99±0.01)；SHR-C(7.10±0.15)；SHR-M(7.65±0.05)；SHR-H(6.47±0.07)。WKY-H pIC50顯著高于WKY-C和WKY-M(P<0.05)。SHR-C組pIC50顯著低于WKY-C組(P<0.05)。SHR-M組顯著高于SHR-C組pIC50(P<0.05)，而SHR-H組則顯著低于SHR-C(P<0.05)。不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度間比較，WKY-H組 pIC50顯著高于WKY-M(P<0.05)，SHR-H組 pIC50顯著低于SHR-M(P<0.05，圖5B)。

圖 5 ACh誘發(fā)內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張的劑量-反應(yīng)曲線Figure 5. Dose-Response Curve of ACh-induced Endothelium-dependent Vasodilation

注：圖A為ACh誘發(fā)內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張的劑量反應(yīng)曲線，縱坐標(biāo)將NE誘發(fā)MA收縮張力峰值作為100%。圖B為ACh劑量反應(yīng)的pIC50比較。pIC50，ACh誘導(dǎo)血管舒張達(dá)50%的藥物濃度負(fù)對(duì)數(shù)，反映血管對(duì)藥物的敏感性。*P<0.05，與WKY-C進(jìn)行比較；#P<0.05，與SHR-C比較；aP<0.05，與WKY-M比較；+P<0.05，與SHR-M比較。

硝普鈉(SNP)作用于平滑肌細(xì)胞使血管舒張，舒張百分比隨SNP的升高濃度呈依賴(lài)性增加。本研究結(jié)果，6組均可以完全舒張，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，排除了各組間由于平滑肌作用帶來(lái)的舒張差異(圖6)。

2.4.3 氧化應(yīng)激對(duì)內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張的作用

為檢測(cè)氧化應(yīng)激對(duì)各組血管舒張功能的貢獻(xiàn)程度，我們進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：1)加入KCL(60 mmol/L)待血管張力達(dá)到平臺(tái)時(shí)，Na-Hepes3次洗脫；2)加入NE(10-5mol/L)，待血管張力達(dá)到平臺(tái)時(shí)，在浴槽依次加入半對(duì)數(shù)遞增濃度的ACh；3)加入NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin(3×10-4mol/L)孵育15 min，加入NE(10-5mol/L)，待血管張力達(dá)到平臺(tái)時(shí)，依次加入遞增濃度ACh。觀察ACh最大濃度下血管舒張百分比，比較加藥前、后舒張百分比是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Apocynin預(yù)孵育15 min后，在NE的刺激下，離體微血管環(huán)表現(xiàn)出的舒張程度隨ACh濃度的升高呈依賴(lài)性的增加。每組對(duì)加入Apocynin前后，ACh誘發(fā)血管最大舒張百分比進(jìn)行前后對(duì)照，只有SHR-H加抑制劑Apocynin前與加藥后具有顯著性差異(P<0.05，表2)。

圖 6 SNP誘發(fā)非內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張的劑量-反應(yīng)曲線圖Figure 6. Dose-Response Curve of SNP-induced Endothelium-independent Vasodilation

注：SNP誘發(fā)非內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張的劑量反應(yīng)曲線，縱坐標(biāo)將NE誘發(fā)MA收縮張力峰值作為100%。

3 討論

本研究以SHR和WKY為對(duì)象，觀察了不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)其腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)及功能的影響，并探討了氧化應(yīng)激在其中的可能作用機(jī)制。

有研究對(duì)不同月齡SHR長(zhǎng)期施加低強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，結(jié)果顯示：長(zhǎng)期低強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)使青年鼠和成年鼠都會(huì)產(chǎn)生降低動(dòng)脈血壓的效果[34]。有學(xué)者提出，長(zhǎng)期中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)可以使高血壓患者SBP降低約6～10 mmHg，而DBP降低約4～8 mmHg[15]。然而，高強(qiáng)度對(duì)自發(fā)性高血壓的降壓效果如何并沒(méi)有明確結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)對(duì)高血壓大鼠施加中等強(qiáng)度和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，與正常血壓組進(jìn)行對(duì)照，闡述運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度與系統(tǒng)血壓之間的量——效關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高血壓組中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后SBP和DBP顯著低于高血壓安靜組血壓水平，而高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組顯著高于高血壓安靜組所測(cè)血壓值。因此，高血壓組施加不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度會(huì)產(chǎn)生相反的效果，即高血壓大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可以有效降低SBP和DBP；高血壓大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)明顯提高高血壓大鼠SBP和DBP。對(duì)比訓(xùn)練前和后的血壓值，高血壓安靜組顯示安靜血壓隨增齡顯著上升，這與前人研究結(jié)果一致[13]。有研究表明，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓大鼠內(nèi)皮功能[19]和抗氧化功能[4]產(chǎn)生積極影響，有利于對(duì)血壓的調(diào)控。高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓大鼠血壓產(chǎn)生不利影響可能與內(nèi)皮功能紊亂、血管張力調(diào)控功能下降有關(guān)，進(jìn)而影響血壓。有研究表明，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致高血壓大鼠eNOS磷酸化水平降低，增加eNOS依賴(lài)活性氧的增加，影響內(nèi)皮功能[6]。氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)血管進(jìn)行重構(gòu)，改變正常的生理過(guò)程，產(chǎn)生內(nèi)皮功能紊亂，影響血管收縮、舒張功能。所以，本文以氧化應(yīng)激角度，研究不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓內(nèi)皮功能影響的分子機(jī)制。

表 2 Apocynin對(duì)ACh誘發(fā)內(nèi)皮依賴(lài)性最大舒張的影響Table 2 Effect ofApocyninon the Maximum Percentage of Endothelium-dependent VasodilationInduced by ACh

注：由NE收縮離體微血管環(huán)達(dá)到張力峰值作為100%最大反應(yīng)，ACh舒張離體微血管環(huán)，以最大Relaxation(%NE)表示內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張水平。Control組是正常ACh誘發(fā)微動(dòng)脈最大舒張，Apocynin組是在血管收縮前加入NAD(P)H氧化酶抑制劑，由ACh誘發(fā)微動(dòng)脈最大舒張百分比。$ P<0.05，與各自空白對(duì)照組進(jìn)行比較。

氧化應(yīng)激是高血壓等心血管疾病共同的病理生理過(guò)程，它在高血壓防治中已被作為治療靶點(diǎn)[18,29]。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)老年大鼠進(jìn)行36周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練并沒(méi)有改變心臟脂質(zhì)過(guò)氧化物的生物標(biāo)記物，即反映機(jī)體MDA含量的TBARS水平并沒(méi)有發(fā)生改變，是因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)使大鼠體內(nèi)發(fā)生適應(yīng)性變化，誘導(dǎo)減少由于單個(gè)運(yùn)動(dòng)周期所產(chǎn)生的暫時(shí)性的氧化應(yīng)激狀態(tài)[33]。運(yùn)動(dòng)由于增加了10～20倍的氧消耗，使通過(guò)線粒體產(chǎn)生的ROS大量增加[30]。在運(yùn)動(dòng)中ROS的產(chǎn)生作為信號(hào)物質(zhì)，可以使細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)下適應(yīng)地產(chǎn)生相關(guān)的抗氧化物酶的增加[17]。研究不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度下氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，是誘導(dǎo)內(nèi)皮功能改變、影響血壓變化的重要機(jī)制之一。氧化應(yīng)激水平由氧化產(chǎn)物與抗氧化物酶之間的平衡關(guān)系所評(píng)價(jià)，最常見(jiàn)的指標(biāo)是MDA(氧化產(chǎn)物的代表)，GSH-Px和SOD(抗氧化物酶的代表)[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SHR-C的MDA含量與WKY-C相比有增加趨勢(shì)，但不具有顯著性差異，這可能與樣本量少有關(guān)。SHR-H的氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA和抗氧化酶指標(biāo)GSH-Px都表現(xiàn)出增加，但是，前者增加了約1倍，后者增加了約0.3倍，反映出氧化和抗氧化的平衡重心向氧化一邊傾斜；SHR-M與SHR-C相比，SHR-M的MDA含量雖然不變，但是抗氧化物酶GSH-Px顯著增加，表現(xiàn)抗氧化能力的增加。有研究表明，一次力竭運(yùn)動(dòng)后會(huì)使ROS產(chǎn)物增加，運(yùn)動(dòng)后抗氧化物酶含量增加是運(yùn)動(dòng)中產(chǎn)生氧化應(yīng)激機(jī)制的反饋。本實(shí)驗(yàn)中，不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的高血壓大鼠均表現(xiàn)出抗氧化物酶GSH-Px顯著增加，這可能是對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程對(duì)產(chǎn)生的大量氧化產(chǎn)物所表現(xiàn)的適應(yīng)性。GSH-Px酶活力在運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)生的變化眾說(shuō)紛紜。有學(xué)者報(bào)道與本實(shí)驗(yàn)GSH-Px結(jié)果相似，運(yùn)動(dòng)會(huì)使GSH-Px活力上升[30,20-21]。然而，也有研究表明運(yùn)動(dòng)使高血壓GSH-Px活力下降[22,31]。當(dāng)然，還有部分研究支持在運(yùn)動(dòng)后GSH-Px活力并沒(méi)有發(fā)生變化[8,12,16]。Kamal等對(duì)大鼠給予3種不同的運(yùn)動(dòng)方式，即耐力運(yùn)動(dòng)、阻力運(yùn)動(dòng)、耐力加阻力運(yùn)動(dòng)，分別對(duì)其氧化應(yīng)激水平以及抗氧化物酶進(jìn)行比較。研究結(jié)果顯示，3組不同的運(yùn)動(dòng)方式均使氧化應(yīng)激水平下降(MDA含量的下降和SOD酶活力的增加)，但是，一些抗氧化物酶(CAT、GSH-Px)活力變化趨勢(shì)是不同[24]。所以，抗氧化物酶活力變化趨勢(shì)不同，可能與實(shí)驗(yàn)對(duì)象的選擇、運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間有關(guān)，這還需進(jìn)一步的研究。

長(zhǎng)時(shí)間的適宜強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可刺激氧化產(chǎn)物和抗氧化物酶的生成、減少許多慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，但是，過(guò)多的ROS可以攻擊細(xì)胞的成分，內(nèi)皮亦是其攻擊靶點(diǎn)，可以改變內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[7]。有研究報(bào)道，SHR血管內(nèi)皮細(xì)胞變形，細(xì)胞核增大，細(xì)胞膜向管腔呈指狀突起[10]，這與我們的結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)有益于高血壓大鼠內(nèi)皮細(xì)胞的完整，而高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則加重了內(nèi)皮細(xì)胞的畸形和凋亡。內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)伴隨高血壓疾病發(fā)生改變，結(jié)構(gòu)的改變必然會(huì)影響其正常生理功能，影響內(nèi)皮發(fā)揮血管舒張的能力。本研究中的內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能實(shí)驗(yàn)，也為此提供了有利證據(jù)。

有研究表明，通過(guò)外源性抗氧化物治療可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平，改善內(nèi)皮功能紊亂。抗氧化物的治療主要通過(guò)降低活性氧簇的生成、降低氧化應(yīng)激水平、改善內(nèi)皮功能，進(jìn)而達(dá)到降壓效果[14]。所以，內(nèi)皮功能的正常發(fā)揮與氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)。有學(xué)者提出，適當(dāng)?shù)幕钚匝醮厮綍?huì)產(chǎn)生正向作用，機(jī)體可以產(chǎn)生一些適應(yīng)性變化，即機(jī)體本身的負(fù)反饋產(chǎn)生更多的抗氧化物酶；然而，在活性氧簇水平很高的情況下，對(duì)機(jī)體DNA、細(xì)胞、組織產(chǎn)生攻擊，并且誘導(dǎo)血管進(jìn)行重構(gòu)，改變正常的生理過(guò)程，產(chǎn)生內(nèi)皮功能紊亂、血管張力調(diào)控能力下降，影響血管收縮、舒張功能[1]。本實(shí)驗(yàn)中，觀察了高應(yīng)力狀態(tài)下外周阻力血管——MA收縮反應(yīng)性和舒張功能的變化，以及不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度調(diào)控內(nèi)皮功能的氧化應(yīng)激機(jī)制。本研究結(jié)果表明，SHR-H血清MDA含量顯著高于SHR-C組，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使高血壓大鼠產(chǎn)生大量活性氧簇，發(fā)生大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物損傷，證實(shí)了高血壓大鼠進(jìn)行高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)內(nèi)皮功能紊亂是由于過(guò)氧化物的產(chǎn)生，而抗氧化物酶不足以清除大量氧化代謝產(chǎn)物，氧化應(yīng)激水平嚴(yán)重。從離體血管功能性檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)向離體血管環(huán)浴槽中加入NAD(P)H抑制劑Apocynin，比較各組加藥前后ACh誘發(fā)最大內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張，評(píng)價(jià)各組氧化應(yīng)激在調(diào)控內(nèi)皮功能中的貢獻(xiàn)程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：加入Apocynin后，各組ACh誘發(fā)血管舒張均不存在顯著性差異，說(shuō)明各組ACh誘發(fā)最大內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張存在的差異源自氧化應(yīng)激的作用，這與Fernanada研究冠狀動(dòng)脈在NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin作用下內(nèi)皮依賴(lài)性最大舒張水平相似[32]。其中，SHR-H加入Apocynin前后對(duì)應(yīng)的ACh誘發(fā)血管最大內(nèi)皮依賴(lài)性舒張之間具有顯著性差異，說(shuō)明了高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成高血壓組內(nèi)皮功能紊亂主要與氧化產(chǎn)物大量蓄積有關(guān)，即SHR-H內(nèi)皮功能下降主要是因?yàn)檠趸瘧?yīng)激水平的增加。相反，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的高血壓大鼠減少血清氧化應(yīng)激水平，在內(nèi)皮舒張功能性的檢測(cè)中表現(xiàn)出SHR-M組改善了高血壓誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能紊亂，加入抑制劑Apocynin前后對(duì)應(yīng)的血管最大舒張百分比不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平影響內(nèi)皮舒張功能。

4 結(jié)論

不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度調(diào)控高血壓誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能紊亂，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)通過(guò)下調(diào)氧化應(yīng)激水平達(dá)到增加內(nèi)皮功能的效果，而高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)增加氧化應(yīng)激水平，加劇了高血壓大鼠血管內(nèi)皮功能障礙。

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Oxidative Stress Mechanisms of Treadmill with Different Intensity on Endothelial Function and Ultrastructure in Spontaneously Hypertensive Rats

YE Fang,BAI Ping,ZENG Fan-xing,SHI Li-jun

Objective:To investigate the effects of treadmill exercise with different intensity on spontaneously hypertensive rats’endothelial function and ultrastructure.Methods:Three-month-old male SHR and WKY were randomly assigned to six groups:sedentary control group (SHR-C,WKY-C),moderate-intensity exercise group (SHR-M,WKY-M),and high-intensity exercise group (SHR-H,SHR-H).The animals in the exercise-trained groups ran on a motor treadmill (0° slope) at 18～20 m/min (～55～65% of the maximal aerobic velocity) and 26～28m/min (～75～85% of the maximal aerobic velocity),respectively.Each exercise-trained group ran 60 min per day,5 days per week for 8 weeks.Blood pressure examined by non-invasive methods,endothelial ultrastructure observed by transmission electron microscope,tension test to isolated vessel ring measured by DMT,protein determined by western blotting and detection for enzyme activity.Result:1)Systolic pressureand diastolic pressure in SHR-M were much lower than in SHR-C,and SHR-H significantly different from SHR-C(P<0.05).2)Oxidative product MDA demonstrated that compared to MDA in WKY-C,SHR-C had the trend to rise,but no significant difference.SHR-H were significantly higher than SHR-M (P<0.05).Antioxidant enzymes including GSH-Px,SOD demonstrated that GSH-Px in SHR-C were lower in comparison with WKY-C,GSH-Px in SHR-H and SHR-M were significantly higher compared to SHR-C (P<0.05);SOD in WKY-M were significantly higher than in WKY-C (P<0.05),SOD in SHR exercise-trained groups had no significant difference compared to SHR-C(P<0.05).3)Transmission electron microscope in SHR-C and SHR-H showed that endothelial cells’ malformation,collagen proliferation.However,SHR-M showed the intact of endothelial cells.4)Endothelial-dependent vasodilator function in SHR-C was strikingly lower in comparison with WKY-C,SHR-M ameliorated endothelium-dependent dilation dysfunction induced by hypertension;However,endothelial-dependent dilation was apparently decreased in SHR-H compared to SHR-C (P<0.05).Conclusion:Moderate-intensity exercise can reduce the SHR blood pressure,ameliorate endothelial function and ultrastructure.Whereas high-intensity exercise has an opposite effect that the increase of oxidative stress and the disorder of endothelium dependent dilation.

exerciseintensity;hypertension;endothelium;oxidativestress

1000-677X(2016)12-0058-09

10.16469/j.css.201612008

2016-09-20；

2016-12-05

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)基金資助(2015ZD008)；國(guó)家體育總局科研課題(2015B035)。

葉芳(1991-)，女，安徽人，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)和心血管生理學(xué),E-mail:15600612858@163.com。

北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)與體質(zhì)健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084 Beijing Sport University,Beijing 100084，China.

G804.7

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